Intervento di Tuina nel modello di ratto indotto dall'iniezione di monoiodoacetato di sodio di osteoartrite del ginocchio

Riepilogo

Questo protocollo descrive i metodi di intervento di Tuina nel modello di ratto di osteoartrite del ginocchio (KOA) indotto dall'iniezione di monoiodoacetato di sodio, che fornisce un riferimento per l'applicazione di Tuina in modelli animali di KOA. Questo protocollo studia anche il meccanismo efficace di Tuina per KOA e i risultati contribuiranno a promuoverne l'applicazione.

Abstract

L'artrosi del ginocchio (KOA), una comune malattia degenerativa delle articolazioni, è caratterizzata da dolore cronico e disabilità, che possono progredire fino a danni strutturali irreparabili dell'articolazione. Le indagini sul legame tra cartilagine articolare, muscoli, sinovia e altri tessuti che circondano l'articolazione del ginocchio in KOA sono di grande importanza. Attualmente, la gestione del KOA include modifiche dello stile di vita, esercizio fisico, farmaci e interventi chirurgici; tuttavia, manca ancora la delucidazione degli intricati meccanismi alla base del dolore correlato al KOA. Di conseguenza, il dolore da KOA rimane una sfida clinica chiave e una priorità terapeutica. È stato scoperto che Tuina ha un effetto regolatore sul sistema motorio, immunitario ed endocrino, spingendo l'esplorazione della possibilità che Tuina possa alleviare i sintomi del KOA, causati dalla sovraregolazione dei fattori infiammatori, e ulteriormente, se i fattori infiammatori nel muscolo scheletrico possono aumentare la progressione del KOA.

Sono stati randomizzati 32 ratti maschi di Sprague Dawley (SD) (180-220 g) in quattro gruppi di otto animali ciascuno: antiPD-L1 + Tuina (gruppo A), modello (gruppo B), Tuina (gruppo C) e chirurgia fittizia (gruppo D). Per i gruppi A, B e C, abbiamo iniettato 25 μL di soluzione di monoiodoacetato di sodio (MIA) (4 mg di MIA diluiti in 25 μL di soluzione salina sterile) nella cavità dell'articolazione del ginocchio destro e per il gruppo D, è stata iniettata la stessa quantità di soluzione fisiologica sterile. Tutti i gruppi sono stati valutati utilizzando i test meno stressanti (soglia di ritiro meccanico della zampa, latenza termica di ritiro della zampa, gonfiore dell'articolazione del ginocchio destro, punteggio Lequesne MG, temperatura cutanea) prima dell'iniezione e 2, 9 e 16 giorni dopo l'iniezione.

Introduzione

L'artrosi del ginocchio (KOA) è un'artrosi degenerativa comune, caratterizzata da dolore cronico e disabilità, e la KOA relativamente grave porterà a danni strutturali irreversibili all'articolazione¹. L'elevata prevalenza globale di KOA è diventata una delle principali sfide per la salute pubblica globale ^2,3, che compromette seriamente la qualità della vita dei pazienti ^4,5. Gli studi hanno dimostrato che la KOA colpisce più di 260 milioni di persone in tutto il mondo⁶. Con l'invecchiamento della popolazione, il tasso di prevalenza totale di KOA in Cina raggiunge il 17,0% oltre i 40 anni, il che rappresenta un pesante onere per le famiglie delle^{persone colpite}.

Secondo la medicina cinese, il KOA appartiene alla categoria della "paralisi"⁹ e il Classico di Medicina Interna dell'Imperatore Giallo associa tendini, ossa e carne alla paralisi. Quindi, dobbiamo prestare attenzione alla connessione tra la cartilagine, il muscolo, la sinovia e altri tessuti intorno all'articolazione del ginocchio in KOA. Nella medicina moderna, sia l'infiammazione muscolare che quella ossea, che sono componenti principali dell'omeostasi immunitaria dell'artrite, guidano la progressione del dolore da KOA. Tuttavia, la maggior parte degli studi si concentra sull'infiammazione della cartilagine e sull'infiammazione sinoviale nelle articolazioni ossee e c'è una scarsità di articoli che esaminano i fenomeni infiammatori nei muscoli scheletrici. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche sul ruolo del muscolo scheletrico nell'infiammazione per ottenere una comprensione più completa del KOA e fornire idee per modalità di trattamento più efficaci. In una revisione della letteratura, abbiamo scoperto che l'inibizione del ligando di morte programmata del fattore immuno-correlato 1 (PD-L1) ha esacerbato la progressione di KOA^10,11 e che c'era un'espressione differenziale di IL-15 e FOXO1 nel muscolo scheletrico dei pazienti con KOA ^12, così come una significativa infiammazione del muscolo scheletrico nei pazienti con KOA allo stadio terminale. che era anche associato a cambiamenti nell'andatura. È stato dimostrato che il muscolo scheletrico può anche secernere fattori strettamente correlati all'immunità infiammatoria come IL-6 e che il TNF-α è anche strettamente correlato alla via PD-L1 e KOA^13,14,15.

