Intervenção Tuina em Modelo de Osteoartrite de Joelho Induzida por Injeção de Monoiodoacetato de Sódio em Rato

Resumo

Este protocolo descreve os métodos de intervenção de Tuina em modelo de osteoartrite de joelho (KOA) induzido por injeção de monoiodoacetato de sódio em ratos, que fornece uma referência para a aplicação de Tuina em modelos animais de OA. Este protocolo também estuda o mecanismo efetivo de Tuina para KOA, e os resultados ajudarão a promover sua aplicação.

Resumo

A osteoartrite do joelho (OA), uma doença articular degenerativa comum, é caracterizada por dor crônica e incapacidade, que podem evoluir para danos estruturais irreparáveis da articulação. Investigações sobre a ligação entre cartilagem articular, músculos, sinóvia e outros tecidos ao redor da articulação do joelho na OA são de grande importância. Atualmente, o manejo da OA inclui modificações no estilo de vida, exercícios, medicamentos e intervenções cirúrgicas; no entanto, a elucidação dos intrincados mecanismos subjacentes à dor relacionada à OA ainda é escassa. Consequentemente, a dor em OA de joelho continua sendo um desafio clínico fundamental e uma prioridade terapêutica. Tuina foi encontrado para ter um efeito regulador sobre os sistemas motor, imunológico, e endócrino, levando a exploração de se Tuina poderia aliviar os sintomas de KOA, causados pela upregulation de fatores inflamatórios, e ainda, se os fatores inflamatórios no músculo esquelético podem aumentar a progressão de KOA.

Foram randomizados 32 ratos machos Sprague Dawley (SD) (180-220 g) em quatro grupos de oito animais cada: antiPD-L1+Tuina (grupo A), modelo (grupo B), Tuina (grupo C) e cirurgia simulada (grupo D). Para os grupos A, B e C, injetamos 25 μL de solução de monoiodoacetato de sódio (MIA) (4 mg de MIA diluídos em 25 μL de solução salina estéril) na cavidade articular do joelho direito e, para o grupo D, a mesma quantidade de soro fisiológico estéril foi injetada. Todos os grupos foram avaliados por meio de testes de menor a maior estresse (limiar mecânico de retirada da pata, latência térmica de retirada da pata, edema da articulação do joelho direito, escore de Lequesne MG, temperatura cutânea) antes da injeção e 2, 9 e 16 dias após a injeção.

Introdução

A osteoartrite do joelho (OA) é uma osteoartrite degenerativa comum, caracterizada por dor crônica e incapacidade, e a OA relativamente grave levará a danos estruturais irreversíveis na articulação¹. A alta prevalência global de OA de joelho tornou-se um grande desafio de saúde pública mundial ^2,3, o que prejudica seriamente a qualidade de vida dos pacientes ^4,5. Estudos mostram que a OA afeta mais de 260 milhões de pessoas em todo o mundo⁶. Com o envelhecimento da população, a taxa de prevalência total de OA na China chega a 17,0% acima dos 40 anos, o que sobrecarrega as famílias das pessoas afetadas ^7,8.

De acordo com a medicina chinesa, a OA pertence à categoria de "paralisia"⁹, e o Clássico de Medicina Interna do Imperador Amarelo associa tendões, ossos e carne à paralisia. Assim, precisamos prestar atenção à conexão entre a cartilagem, músculo, sinóvia, bem como outros tecidos ao redor da articulação do joelho na OA. Na medicina moderna, tanto a inflamação muscular quanto a óssea, que são os principais componentes da homeostase imunológica da artrite, impulsionam a progressão da dor por KOA. No entanto, a maioria dos estudos se concentra na inflamação da cartilagem e na inflamação sinovial nas articulações ósseas, e há uma escassez de artigos examinando fenômenos inflamatórios na musculatura esquelética. Portanto, mais pesquisas sobre o papel do músculo esquelético na inflamação são necessárias para obter uma compreensão mais abrangente da OA e fornecer ideias para modalidades de tratamento mais eficazes. Em uma revisão da literatura, observamos que a inibição do fator imuno-relacionado ao ligante de morte programada 1 (PD-L1) exacerbou a progressão da OA^10,11 e que houve expressão diferencial de IL-15 e FOXO1 no músculo esquelético de pacientes com OA ^12, bem como inflamação muscular esquelética significativa em pacientes com OA terminal o que também esteve associado a alterações na marcha. Tem sido demonstrado que o músculo esquelético também pode secretar fatores intimamente relacionados à imunidade inflamatória, como a IL-6, e que o TNF-α também está intimamente relacionado à via PD-L1 e à OA^13,14,15.

