Intervention de Tuina dans le modèle d’arthrose du genou induit par injection de monoiodoacétate de sodium chez le rat

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes d’intervention de Tuina dans le modèle d’arthrose du genou (KOA) induit par l’injection de monoiodoacétate de sodium chez le rat, qui fournit une référence pour l’application de Tuina dans des modèles animaux KOA. Ce protocole étudie également le mécanisme efficace du Tuina pour le KOA, et les résultats aideront à promouvoir son application.

Résumé

L’arthrose du genou (KOA), un trouble articulaire dégénératif courant, se caractérise par des douleurs chroniques et une invalidité, qui peuvent évoluer vers des dommages structurels irréparables de l’articulation. Les recherches sur le lien entre le cartilage articulaire, les muscles, la synoviale et d’autres tissus entourant l’articulation du genou dans le KOA sont d’une grande importance. À l’heure actuelle, la prise en charge de l’AOS comprend des modifications du mode de vie, de l’exercice, des médicaments et des interventions chirurgicales ; cependant, l’élucidation des mécanismes complexes sous-jacents à la douleur liée au KOA fait encore défaut. Par conséquent, la douleur KOA reste un défi clinique majeur et une priorité thérapeutique. Il a été constaté que le Tuina a un effet régulateur sur les systèmes moteur, immunitaire et endocrinien, ce qui a incité à explorer si le Tuina pourrait soulager les symptômes du KOA, causés par la régulation à la hausse des facteurs inflammatoires, et en outre, si les facteurs inflammatoires dans le muscle squelettique peuvent augmenter la progression du KOA.

Nous avons randomisé 32 rats mâles Sprague Dawley (SD) (180-220 g) en quatre groupes de huit animaux chacun : antiPD-L1 + Tuina (groupe A), modèle (groupe B), Tuina (groupe C) et chirurgie fictive (groupe D). Pour les groupes A, B et C, nous avons injecté 25 μL de solution de monoiodoacétate de sodium (MIA) (4 mg d’IMA dilués dans 25 μL de solution saline stérile) dans la cavité articulaire du genou droit, et pour le groupe D, la même quantité de solution saline physiologique stérile a été injectée. Tous les groupes ont été évalués à l’aide de tests les moins stressants à les plus stressants (seuil de retrait mécanique de la patte, latence thermique du retrait de la patte, gonflement de l’articulation du genou droit, score de Lequesne MG, température de la peau) avant l’injection et 2, 9 et 16 jours après l’injection.

Introduction

L’arthrose du genou (KOA) est une arthrose dégénérative courante, caractérisée par des douleurs chroniques et une invalidité, et une KOA relativement sévère entraînera des dommages structurels irréversibles à l’articulation¹. La forte prévalence mondiale de l’AOC est devenue un défi majeur de santé publique mondiale ^2,3, qui altère gravement la qualité de vie des patients ^4,5. Des études ont montré que le KOA touche plus de 260 millions de personnes dans le monde⁶. Avec le vieillissement de la population, le taux de prévalence total de l’AOC en Chine atteint 17,0 % chez les personnes âgées de plus de 40 ans, ce qui fait peser un lourd fardeau sur les familles des personnes touchées ^7,8.

Selon la médecine chinoise, le KOA appartient à la catégorie de la « paralysie »⁹, et le Classique de médecine interne de l’Empereur Jaune associe les tendons, les os et la chair à la paralysie. Par conséquent, nous devons faire attention à la connexion entre le cartilage, le muscle, la synoviale, ainsi que d’autres tissus autour de l’articulation du genou dans KOA. En médecine moderne, l’inflammation musculaire et osseuse, qui sont des composants majeurs de l’homéostasie immunitaire de l’arthrite, entraîne la progression de la douleur KOA. Cependant, la plupart des études se concentrent sur l’inflammation du cartilage et l’inflammation synoviale dans les articulations osseuses, et il y a peu d’articles examinant les phénomènes inflammatoires dans les muscles squelettiques. Par conséquent, des recherches supplémentaires sur le rôle du muscle squelettique dans l’inflammation sont nécessaires pour acquérir une compréhension plus complète du KOA et fournir des idées pour des modalités de traitement plus efficaces. Dans une revue de la littérature, nous avons constaté que l’inhibition du ligand de mort programmée du facteur immuno-lié 1 (-L1) exacerbait la progression de KOA^10,11 et qu’il y avait une expression différentielle de l’IL-15 et de FOXO1 dans le muscle squelettique des patients atteints de KOA^12, ainsi qu’une inflammation significative des muscles squelettiques chez les patients atteints de KOA en phase terminale. ce qui a également été associé à des changements dans la démarche. Il a été démontré que le muscle squelettique peut également sécréter des facteurs étroitement liés à l’immunité inflammatoire tels que l’IL-6, et que le TNF-α est également étroitement lié à la voie-L1 et au KOA^13,14,15.

