変形性膝関節症のモノヨード酢酸ナトリウム注射誘発ラットモデルにおける推拿介入

要約

このプロトコルはKOAの動物モデルでTuinaの適用に参照を提供する膝の変形性関節症(KOA)のナトリウムのmonoiodoacetateの注入誘導されたラットモデルにおけるTuinaの介在の方法を記述する。このプロトコルは、KOAに対するTuinaの効果的なメカニズムも研究しており、その結果はその応用を促進するのに役立ちます。

要約

一般的な変性関節症である変形性膝関節症(KOA)は、慢性的な痛みと障害を特徴とし、関節の修復不可能な構造的損傷に進行する可能性があります。KOAにおける関節軟骨、筋肉、滑膜、および膝関節を取り巻くその他の組織間の関連性の調査は非常に重要です。現在、KOAの管理には、ライフスタイルの変更、運動、投薬、および外科的介入が含まれます。しかし、KOA関連疼痛の複雑なメカニズムの解明はまだ進んでいません。その結果、KOA疼痛は依然として重要な臨床的課題であり、治療上の優先事項である。推拿は、運動系、免疫系、内分泌系に調節効果があることがわかっており、 炎症因子のアップレギュレーションによって引き起こされるKOA症状を緩和するかどうか、さらに、骨格筋の炎症因子がKOAの進行を増強できるかどうか。

32匹の雄のSprague Dawley(SD)ラット(180-220 g)を、抗PD-L1+Tuina(グループA)、モデル(グループB)、Tuina(グループC)、および偽手術(グループD)の8匹ずつの4つのグループに無作為に割り付けました。A群、B群、C群では、25μLのモノヨード酢酸ナトリウム(MIA)溶液(4mgのMIAを25μLの滅菌生理食塩水で希釈したもの)を右膝関節腔に注入し、D群に対しては同量の滅菌生理食塩水を注入した。すべてのグループは、注射前および注射後2、9、および16日後に、最もストレスの少ないテスト(足の機械的離脱閾値、足の離脱熱潜伏、右膝関節の腫れ、Lequesne MGスコア、皮膚温度)を使用して評価されました。

概要

変形性膝関節症(KOA)は、慢性的な痛みと障害を特徴とする一般的な変性変形性関節症であり、比較的重度のKOA^は関節に不可逆的な構造的損傷をもたらします1。KOAの世界的な有病率の高さは^{、世界的な公衆衛生}上の大きな課題となっており^2,3、患者の生活の質を著しく損なう^4,5。研究によると、KOAは世界中で2億6,000万人以上が罹患しています⁶。人口の高齢化に伴い、中国におけるKOAの総有病率は40歳以上で17.0%と高く、罹患者の家族に大きな負担をかけています^7,8。

中国医学では、KOAは「麻痺」の範疇に属し⁹、黄帝の内科古典は腱、骨、肉を麻痺と関連付けています。したがって、KOAでは、軟骨、筋肉、滑膜、および膝関節周辺の他の組織間の接続に注意を払う必要があります。現代医学では、関節炎の免疫恒常性の主要な構成要素である筋肉と骨の両方の炎症がKOAの痛みの進行を促進します。しかし、ほとんどの研究は骨関節の軟骨炎症と滑膜炎症に焦点を当てており、骨格筋の炎症現象を調べた論文は不足しています。したがって、炎症における骨格筋の役割に関するさらなる研究は、KOAをより包括的に理解し、より効果的な治療法のアイデアを提供するために必要です。文献のレビューでは、免疫関連因子プログラム死リガンド1(PD-L1)の阻害がKOA10,11の進行を悪化させ、^KOA12患者の骨格筋における^IL-15およびFOXO1の発現の違い、および末期KOA患者の有意な骨格筋の炎症があることを発見しました。 これは歩行の変化にも関連していました。骨格筋はIL-6などの炎症性免疫に密接に関連する因子も分泌することがあり、TNF-αはPD-L1経路やKOAにも密接に関連していることが示されています13,14,15。