Atualmente, os tratamentos disponíveis para OA incluem controle de peso, exercícios, medicação e cirurgia, que geralmente incluem injeções intra-articulares, medicação analgésica, cirurgia artroscópica e osteotomia periprotética do joelho¹⁶. Atualmente, a progressão da doença de OA não pode ser completamente interrompida ou revertida e, sem uma compreensão clara dos complexos mecanismos subjacentes à dor em OQ, os pacientes com OA estão em risco de uso excessivo de medicamentos analgésicos e alta incidência de efeitos colaterais⁸. A maioria das estratégias de tratamento é eficaz apenas por curtos períodos e se concentra apenas no alívio temporário dos sintomas e não na patogênese da doença. Portanto, a dor em OA permanece uma prioridade e um desafio para o tratamento, representando um sério desafio clínico. No entanto, Tuina pode estimular diretamente os músculos esqueléticos ao redor da articulação afetada no tratamento com KOA e pode fornecer alguns benefícios. Combinado com a descrição anterior, é a terapia ideal para estudar o papel do tecido muscular esquelético na OA de joelhos, e esclarecer o papel do tecido muscular esquelético na inflamação também pode fornecer melhor suporte teórico para Tuina de OA.

Estudos têm demonstrado que a massoterapia, a terapia manipulativa osteopática e a manipulação da coluna vertebral podem ajudar a aliviar a dor e restaurar a função corporal^17,18. Essas manipulações podem atuar na inflamação local e aliviar espasmos e analgesia por meio de ação mecânica externa. Podem aliviar a dor após artroplastia total do joelho, reduzir o uso de analgésicos, promover a recuperação pós-operatória e melhorar o equilíbrio biomecânico¹⁹. A massagem sueca é viável no tratamento da osteoartrite e pode reduzir o estresse e melhorar a qualidade de vida²⁰. O efeito terapêutico de Tuina sobre a OA foi precedido por alguns estudos.

Neste experimento, nossa equipe explorará se a expressão de PD-L1 e fatores inflamatórios relacionados no músculo esquelético podem induzir KOA e promover seu desenvolvimento com base no modelo de KOA induzido por MIA em ratos. Tuina também será implementado para ver se pode aliviar os sintomas de KOA causados pelo aumento da expressão do fator inflamatório. Tuina será combinada com inibição de PD-L1 para demonstrar a associação entre a via PD-1 mediada por Tuina na inflamação do músculo esquelético que afeta o desenvolvimento de OA e dor, lançando as bases para estudos multiníveis adicionais sobre os mecanismos terapêuticos da intervenção de Tuina em OA.

Em resumo, este artigo descreve a investigação e elaboração dos mecanismos de inflamação do músculo esquelético no desenvolvimento de OA e sua dor, bem como os efeitos terapêuticos de Tuina sobre OA, sob a perspectiva da expressão de fatores imune-inflamatórios, combinados com indicadores comportamentais, para fornecer evidências modernas de pesquisa para a teoria do "desequilíbrio de tendão e osso" na medicina tradicional chinesa.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados e supervisionados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (número de aprovação: SYXK2018-0040), que está em conformidade com as estipulações na Declaração de Helsinque da Associação Médica Mundial.