À l’heure actuelle, les traitements disponibles pour le KOA comprennent le contrôle du poids, l’exercice, les médicaments et la chirurgie, qui comprennent généralement des injections intra-articulaires, des médicaments analgésiques, une chirurgie arthroscopique et une ostéotomie périprothétique du genou¹⁶. À l’heure actuelle, la progression de la maladie KOA ne peut pas être complètement arrêtée ou inversée, et sans une compréhension claire des mécanismes complexes sous-jacents à la douleur KOA, les patients KOA risquent de surprendre des médicaments analgésiques et d’avoir une incidence élevée d’effets secondaires⁸. La plupart des stratégies de traitement ne sont efficaces que pendant de courtes périodes et se concentrent uniquement sur le soulagement temporaire des symptômes plutôt que sur la pathogenèse de la maladie. Par conséquent, la douleur KOA reste une priorité et un défi pour le traitement, ce qui pose un sérieux défi clinique. Cependant, le Tuina peut stimuler directement les muscles squelettiques autour de l’articulation touchée dans le traitement KOA et peut offrir certains avantages. Combiné avec la description précédente, c’est la thérapie idéale pour étudier le rôle du tissu musculaire squelettique dans le KOA, et clarifier le rôle du tissu musculaire squelettique dans l’inflammation peut également fournir un meilleur soutien théorique pour Tuina du KOA.

Des études ont montré que la massothérapie, la thérapie manuelle ostéopathique et la manipulation vertébrale peuvent aider à soulager la douleur et à restaurer la fonction corporelle^17,18. Ces manipulations permettent d’agir sur l’inflammation locale et de soulager les spasmes et l’analgésie par une action mécanique externe. Ils peuvent soulager la douleur après une arthroplastie totale du genou, réduire l’utilisation de médicaments analgésiques, favoriser la récupération postopératoire et améliorer l’équilibre biomécanique¹⁹. Le massage suédois est réalisable dans le traitement de l’arthrose et peut réduire le stress et améliorer la qualité de vie²⁰. L’effet thérapeutique du Tuina sur le KOA a été précédé par certaines études.

Dans cette expérience, notre équipe explorera si l’expression de-L1 et des facteurs inflammatoires associés dans le muscle squelettique peut induire le KOA et favoriser son développement en se basant sur le modèle KOA induit par le MIA chez le rat. Le Tuina sera également mis en œuvre pour voir s’il peut soulager les symptômes de KOA causés par l’augmentation de l’expression du facteur inflammatoire. Tuina sera combiné avec l’inhibition de-L1 pour démontrer l’association entre la voie-1 médiée par Tuina dans l’inflammation des muscles squelettiques affectant le développement de KOA et la douleur, jetant ainsi les bases d’autres études à plusieurs niveaux sur les mécanismes thérapeutiques de l’intervention de Tuina dans KOA.

En résumé, cet article décrit l’étude et l’élaboration des mécanismes de l’inflammation des muscles squelettiques dans le développement du KOA et de sa douleur, ainsi que les effets thérapeutiques du Tuina sur le KOA, du point de vue de l’expression du facteur immuno-inflammatoire, combiné à des indicateurs liés au comportement, afin de fournir des preuves de recherche modernes pour la théorie du « déséquilibre des tendons et des os » dans la médecine traditionnelle chinoise.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées et supervisées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (numéro d’approbation : SYXK2018-0040), ce qui est conforme aux stipulations de la Déclaration d’Helsinki de l’Association médicale mondiale.