Attualmente, i trattamenti disponibili per KOA includono il controllo del peso, l'esercizio fisico, i farmaci e la chirurgia, che di solito includono iniezioni intra-articolari, farmaci analgesici, chirurgia artroscopica e osteotomia periprotesica del ginocchio¹⁶. Attualmente, la progressione della malattia da KOA non può essere completamente arrestata o invertita e, senza una chiara comprensione dei complessi meccanismi alla base del dolore da KOA, i pazienti con KOA sono a rischio di uso eccessivo di farmaci analgesici e di un'elevata incidenza di effetti collaterali⁸. La maggior parte delle strategie terapeutiche sono efficaci solo per brevi periodi e si concentrano solo sul sollievo temporaneo dei sintomi piuttosto che sulla patogenesi della malattia. Pertanto, il dolore da KOA rimane una priorità e una sfida per il trattamento, ponendo una seria sfida clinica. Tuttavia, Tuina può stimolare direttamente i muscoli scheletrici intorno all'articolazione interessata nel trattamento KOA e può fornire alcuni benefici. In combinazione con la descrizione precedente, è la terapia ideale per studiare il ruolo del tessuto muscolare scheletrico nel KOA e chiarire il ruolo del tessuto muscolare scheletrico nell'infiammazione può anche fornire un migliore supporto teorico per Tuina di KOA.

Gli studi hanno dimostrato che la massoterapia, la terapia manipolativa osteopatica e la manipolazione spinale possono aiutare ad alleviare il dolore e ripristinare la funzione corporea^17,18. Queste manipolazioni possono agire sull'infiammazione locale e alleviare gli spasmi e l'analgesia attraverso un'azione meccanica esterna. Possono alleviare il dolore dopo l'artroplastica totale del ginocchio, ridurre l'uso di farmaci analgesici, promuovere il recupero postoperatorio e migliorare l'equilibrio biomeccanico¹⁹. Il massaggio svedese è fattibile nel trattamento dell'osteoartrite e può ridurre lo stress e migliorare la qualità della vita²⁰. L'effetto terapeutico di Tuina su KOA è stato preceduto da alcuni studi.

In questo esperimento, il nostro team esplorerà se l'espressione di PD-L1 e dei relativi fattori infiammatori nel muscolo scheletrico può indurre KOA e promuoverne lo sviluppo sulla base del modello KOA indotto da MIA nei ratti. Tuina sarà anche implementato per vedere se può alleviare i sintomi di KOA causati dall'aumento dell'espressione del fattore infiammatorio. Tuina sarà combinato con l'inibizione di PD-L1 per dimostrare l'associazione tra la via PD-1 mediata da Tuina nell'infiammazione del muscolo scheletrico che influenza lo sviluppo di KOA e il dolore, gettando le basi per ulteriori studi multilivello sui meccanismi terapeutici dell'intervento di Tuina in KOA.

In sintesi, questo articolo descrive lo studio e l'elaborazione dei meccanismi dell'infiammazione del muscolo scheletrico nello sviluppo del KOA e del suo dolore, nonché gli effetti terapeutici del Tuina sul KOA, dal punto di vista dell'espressione del fattore immuno-infiammatorio, combinato con indicatori comportamentali correlati, per fornire prove di ricerca moderna per la teoria dello "squilibrio di tendini e ossa" nella medicina tradizionale cinese.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati e supervisionati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (numero di approvazione: SYXK2018-0040), che è conforme alle disposizioni della Dichiarazione di Helsinki dell'Associazione Medica Mondiale.