1. Preparo dos animais

1. Casa 32 Ratos machos Sprague Dawley (SD) com 8 semanas de idade e pesando 180-220 g em um aparelho de alojamento específico livre de patógenos sob ciclos de 12 h claro/12 h escuro a 24 ± 2 °C e 60% de umidade com uma dieta padrão de pellets de roedores. Todas as operações experimentais em animais cumprem a ética do bem-estar dos animais de experimentação e os regulamentos de segurança da experimentação animal.
2. Randomizar e agrupar ratos em quatro grupos de oito animais cada após 1 semana de alimentação adaptativa: antiPD-L1+Tuina (grupo A), modelo (grupo B), Tuina (grupo C) e cirurgia simulada (grupo D).

2. Injeção intra-articular de iodoacetato monossódico (MIA) no joelho

OBS: Com exceção do grupo D, o modelo de KOA em ratos será preparado pela injeção de MIA na cavidade articular do joelho em todos os grupos. Para o grupo D, injetar 25 μL de solução fisiológica estéril na cavidade articular do joelho direito.

1. Anestesiar o rato colocando-o em gaiola anestésica e, em seguida, introduzindo isoflurano a 2,5% até que esteja totalmente anestesiado. Confirme se o animal está totalmente anestesiado aguardando o ponto em que o rato jovem está deitado de costas, seus membros param de se mover e não há resposta na pinça dos dedos dos pés (reflexo pedal), reflexo palpebral e relaxamento muscular.
2. Adicione pomada para os olhos e colírios aos ratos jovens anestesiados para evitar o ressecamento dos olhos.
3. Raspar o membro posterior direito dos ratos e desinfetar a articulação do joelho com três rodadas alternadas de iodóforo e etanol 75%.
4. Para manter uma condição experimental padronizada, fixe cuidadosamente a flexão do joelho em um ângulo preciso de 90°, garantindo que o ligamento patelar esteja orientado para cima. Em seguida, injetar 25 μL de solução de MIA, consistindo de 4 mg de MIA diluídos em 25 μL de solução salina estéril na cavidade articular do joelho direito dos ratos.
   OBS: Esta injeção foi realizada com microinjetor especializado, garantindo precisão e consistência no procedimento^21,22,23. Coloque os ratos de volta nas gaiolas até que eles acordem. O animal que passou por cirurgia não é devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
5. No final do estudo, eutanasiar os ratos injetando 1% de pentobarbital sódico como uma dose de 100 mg/kg.

3. Implementação de Tuina

NOTA: A implementação de Tuina será guiada pela teoria de que "para pacientes com desequilíbrio tendíneo e ósseo, os tendões precisam ser tratados primeiro". Ambos os grupos A e B iniciaram a intervenção no primeiro dia após a avaliação bem-sucedida do modelo, e ambos os grupos foram operados uma vez ao dia durante 14 dias. Os dois grupos restantes foram observados apenas por 14 dias sem qualquer intervenção. Os operadores da manipulação devem ser rigorosamente treinados antes do experimento para garantir a consistência da força, frequência e ritmo.

1. Localizar com precisão o ponto de acupuntura do rato, incluindo EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 e GB34 (Figura 1 e Tabela 1), onde serão realizados métodos de amassamento dos dedos utilizando a Acupuntura Experimental²⁴.
2. Fixe o rato em decúbito ventral no equipamento de fixação do rato.
3. Após o silêncio e relaxamento dos membros inferiores, amassar o EX-LE4 e o ST35 do membro afetado com o polegar e o indicador simultaneamente por 4 min a 120-140 vezes/min.
4. Amassar os músculos anterior e médio-lateral do membro afetado com o polegar e o indicador por 3 min a 120-140 vezes/min, focando o SP10, ST34 e os músculos próximos à articulação do joelho. Enfatize a manipulação desses músculos rígidos com uma intensidade para que o rato não lute.
5. Amasse os músculos da panturrilha posterior do membro afetado de cima para baixo por 3 min a 120-140 vezes/min usando o polegar, o indicador e o dedo médio. Para expor totalmente a área de tratamento, use o dedo anelar e o dedo mínimo para segurar a articulação do tornozelo do membro afetado e puxe suavemente o membro afetado. Concentre-se no SP9, GB34 e nos músculos próximos à articulação do joelho com ênfase nos músculos rígidos e na intensidade para que o rato não tenha dificuldades.