1. Préparation des animaux

1. Abriter 32 rats mâles Sprague Dawley (SD) âgés de 8 semaines et pesant de 180 à 220 g dans un appareil de logement spécifique exempt d’agents pathogènes sous 12 h de cycles de lumière et 12 h d’obscurité à 24 ± 2 °C et 60 % d’humidité avec un régime standard de granulés pour rongeurs. Toutes les opérations expérimentales sur les animaux sont conformes à l’éthique du bien-être des animaux de laboratoire et aux règles de sécurité expérimentales sur les animaux.
2. Randomiser et mettre en cage les rats en quatre groupes de huit animaux chacun après 1 semaine d’alimentation adaptative : antiPD-L1 + Tuina (groupe A), modèle (groupe B), Tuina (groupe C) et chirurgie fictive (groupe D).

2. Injection intra-articulaire d’iodoacétate monosodique (MIA) dans le genou

REMARQUE : À l’exception du groupe D, le modèle de rat KOA sera préparé par l’injection de MIA dans la cavité articulaire du genou dans tous les groupes. Pour le groupe D, injecter 25 μL de solution saline physiologique stérile dans la cavité articulaire du genou droit.

1. Anesthésiez le rat en le plaçant dans une cage anesthésique, puis en introduisant de l’isoflurane à 2,5 % jusqu’à ce qu’il soit complètement anesthésié. Confirmez que l’animal est complètement anesthésié en attendant le moment où le jeune rat est couché sur le dos, où ses membres cessent de bouger et où il n’y a pas de réponse au pincement des orteils (réflexe de pédale), au réflexe palpébral et à la relaxation musculaire.
2. Ajoutez une pommade pour les yeux et des gouttes ophtalmiques aux jeunes rats anesthésiés pour prévenir la sécheresse oculaire.
3. Rasez le membre postérieur droit des rats et désinfectez l’articulation du genou avec trois cycles alternés d’iodophor et d’éthanol à 75 %.
4. Pour maintenir une condition expérimentale standardisée, fixez soigneusement la flexion du genou à un angle précis de 90°, en veillant à ce que le ligament rotulien soit orienté vers le haut. Par la suite, injecter 25 μL de solution d’AMI, composée de 4 mg d’AIM dilués dans 25 μL de solution saline stérile dans la cavité articulaire du genou droit des rats.
   REMARQUE : Cette injection a été réalisée à l’aide d’un micro-injecteur spécialisé, ce qui garantit la précision et la cohérence de la procédure^21,22,23. Remettez les rats dans les cages jusqu’à ce qu’ils se réveillent. L’animal qui a subi une intervention chirurgicale n’est pas remis en compagnie d’autres animaux tant qu’il n’est pas complètement rétabli.
5. À la fin de l’étude, euthanasier les rats en leur injectant 1 % de pentobarbital sodique à une dose de 100 mg/kg.

3. Mise en œuvre de Tuina

REMARQUE : La mise en œuvre de Tuina sera guidée par la théorie selon laquelle « pour les patients présentant un déséquilibre tendineux et osseux, les tendons doivent être traités en premier ». Les deux groupes A et B ont commencé l’intervention le premier jour après l’évaluation réussie du modèle, et les deux groupes ont été opérés une fois par jour pendant 14 jours. Les deux autres groupes n’ont été observés que pendant 14 jours sans aucune intervention. Les opérateurs de la manipulation doivent être strictement formés avant l’expérience pour assurer la cohérence de la force, de la fréquence et du rythme.

1. Localisez avec précision le point d’acupuncture chez le rat, y compris EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 et GB34 (Figure 1 et Tableau 1), où les méthodes de pétrissage au doigt seront effectuées à l’aide de l’acupuncture expérimentale²⁴.
2. Fixez le rat en position couchée sur l’équipement de fixation des rats.
3. Une fois que c’est calme et que les membres inférieurs sont détendus, pétrir l’EX-LE4 et le ST35 du membre affecté avec le pouce et l’index simultanément pendant 4 min à 120-140 fois/min.
4. Pétrir les muscles antérieurs et médio-latéraux du membre affecté avec le pouce et l’index pendant 3 min à 120-140 fois/min, en se concentrant sur le SP10, le ST34 et les muscles près de l’articulation du genou. Mettez l’accent sur la manipulation de ces muscles raides avec une intensité telle que le rat ne se débat pas.
5. Pétrir les muscles postérieurs du mollet du membre affecté de haut en bas pendant 3 min à 120-140 fois/min en utilisant le pouce, l’index et le majeur. Pour exposer complètement la zone de traitement, utilisez l’annulaire et l’auriculaire pour tenir l’articulation de la cheville du membre affecté et tirez doucement sur le membre affecté. Concentrez-vous sur SP9, GB34 et les muscles près de l’articulation du genou en mettant l’accent sur les muscles rigides et l’intensité afin que le rat ne se débatte pas.