1. Preparazione dell'animale

1. Ospita 32 ratti maschi Sprague Dawley (SD) di età compresa tra 8 settimane e un peso di 180-220 g in uno specifico apparato di stabulazione privo di agenti patogeni con cicli di luce di 12 ore/12 ore di buio a 24 ± 2 °C e 60% di umidità con una dieta standard a base di pellet per roditori. Tutte le operazioni sperimentali sugli animali sono conformi all'etica del benessere degli animali da esperimento e alle norme di sicurezza sugli animali sperimentali.
2. Randomizzare e mettere in gabbia i ratti in quattro gruppi di otto animali ciascuno dopo 1 settimana di alimentazione adattativa: antiPD-L1+Tuina (gruppo A), modello (gruppo B), Tuina (gruppo C) e chirurgia fittizia (gruppo D).

2. Iniezione intra-articolare di iodoacetato monosodico (MIA) nel ginocchio

NOTA: Ad eccezione del gruppo D, il modello di ratto KOA sarà preparato mediante l'iniezione di MIA nella cavità dell'articolazione del ginocchio in tutti i gruppi. Per il gruppo D, iniettare 25 μL di soluzione fisiologica sterile nella cavità articolare del ginocchio destro.

1. Anestetizzare il ratto mettendolo in una gabbia per anestesia e quindi introducendo isoflurano al 2,5% fino a quando non è completamente anestetizzato. Verificare che l'animale sia completamente anestetizzato aspettando il momento in cui il giovane ratto è sdraiato sulla schiena, i suoi arti smettono di muoversi e non c'è risposta nel pizzicamento delle dita dei piedi (riflesso del pedale), nel riflesso palpebrale e nel rilassamento muscolare.
2. Aggiungi unguento per gli occhi e colliri agli anestetizzati, giovani ratti per prevenire la secchezza oculare.
3. Radere l'arto posteriore destro dei ratti e disinfettare l'articolazione del ginocchio con tre cicli alternati di iodoforo ed etanolo al 75%.
4. Per mantenere una condizione sperimentale standardizzata, fissare con cura la flessione del ginocchio con un angolo preciso di 90°, assicurandosi che il legamento rotuleo sia orientato verso l'alto. Successivamente, iniettare 25 μL di soluzione di MIA, costituita da 4 mg di MIA diluiti in 25 μL di soluzione salina sterile, nella cavità articolare del ginocchio destro dei ratti.
   NOTA: Questa iniezione è stata effettuata con un microiniettore specializzato, garantendo precisione e coerenza nella procedura^21,22,23. Rimetti i ratti nelle gabbie finché non si svegliano. L'animale che ha subito un intervento chirurgico non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
5. Alla fine dello studio, sopprimere i ratti iniettando pentobarbital sodico all'1% alla dose di 100 mg/kg.

3. Attuazione di Tuina

NOTA: L'implementazione di Tuina sarà guidata dalla teoria che "per i pazienti con squilibrio tendineo e osseo, i tendini devono essere trattati prima". Entrambi i gruppi A e B hanno iniziato l'intervento il primo giorno dopo la valutazione positiva del modello, ed entrambi i gruppi sono stati operati una volta al giorno per 14 giorni. I restanti due gruppi sono stati osservati solo per 14 giorni senza alcun intervento. Gli operatori della manipolazione devono essere rigorosamente addestrati prima dell'esperimento per garantire la coerenza della forza, della frequenza e del ritmo.

1. Individuare con precisione il punto di agopuntura del ratto, inclusi EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 e GB34 (Figura 1 e Tabella 1), dove verranno eseguiti metodi di impastamento con le dita utilizzando l'agopuntura sperimentale²⁴.
2. Fissare il ratto in posizione prona sull'attrezzatura per la fissazione dei ratti.
3. Dopo che si è calmato e gli arti inferiori sono stati rilassati, impastare l'EX-LE4 e l'ST35 dell'arto interessato con il pollice e l'indice contemporaneamente per 4 minuti a 120-140 volte/min.
4. Impastare i muscoli anteriori e medio-laterali dell'arto interessato con il pollice e l'indice per 3 minuti a 120-140 volte/min, concentrandosi su SP10, ST34 e sui muscoli vicino all'articolazione del ginocchio. Enfatizza la manipolazione di quei muscoli rigidi con un'intensità in modo che il topo non si sforzi.
5. Impastare i muscoli posteriori del polpaccio dell'arto interessato dall'alto verso il basso per 3 minuti a 120-140 volte/min utilizzando il pollice, l'indice e il medio. Per esporre completamente l'area da trattare, utilizzare l'anulare e il mignolo per tenere l'articolazione della caviglia dell'arto interessato e tirare delicatamente l'arto interessato. Concentrati su SP9, GB34 e sui muscoli vicino all'articolazione del ginocchio con enfasi sui muscoli rigidi e sull'intensità in modo che il ratto non faccia fatica.