現在、KOAの利用可能な治療法には、体重管理、運動、投薬、および手術が含まれ、通常は関節内注射、鎮痛薬、関節鏡視下手術、および膝の人工骨切り術が含まれます¹⁶。現在、KOA疾患の進行を完全に止めたり元に戻したりすることはできず、KOAの痛みの根底にある複雑なメカニズムを明確に理解していないと、KOA患者は鎮痛薬の過剰使用や副作用の発生率が高くなるリスクがあります⁸。ほとんどの治療戦略は短期間しか効果がなく、病気の病因ではなく、症状の一時的な緩和にのみ焦点を当てています。したがって、KOAの痛みは依然として治療の優先事項であり、課題であり、深刻な臨床的課題を提起しています。しかし、推拿はKOA治療において患部の関節周辺の骨格筋を直接刺激することができ、いくつかの利点をもたらすことができます。前の説明と組み合わせると、KOAにおける骨格筋組織の役割を研究するための理想的な治療法であり、炎症における骨格筋組織の役割を明らかにすることは、KOAのTuinaにより良い理論的サポートを提供することもできます。

研究によると、マッサージ療法、オステオパシー手技療法、脊椎マニピュレーションは、痛みを和らげ、身体機能を回復させるのに役立つことが示されています^17,18。これらの操作は、局所的な炎症に作用し、外部の機械的作用によって痙攣や鎮痛を和らげることができます。人工膝関節全置換術後の痛みを和らげ、鎮痛薬の使用を減らし、術後の回復を促進し、生体力学的バランスを改善することができます¹⁹。スウェーデン式マッサージは変形性関節症の治療に有効であり、ストレスを軽減し、生活の質を向上させることができます²⁰。KOAに対する推拿の治療効果は、特定の研究によって先行されています。.

本実験では、ラットにおけるMIA誘導KOAモデルを用いて、骨格筋におけるPD-L1および関連する炎症因子の発現がKOAを誘導し、その発生を促進することができるかどうかを検討します。また、炎症因子の発現増加によって引き起こされるKOAの症状を緩和できるかどうかを調べるために、Tuinaも実施されます。推拿はPD-L1阻害と組み合わされ、KOAの発症と痛みに影響を与える骨格筋の炎症における推拿を介したPD-1経路との関連を実証し、KOAにおける推拿介入の治療メカニズムに関するさらなるマルチレベル研究の基礎を築きます。

要約すると、本論文は、KOAの発症における骨格筋の炎症とその痛みのメカニズムの調査と精緻化、およびKOAに対するトゥイナの治療効果について、免疫炎症因子の発現の観点から説明し、行動関連の指標と組み合わせて、伝統的な中国医学における「腱と骨の不均衡」理論の現代的な研究証拠を提供します。

プロトコル

すべての実験は、世界医師会ヘルシンキ宣言の規定に準拠した上海中医薬大学動物管理委員会(承認番号:SYXK2018-0040)によって承認および監督されました。

1.動物の調製

1. ハウス32 Sprague Dawley(SD)オスラット、8週齢、体重180〜220g、特定の病原体のない飼育装置で、24±〜2°C、湿度60%、24〜2°C、湿度60%で12時間の明サイクル、標準的なげっ歯類のペレット食。動物実験は、実験動物の福祉倫理および動物実験安全規則を遵守します。
2. ラットを無作為に割り付け、1週間の適応給餌後、抗PD-L1+Tuina(グループA)、モデル(グループB)、Tuina(グループC)、および偽手術(グループD)の8匹ずつの4つのグループにケージに入れます。

2.膝へのヨード酢酸ナトリウム(MIA)の関節内注射

注:グループDを除いて、KOAラットモデルは、すべてのグループでMIAの膝関節腔注射によって準備されます。グループDの場合、25μLの滅菌生理食塩水を右膝関節腔に注入します。

1. ラットを麻酔ケージに入れ、完全に麻酔されるまで2.5%イソフルランを導入して麻酔をかけます。若いラットが仰向けに寝ている時点を待って、手足の動きが止まり、つま先のつまみ(足の反射)、眼瞼反射、筋の弛緩に反応がないのを待って、動物が完全に麻酔されていることを確認します。
2. 麻酔をかけた若いラットにペットの眼軟膏と点眼薬を加えて、目の乾燥を防ぎます。
3. ラットの右後肢を剃り、ヨードフォアと75%エタノールを交互に3回投与して膝関節を消毒する。
4. 標準化された実験条件を維持するために、膝蓋靭帯が上向きになるように、膝の屈曲を90°の正確な角度で慎重に固定します。続いて、25μLの滅菌生理食塩水で希釈した4mgのMIAからなる25μLのMIA溶液をラットの右膝関節腔に注入する。
   注:この注入は、特殊なマイクロインジェクターを使用して実施され、手順21^、22、23の精度と一貫性を確保しました。ネズミが目を覚ますまでケージに戻します。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻されません。
5. 研究の最後に、1%ペントバルビタールナトリウムを100 mg / kgの用量として注射してラットを安楽死させます。.