4. Mensuração do índice comportamental

1. Mensuração do limiar mecânico plantar de dor
   NOTA: Medir os limiares de dor mecânica plantar 1 dia antes da injeção de MIA, bem como 2, 9 e 16 dias após a injeção.
   1. Levar os ratos para uma sala de teste plantar com um fundo de grade de aço inoxidável e um corpo de gaiola de plástico em um ambiente silencioso à temperatura ambiente (22 ± 2) °C por 30 min de adaptação.
   2. Utilizar um analgésico mecânico eletrônico com uma agulha plástica de 0,8 mm de diâmetro para estimular verticalmente a área central do retropé direito dos ratos. Aumentar uniforme e gradualmente a intensidade da estimulação até que os ratos apresentem reações de retração e evitação da pata.
   3. Registrar a leitura da tela eletrônica como limiar mecânico de dor do pé plantar direito do rato.
   4. Meça cada rato 5x em intervalos de 5 min.
   5. Remova os valores máximo e mínimo dos cinco valores. Tome-se como resultado o valor médio dos três valores médios pelo método da média aparada (Tabela 2).
2. Mensuração do limiar de retirada mecânica da pata
   NOTA: Medir o limiar de retirada mecânica da pata 1 dia antes da injeção de MIA, 2, 9 e 16 dias após a injeção.
   1. Levar os ratos para uma sala de ensaio plantar aquecida com um fundo de vidro a 30 °C e um corpo de gaiola de plástico num ambiente silencioso à temperatura ambiente (22 ± 2) °C durante 30 minutos de adaptação.
   2. Estimular a área central plantar posterior direita com um dispositivo de aquecimento da fonte de luz a uma temperatura de estimulação de 65 °C até que o rato mostre uma resposta de retração e evitação da pata.
   3. Registrar o tempo de leitura da tela eletrônica como limiar de dor térmica plantar direito do rato.
   4. Meça cada rato 5x continuamente em intervalos de 5 min.
   5. Remova os valores máximo e mínimo dos cinco valores. Tome-se como resultado o valor médio dos três valores médios pelo método da média aparada (Tabela 3).

5. Medição do inchaço da articulação do joelho direito

NOTA: Medir o inchaço da articulação do joelho direito de ratos 1 dia antes da injeção de MIA, 2, 9 e 16 dias após a injeção.

1. Anestesiar o rato colocando-o em gaiola anestésica e expondo-o ao isoflurano a 2,5% até que esteja totalmente anestesiado.
2. Coloque o rato em uma posição plana na mesa de operação.
3. Medir a largura da articulação do joelho direito com paquímetro vernier (Figura 2 e Tabela 4).

6. Mensuração do escore de Lequesne MG

NOTA: Medir o escore de Lequesne MG em ratos aos 2, 9 e 16 dias após a injeção de MIA. Lequesne et al desenvolveram um índice de gravidade para osteoartrite do quadril (ISH), que pode ser usado para avaliar a efetividade de intervenções terapêuticas. Consideramos quatro parâmetros: estimulação da dor, alteração da marcha, mobilidade articular e edema articular.