4. Misurazione dell'indice comportamentale

1. Misurazione della soglia del dolore meccanico plantare
   NOTA: Misurare le soglie del dolore meccanico plantare 1 giorno prima dell'iniezione di MIA e 2, 9 e 16 giorni dopo l'iniezione.
   1. Portare i ratti in una sala di prova plantare con un fondo a griglia in acciaio inossidabile e un corpo a gabbia di plastica in un ambiente tranquillo a temperatura ambiente (22 ± 2) °C per 30 minuti di adattamento.
   2. Utilizzare un antidolorifico meccanico elettronico con un ago di plastica di 0,8 mm di diametro per stimolare verticalmente l'area centrale del retropiede destro dei ratti. Aumentare uniformemente e gradualmente l'intensità della stimolazione fino a quando i ratti mostrano reazioni di retrazione ed evitamento delle zampe.
   3. Registrare la lettura dello schermo elettronico come soglia del dolore meccanico del piede plantare destro del ratto.
   4. Misura ogni ratto 5 volte a intervalli di 5 minuti.
   5. Rimuovere i valori massimo e minimo dai cinque valori. Prendiamo come risultato il valore medio dei tre valori centrali attraverso il metodo della media tagliata (Tabella 2).
2. Misurazione della soglia di ritiro meccanico della zampa
   NOTA: Misurare la soglia di ritiro meccanico della zampa 1 giorno prima dell'iniezione di MIA, 2, 9 e 16 giorni dopo l'iniezione.
   1. Portare i ratti in una sala di prova plantare riscaldata con un fondo di vetro a 30 °C e un corpo a gabbia di plastica in un ambiente tranquillo a temperatura ambiente (22 ± 2) °C per 30 minuti di adattamento.
   2. Stimolare l'area centrale plantare posteriore destra con un dispositivo di riscaldamento della sorgente luminosa a una temperatura di stimolazione di 65 °C fino a quando il ratto non mostra una retrazione della zampa e una risposta di evitamento.
   3. Registrare la lettura del tempo dello schermo elettronico come la giusta soglia del dolore termico plantare del ratto.
   4. Misurare ogni ratto 5 volte continuamente a intervalli di 5 minuti.
   5. Rimuovere i valori massimo e minimo dai cinque valori. Prendiamo come risultato il valore medio dei tre valori centrali attraverso il metodo della media tagliata (Tabella 3).

5. Misurazione del gonfiore dell'articolazione del ginocchio destro

NOTA: Misurare il gonfiore dell'articolazione del ginocchio destro dei ratti 1 giorno prima dell'iniezione di MIA, 2, 9 e 16 giorni dopo l'iniezione.

1. Anestetizzare il ratto mettendolo in una gabbia anestetica ed esponendolo al 2,5% di isoflurano fino a quando non è completamente anestetizzato.
2. Posizionare il ratto in posizione orizzontale sul tavolo operatorio.
3. Misurare la larghezza dell'articolazione del ginocchio destro con calibri a corsoio (Figura 2 e Tabella 4).

6. Misurazione del punteggio Lequesne MG

NOTA: Misurare il punteggio di Lequesne MG nei ratti a 2, 9 e 16 giorni dopo l'iniezione di MIA. Lequesne et al. hanno sviluppato un indice di gravità per l'osteoartrite dell'anca (ISH), che può essere utilizzato per valutare l'efficacia degli interventi terapeutici. Consideriamo quattro parametri: stimolazione del dolore, cambiamento dell'andatura, mobilità articolare e gonfiore articolare.