3. 推拿の実施

注:Tuinaの実装は、「腱と骨の不均衡のある患者の場合、腱を最初に治療する必要がある」という理論によって導かれます。A群とB群は、モデル評価が成功した翌日に介入を開始し、両群とも1日1回、14日間手術を行った。残りの2つのグループは、介入なしで14日間のみ観察されました。操作のオペレーターは、力、周波数、およびリズムの一貫性を確保するために、実験の前に厳密に訓練されなければなりません。

1. EX-LE4、ST35、SP10、ST34、SP9、GB34(図 1および 表1)を含むラット経穴を正確に特定し、実験鍼治療²⁴を使用して指捏造法を実施します。
2. ラット固定装置の腹臥位にラットを固定します。
3. 静かになり、下肢がリラックスしたら、患肢のEX-LE4とST35を親指と人差し指で同時に4分間、120〜140回/分でこねます。
4. 患肢の前外側と内側外側の筋肉を親指と人差し指で3分間、120〜140回/分で、SP10、ST34、および膝関節付近の筋肉を中心にこねます。ラットが苦労しないように、それらの硬い筋肉の操作を強度で強調します。
5. 親指、人差し指、中指を使って、患肢のふくらはぎ後部の筋肉を上から下に3分間、120〜140回/分でこねます。治療部位を完全に露出させるには、薬指と小指で患肢の足首関節を持ち、患肢をそっと引っ張ります。SP9、GB34、膝関節付近の筋肉に重点を置き、ラットがもがかわないように硬直した筋肉と強度に重点を置きます。

4. 行動指標の測定

1. 足底の機械的疼痛閾値の測定
   注:MIA注射の1日前、および注射の2、9、および16日後に足底の機械的痛みのしきい値を測定します。.
   1. 室温(22±2)°Cの静かな環境で、ステンレス鋼のグリッド底とプラスチック製のケージ本体を備えた足底試験室にラットを連れてきて、30分間適応させます。
   2. 直径0.8mmのプラスチック製の試験針を備えた電子機械式疼痛検査器を使用して、ラットの右後足の中央部を垂直に刺激します。ラットが足の引っ込み反応と回避反応を示すまで、刺激強度を均等かつ徐々に増やします。
   3. 電子画面の読み取り値を、ラットの右足底足の機械的疼痛閾値として記録します。
   4. 各ラットを5分間隔で5回測定します。
   5. 5 つの値から最大値と最小値を削除します。結果として、トリミング平均法による中央の3つの値の平均値を取ります(表2)。
2. 足の機械的離脱閾値の測定
   注:MIA注射の1日前、注射の2日、9日、および16日後に足の機械的離脱しきい値を測定します。
   1. ラットを、室温(22±2)°Cの静かな環境で、30°Cのガラス底とプラスチック製のケージ本体を備えた加熱された足底試験室に30分間適応させます。
   2. ラットが足の引っ込みと回避反応を示すまで、刺激温度65°Cの光源加熱装置で右後足底中央領域を刺激します。
   3. 電子画面の時間読み取り値をラットの右足底熱痛閾値として記録します。
   4. 各ラットを5分間隔で5回連続して測定します。
   5. 5 つの値から最大値と最小値を削除します。真ん中の3つの値の平均値を、平衡平均法で測定します(表3)。

5.右膝関節の腫れの測定

注:MIA注射の1日前、注射の2日後、9日後、16日後にラットの右膝関節の腫れを測定します。

1. ラットを麻酔薬ケージに入れ、完全に麻酔されるまで2.5%イソフルランに曝露して麻酔をかけます。
2. ラットを手術台の平らな位置に置きます。
3. ノギスで右膝関節の幅を測定します(図2 および 表4)。