4. Mesure de l’indice comportemental

1. Mesure du seuil de douleur mécanique plantaire
   REMARQUE : Mesurez les seuils de douleur mécanique plantaire 1 jour avant l’injection d’AIM ainsi que 2, 9 et 16 jours après l’injection.
   1. Amener les rats dans une salle d’essai plantaire avec un fond en grille en acier inoxydable et un corps de cage en plastique dans un environnement calme à température ambiante (22 ± 2) °C pendant 30 min d’adaptation.
   2. Utilisez un analgéseur mécanique électronique avec une aiguille de test en plastique de 0,8 mm de diamètre pour stimuler verticalement la zone centrale de l’arrière-pied droit des rats. Augmentez uniformément et progressivement l’intensité de la stimulation jusqu’à ce que les rats montrent des réactions de rétraction et d’évitement des pattes.
   3. Enregistrez la lecture de l’écran électronique comme le seuil de douleur mécanique du pied plantaire droit du rat.
   4. Mesurez chaque rat 5 fois à des intervalles de 5 minutes.
   5. Supprimez les valeurs maximale et minimale des cinq valeurs. Prenons comme résultat la valeur moyenne des trois valeurs médianes à l’aide de la méthode de la moyenne ajustée (tableau 2).
2. Mesure du seuil de retrait mécanique de la patte
   REMARQUE : Mesurer le seuil de retrait mécanique de la patte 1 jour avant l’injection de MIA, 2, 9 et 16 jours après l’injection.
   1. Amener les rats dans une salle d’essai plantaire chauffée avec un fond en verre à 30 °C et un corps de cage en plastique dans un environnement calme à température ambiante (22 ± 2) °C pendant 30 min d’adaptation.
   2. Stimulez la zone centrale plantaire postérieure droite avec un dispositif de chauffage à source lumineuse à une température de stimulation de 65 °C jusqu’à ce que le rat montre une rétraction de la patte et une réponse d’évitement.
   3. Enregistrez la lecture de l’heure de l’écran électronique comme le seuil de douleur thermique plantaire droit du rat.
   4. Mesurez chaque rat 5 fois en continu à des intervalles de 5 minutes.
   5. Supprimez les valeurs maximale et minimale des cinq valeurs. Prenons comme résultat la valeur moyenne des trois valeurs médianes à l’aide de la méthode de la moyenne ajustée (tableau 3).

5. Mesure de l’enflure de l’articulation du genou droit

REMARQUE : Mesurez le gonflement de l’articulation du genou droit des rats 1 jour avant l’injection d’AMI, 2, 9 et 16 jours après l’injection.

1. Anesthésiez le rat en le plaçant dans une cage anesthésique et en l’exposant à 2,5 % d’isoflurane jusqu’à ce qu’il soit complètement anesthésié.
2. Placez le rat à plat sur la table d’opération.
3. Mesurez la largeur de l’articulation du genou droit à l’aide d’un pied à coulisse (figure 2 et tableau 4).

6. Mesure du score Lequesne MG

REMARQUE : Mesurer le score Lequesne MG chez le rat à 2, 9 et 16 jours après l’injection de MIA. Lequesne et al ont développé un indice de gravité de l’arthrose de la hanche (ISH), qui peut être utilisé pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques. Nous considérons quatre paramètres : la stimulation de la douleur, le changement de démarche, la mobilité articulaire et le gonflement articulaire.