1. Portare i ratti su una piattaforma di manipolazione in un ambiente tranquillo a temperatura ambiente (22 ± 2) °C.
2. Chiedi a due operatori, ciechi l'uno rispetto all'altro, di misurare la risposta alla stimolazione del dolore locale, il cambiamento dell'andatura, il movimento articolare e il gonfiore articolare.
   1. Stimola il lato laterale dell'articolazione del ginocchio destro con un ago di plastica e assegna un punteggio su una scala da 0 a 3 in base alla risposta. 0 nessuna risposta; 3 una buona risposta; 1 contrazione dell'arto interessato; 2 contrazione e spasmo dell'arto colpito, accompagnati da lievi reazioni generalizzate, come tremore, leccamento e suzione.
   2. Posizionare il ratto sul tavolo operatorio e osservare l'andatura degli arti posteriori destri. Assegna un punteggio su una scala da 0 a 3 in base alla risposta. 0 nessun disturbo nel movimento dell'arto colpito, corsa normale e forte gioco di gambe; 3 l'arto colpito non può camminare, toccare il suolo o calpestare il suolo; 1 trekking leggero durante la corsa con forti calpesti; 2 L'arto colpito partecipa alla deambulazione, ma il disturbo nel movimento dei ratti (trekking) è evidente.
   3. Flettere ed estendere l'articolazione del ginocchio destro del ratto con la mano e osservare la mobilità articolare. Assegna un punteggio su una scala da 0 a 3 in base alla risposta. 0 angolo di mobilità articolare superiore a 90°; 3 angolo di mobilità articolare inferiore a 15°; 1 angolo di mobilità articolare o 45°-90°; 2 angolo di mobilità articolare di 15°-45°.
   4. Tocca l'articolazione del ginocchio destro del ratto e confronta la risposta con quella di un ratto normale. Assegna un punteggio su una scala da 0 a 2 in base alla risposta. 0 nessun gonfiore evidente e segni ossei visibili; 2 gonfiore marcato e nessun segno osseo; 1 lieve gonfiore e macchie ossee superficiali.
   5. Sommare questi punteggi per produrre il punteggio Lequesne MG per ciascun ratto e calcolare il valore medio attraverso il metodo tagliato (Tabella 5).

7. Misurazione della temperatura cutanea

NOTA: Misurare la temperatura cutanea 1 giorno prima dell'iniezione di MIA e 9 e 16 giorni dopo l'iniezione.

1. Anestetizzare il ratto mettendolo in una gabbia per anestesia e quindi introducendo isoflurano fino a quando non è completamente anestetizzato.
2. Posizionare il ratto in posizione laterale sul tavolo operatorio, a temperatura ambiente (22 ± 2) °C.
3. Raddrizzare l'articolazione del ginocchio destro afferrando delicatamente il piede con la mano. Fotografare per determinare la temperatura della pelle utilizzando una telecamera a infrarossi Filr.
4. Leggi la temperatura della pelle dell'articolazione del ginocchio e intorno all'articolazione del ginocchio del ratto utilizzando un software di editing di supporto. Impostare i punti di controllo sull'articolazione della caviglia e sull'articolazione del ginocchio in cui la temperatura diminuisce gradualmente.

8. Analisi statistica

1. Utilizzare un software statistico per esprimere i dati sperimentali in quartili.
2. Utilizzare il metodo trim mean per gestire i valori anomali. I risultati dei test comportamentali sono indicati come media ± errore standard della media.
3. Eseguire il test t dei campioni indipendenti per il confronto tra i gruppi. Analizza i dati comportamentali utilizzando un'analisi della varianza a misure ripetute a due vie (ANOVA), seguita da test di confronto multipli di Bonferroni. Se i dati non mostrano normalità o omoschedasticità, eseguire un test non parametrico (campioni di Kruskal-Wallis k).
   NOTA: P < 0,05 indica che le differenze sono statisticamente significative. Tutti i dati soddisfano i presupposti dei test statistici che vengono applicati.

Risultati

Il protocollo descritto è stato implementato in un contesto clinico presso l'Ospedale Yueyang di Medicina Tradizionale Tradizionale Cinese e Occidentale Integrata. La Figura 1 mostra l'esatta posizione dei punti di agopuntura spinti nei ratti e la Tabella 1 illustra i benefici comuni della stimolazione di questi punti. La Tabella 2 e la Tabella 3 offrono prove convincenti di un notevole sollievo dal dolore ottenuto attraverso la terapia con...

Discussione

Questo studio ha lo scopo di valutare il miglioramento del KOA dopo l'intervento di Tuina utilizzando indicatori comportamentali standardizzati e di indagare i meccanismi di Tuina per il KOA e l'associazione tra muscolo scheletrico e KOA. A differenza delle terapie farmacologiche e chirurgiche, Tuina ha un effetto regolatore positivo sul sistema motorio, immunitario ed endocrino. Tuina può alleviare l'infiammazione e il dolore prodotti dalla malattia agendo su diversi obiettivi. Ad esempio, regolando la via TLR4 e il mi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390