6.ルケインMGスコアの測定

注:MIA注射後2、9、および16日でラットのLequesne MGスコアを測定します。.Lequesneらは、治療的介入の有効性を評価するために使用できる変形性股関節症(ISH)の重症度指標を開発しました。疼痛刺激、歩行変化、関節可動性、関節腫脹の4つのパラメータを考慮します。

1. 室温(22±2)°Cの静かな環境の操作プラットフォームにラットを連れて行きます。
2. 2人のオペレーターに、お互いを盲検化してもらい、局所的な痛みの刺激反応、歩行の変化、関節の動き、関節の腫れを測定してもらいます。
   1. プラスチック製の試験針で右膝関節の外側を刺激し、反応に応じて0〜3のスケールでスコアを付けます。0 応答なし。3良い反応。罹患肢の1つの収縮。2 罹患肢の収縮とけいれん、震え、舐める、吸うなどの軽度の全身反応を伴う。
   2. ラットを手術台に置き、右後肢の歩行を観察します。回答に応じて 0 から 3 のスケールでスコアを付けます。0罹患した手足の動き、通常のランニング、および強いフットワークに支障はありません。3罹患した手足は、歩行に参加したり、地面に触れたり、地面を踏みつけたりすることはできません。強い踏みつけで走っている間の1つの穏やかなトレッキング。2罹患した手足は歩行に参加しますが、ラットの動き(トレッキング)の乱れは明らかです。
   3. ラットの右膝関節を手で曲げたり伸ばしたりして、関節の可動性を観察します。回答に応じて 0 から 3 のスケールでスコアを付けます。90°以上の0関節可動角度。3関節可動角度15°未満。1関節可動角度または45°-90°;15°-45°の2関節可動角度。
   4. ラットの右膝関節を触って、正常なラットの反応と比較します。回答に応じて 0 から 2 のスケールでスコアを付けます。0明らかな腫れや目に見える骨のマーキングはありません。2つの顕著な腫れと骨のマーキングなし。1軽度の腫れと表面的な骨のマーキング。
   5. これらのスコアを加算して、各ラットのLequesne MGスコアを生成し、トリミング法で平均値を計算します(表5)。

7.皮膚温の測定

注:MIA注射の1日前と注射の9日後と16日後に皮膚温度を測定します。.

1. ラットを麻酔ケージに入れ、完全に麻酔されるまでイソフルランを導入して麻酔をかけます。
2. ラットを手術台の横向きに置き、室温(22±2)°Cで行います。
3. 手で足をそっとつかんで、右膝関節をまっすぐにします。Filr赤外線カメラを使用して皮膚温度を測定するための写真。
4. ラットの膝関節と膝関節周辺の皮膚温度を、サポートする編集ソフトウェアを使用して読み取ります。足首関節と膝関節に、温度が徐々に下がるコントロールポイントを設定します。

8. 統計解析

1. 統計ソフトウェアを使用して、実験データを四分位数で表します。
2. 平衡平均法を使用して、外れ値を処理します。行動テストの結果は、平均の平均±標準誤差として記録されます。
3. グループ間の比較のために独立サンプルの t検定を実行します。二元配置反復測定分散分析 (ANOVA) を使用して行動データを分析した後、Bonferroni の多重比較検定を行います。データが正規性または等分散性を示さない場合は、ノンパラメトリック検定(Kruskal-Wallis kサンプル)を実行します。
   注: P < 0.05 は、差が統計的に有意であることを示します。すべてのデータは、適用される統計的検定の仮定を満たしています。

結果

説明されているプロトコルは、中国伝統医学と西洋医学の統合の岳陽病院の臨床現場で実施されました。図1はラットに押し込まれたツボの正確な位置を示し、表1はこれらのツボを刺激することの一般的な利点を示しています。表2および表3は、PD-1経路阻害がない場合でも、推拿療法によって達成された顕著な疼痛緩和の説得力の?...

ディスカッション

本研究は、標準化された行動指標を用いて、推拿介入後のKOAの改善を評価し、KOAに対するTuinaのメカニズムと骨格筋とKOAとの関連を調査することを目的としています。薬物療法や外科的治療とは異なり、推拿は運動系、免疫系、内分泌系にプラスの調節効果をもたらします。推拿は、さまざまな標的に作用することにより、病気によって引き起こされる炎症や痛みを和らげることができます?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390