1. Levar os ratos para uma plataforma de manipulação num ambiente silencioso à temperatura ambiente (22 ± 2) °C.
2. Peça a dois operadores, cegos um para o outro, que meçam a resposta local ao estímulo da dor, a mudança da marcha, o movimento articular e o inchaço articular.
   1. Estimular a face lateral da articulação do joelho direito com uma agulha plástica de teste e pontuar em uma escala de 0 a 3 de acordo com a resposta. 0 sem resposta; 3 uma boa resposta; 1 contração do membro afetado; 2 contração e espasmo do membro afetado, acompanhados de reações generalizadas leves, como tremores, lambeduras e sucção.
   2. Coloque o rato sobre a mesa de operação e observe a marcha de seus membros posteriores direitos. Escore em uma escala de 0 a 3 de acordo com a resposta. 0 ausência de perturbação no movimento do membro afetado, corrida normal e trabalho forte dos pés; 3 o membro afetado não pode participar da marcha, tocar o solo ou pisar no chão; 1 caminhada leve durante a corrida com pisadas fortes; 2 O membro afetado participa da marcha, mas o distúrbio no movimento dos ratos (trekking) é evidente.
   3. Flexionar e estender a articulação do joelho direito do rato com a mão e observar a mobilidade articular. Escore em uma escala de 0 a 3 de acordo com a resposta. 0 ângulo de mobilidade articular superior a 90°; 3 ângulo de mobilidade articular inferior a 15°; 1 ângulo de mobilidade articular ou 45°-90°; 2 ângulo de mobilidade articular de 15°-45°.
   4. Toque a articulação do joelho direito do rato e compare a resposta com a de um rato normal. Pontuação em uma escala de 0 a 2 de acordo com a resposta. 0 sem inchaço óbvio e marcas ósseas visíveis; 2 edema acentuado e sem marcas ósseas; 1 inchaço leve e marcas ósseas superficiais.
   5. Adicione esses escores para produzir o escore de Lequesne MG para cada rato e calcular o valor médio através do método trimmed (Tabela 5).

7. Medição da temperatura cutânea

NOTA: Medir a temperatura da pele 1 dia antes da injeção de MIA e 9 e 16 dias após a injeção.

1. Anestesiar o rato colocando-o em uma gaiola anestésica e, em seguida, introduzindo isoflurano até que esteja totalmente anestesiado.
2. Colocar o rato numa posição lateral na mesa de operações, à temperatura ambiente (22 ± 2) °C.
3. Endireitar a articulação do joelho direito segurando suavemente o pé com a mão. Fotografe para determinar a temperatura da pele usando uma câmera infravermelha Filr.
4. Leia a temperatura da pele da articulação do joelho e ao redor da articulação do joelho do rato usando um software de edição de apoio. Defina pontos de controle na articulação do tornozelo e na articulação do joelho, onde a temperatura diminui gradualmente.

8. Análise estatística

1. Utilizar software estatístico para expressar os dados experimentais em quartis.
2. Use o método trim mean para lidar com os outliers. Os resultados dos testes comportamentais são anotados como a média ± o erro padrão da média.
3. Realizar teste t para amostras independentes para comparação entre os grupos. Analisar os dados comportamentais por meio de uma análise de variância (ANOVA) bidirecional para medidas repetidas, seguida do teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Quando os dados não apresentarem normalidade ou homocedasticidade, realizar um teste não paramétrico (amostras k de Kruskal-Wallis).
   NOTA: P < 0,05 indica que as diferenças são estatisticamente significativas. Todos os dados atendem aos pressupostos dos testes estatísticos aplicados.

Resultados

O protocolo descrito foi implementado em um ambiente clínico no Yueyang Hospital de Medicina Tradicional Integrada Chinesa e Ocidental. A Figura 1 mostra a localização exata dos acupontos empurrados em ratos, e a Tabela 1 ilustra os benefícios comuns da estimulação desses pontos. A Tabela 2 e a Tabela 3 oferecem evidências convincentes de alívio notável da dor obtido com a terapia com Tuina, mesmo na ausência de inibição da via P...

Discussão

Este estudo tem como objetivo avaliar a melhora da NOA após a intervenção de Tuina utilizando indicadores comportamentais padronizados e investigar os mecanismos de Tuina para OA e a associação entre músculo esquelético e OA. Ao contrário das terapias farmacológicas e cirúrgicas, Tuina tem um efeito regulatório positivo sobre os sistemas motor, imunológico e endócrino. Tuina pode aliviar a inflamação e dor produzida pela doença, agindo em diferentes alvos. Por exemplo, ao regular a via TLR4 e o miRNA, pod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390