1. Amenez les rats sur une plate-forme de manipulation dans un environnement calme à température ambiante (22 ± 2) °C.
2. Demandez à deux opérateurs, aveugles l’un à l’autre, de mesurer la réponse à la stimulation locale de la douleur, le changement de démarche, le mouvement des articulations et le gonflement des articulations.
   1. Stimulez le côté latéral de l’articulation du genou droit avec une aiguille de test en plastique et marquez sur une échelle de 0 à 3 selon la réponse. 0 pas de réponse ; 3 une bonne réponse ; 1 contraction du membre affecté ; 2 contraction et spasme du membre affecté, accompagnés de légères réactions généralisées, telles que tremblements, léchage et succion.
   2. Placez le rat sur la table d’opération et observez la démarche de ses membres postérieurs droits. Marquez sur une échelle de 0 à 3 en fonction de la réponse. 0 aucune perturbation du mouvement du membre affecté, une course normale et un jeu de jambes fort ; 3 le membre affecté ne peut pas marcher, toucher le sol ou piétiner le sol ; 1 trekking léger pendant la course à pied avec des piétinements forts ; 2 Le membre affecté participe à la marche, mais la perturbation du mouvement des rats (trekking) est évidente.
   3. Fléchissez et étendez l’articulation du genou droit du rat à la main et observez la mobilité de l’articulation. Marquez sur une échelle de 0 à 3 en fonction de la réponse. 0 angle de mobilité articulaire supérieur à 90° ; 3 angles de mobilité articulaire inférieurs à 15° ; 1 angle de mobilité articulaire ou 45°-90° ; 2 angles de mobilité articulaire de 15°-45°.
   4. Touchez l’articulation droite du genou du rat et comparez la réponse avec celle d’un rat normal. Marquez sur une échelle de 0 à 2 en fonction de la réponse. 0 pas de gonflement évident et de marques osseuses visibles ; 2 gonflement marqué et aucune marque osseuse ; 1 léger gonflement et marques osseuses superficielles.
   5. Additionnez ces scores pour obtenir le score de Lequesne MG pour chaque rat et calculez la valeur moyenne par la méthode du parage (tableau 5).

7. Mesure de la température de la peau

REMARQUE : Mesurer la température de la peau 1 jour avant l’injection de MIA et 9 et 16 jours après l’injection.

1. Anesthésiez le rat en le plaçant dans une cage anesthésique, puis en introduisant de l’isoflurane jusqu’à ce qu’il soit complètement anesthésié.
2. Placez le rat en position latérale sur la table d’opération, à température ambiante (22 ± 2) °C.
3. Redressez l’articulation droite du genou en saisissant doucement le pied avec la main. Photographiez pour déterminer la température de la peau à l’aide d’une caméra infrarouge Filr.
4. Lisez la température de la peau de l’articulation du genou et autour de l’articulation du genou du rat à l’aide d’un logiciel d’édition de support. Réglez des points de contrôle au niveau de l’articulation de la cheville et de l’articulation du genou où la température diminue progressivement.

8. Analyse statistique

1. Utiliser un logiciel statistique pour exprimer les données expérimentales en quartiles.
2. Utilisez la méthode de la moyenne de trim pour traiter les valeurs aberrantes. Les résultats des tests comportementaux sont notés comme la moyenne ± l’erreur-type de la moyenne.
3. Effectuer un test t d’échantillons indépendants pour la comparaison entre les groupes. Analysez les données comportementales à l’aide d’une analyse de variance à mesures répétées (ANOVA) bidirectionnelle, suivie des tests de comparaison multiples de Bonferroni. Lorsque les données ne présentent pas de normalité ou d’homoscédasticité, effectuer un test non paramétrique (échantillons k de Kruskal-Wallis).
   NOTE : P < 0,05 indique que les différences sont statistiquement significatives. Toutes les données répondent aux hypothèses des tests statistiques qui sont appliqués.

Résultats

Le protocole décrit a été mis en œuvre dans un cadre clinique à l’hôpital Yueyang de médecine traditionnelle chinoise et occidentale intégrée. La figure 1 montre l’emplacement exact des points d’acupuncture poussés chez les rats, et le tableau 1 illustre les avantages courants de la stimulation de ces points. Les tableaux 2 et 3 offrent des preuves irréfutables d’un soulagement notable de la douleur obtenu grâce à la th?...

Discussion

Cette étude vise à évaluer l’amélioration du KOA après une intervention de Tuina en utilisant des indicateurs comportementaux standardisés et à étudier les mécanismes du Tuina pour le KOA et l’association entre le muscle squelettique et le KOA. Contrairement aux thérapies pharmacologiques et chirurgicales, le Tuina a un effet régulateur positif sur les systèmes moteur, immunitaire et endocrinien. Le Tuina peut soulager l’inflammation et la douleur produites par la maladie en agissant sur différentes ci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390