Diz Osteoartritinin Sodyum Monoiyodoasetat Enjeksiyonuna Bağlı Sıçan Modelinde Tuina Müdahalesi

Özet

Bu protokol, Tuina'nın KOA hayvan modellerinde uygulanması için bir referans sağlayan, diz osteoartritinin (KOA) sodyum monoiyodoasetat enjeksiyonuna bağlı sıçan modelinde Tuina müdahale yöntemlerini açıklar. Bu protokol aynı zamanda Tuina'nın KOA için etkili mekanizmasını da incelemektedir ve sonuçlar uygulamasının desteklenmesine yardımcı olacaktır.

Özet

Yaygın bir dejeneratif eklem hastalığı olan diz osteoartriti (KOA), eklemin onarılamaz yapısal hasarına kadar ilerleyebilen kronik ağrı ve sakatlık ile karakterizedir. KOA'da eklem kıkırdağı, kaslar, sinovyum ve diz eklemini çevreleyen diğer dokular arasındaki bağlantının araştırılması büyük önem taşımaktadır. Şu anda, KOA'yı yönetmek yaşam tarzı değişikliklerini, egzersizi, ilaçları ve cerrahi müdahaleleri içerir; bununla birlikte, KOA ile ilişkili ağrının altında yatan karmaşık mekanizmaların aydınlatılması hala eksiktir. Sonuç olarak, KOA ağrısı önemli bir klinik zorluk ve terapötik bir öncelik olmaya devam etmektedir. Tuina'nın motor, bağışıklık ve endokrin sistemler üzerinde düzenleyici bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur, bu da Tuina'nın enflamatuar faktörlerin yukarı regülasyonundan kaynaklanan KOA semptomlarını hafifletip hafifletemeyeceğini ve ayrıca iskelet kasındaki enflamatuar faktörlerin KOA'nın ilerlemesini artırıp artıramayacağını araştırmaktadır.

32 erkek Sprague Dawley (SD) sıçanı (180-220 g) her biri sekiz hayvandan oluşan dört gruba randomize ettik: antiPD-L1 + Tuina (grup A), model (grup B), Tuina (grup C) ve sahte cerrahi (grup D). Grup A, B ve C için sağ diz eklem boşluğuna 25 μL sodyum monoiyodoasetat (MIA) solüsyonu (25 μL steril salin solüsyonunda seyreltilmiş 4 mg MIA), grup D için aynı miktarda steril serum fizyolojik enjekte edildi. Tüm gruplar enjeksiyondan önce ve enjeksiyondan 2, 9 ve 16 gün sonra en az stresli testler (pençe mekanik çekilme eşiği, pati çekilmesi termal latansı, sağ diz ekleminin şişmesi, Lequesne MG skoru, cilt sıcaklığı) kullanılarak değerlendirildi.

Giriş

Diz osteoartriti (KOA), kronik ağrı ve sakatlık ile karakterize yaygın bir dejeneratif osteoartrittir ve nispeten şiddetli KOA, eklemde geri dönüşü olmayan yapısal hasara yol açacaktır¹. KOA'nın yüksek küresel prevalansı, hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde bozan önemli bir küresel halk sağlığı sorunu^{haline gelmiştir 2,3 4,5}. Araştırmalar, KOA'nın dünya çapında 260 milyondan fazla insanı etkilediğini göstermiştir⁶. Nüfusun yaşlanmasıyla birlikte, Çin'de KOA'nın toplam yaygınlık oranı 17.0 yaşın üzerinde% 40'a kadar çıkmaktadır ve bu da etkilenenlerin ailelerine ağır bir yük getirmektedir ^7,8.

Çin tıbbına göre, KOA "felç" kategorisine ^aittir9 ve Sarı İmparator'un İç Hastalıkları Klasiği tendonları, kemikleri ve eti felçle ilişkilendirir. Bu nedenle KOA'da diz eklemi çevresindeki kıkırdak, kas, sinovyum ve diğer dokular arasındaki bağlantıya dikkat etmemiz gerekir. Modern tıpta, artritin immün homeostazının ana bileşenleri olan hem kas hem de kemik iltihabı, KOA ağrısının ilerlemesini sağlar. Bununla birlikte, çoğu çalışma kemik eklemlerinde kıkırdak iltihabı ve sinovyal inflamasyona odaklanmaktadır ve iskelet kaslarındaki inflamatuar fenomenleri inceleyen makalelerin azlığı vardır. Bu nedenle, KOA'yı daha kapsamlı bir şekilde anlamak ve daha etkili tedavi yöntemleri için fikir sağlamak için iskelet kasının inflamasyondaki rolü hakkında daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Literatürün gözden geçirilmesinde, immün ilişkili faktör programlanmış ölüm ligandı 1'in (PD-L1) inhibisyonunun KOA 10,11'in ilerlemesini şiddetlendirdiğini ve KOA^12'li hastaların iskelet kasında^{IL-15 ve FOXO1'in} farklı ekspresyonunun yanı sıra son dönem KOA'lı hastalarda önemli iskelet kası iltihabı olduğunu bulduk^, bu da yürüyüşteki değişikliklerle ilişkilendirildi. İskelet kasının IL-6 gibi inflamatuar bağışıklık ile yakından ilişkili faktörleri de salgılayabildiği ve TNF-α'nin de PD-L1 yolağı ve KOA^13,14,15 ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir.

Şu anda, KOA için mevcut tedaviler arasında kilo kontrolü, egzersiz, ilaç tedavisi ve genellikle eklem içi enjeksiyonlar, analjezik ilaçlar, artroskopik cerrahi ve diz periprostetik osteotomisi^{içeren cerrahi bulunmaktadır 16}. Şu anda, KOA hastalığının ilerlemesi tamamen durdurulamaz veya tersine çevrilemez ve KOA ağrısının altında yatan karmaşık mekanizmalar net bir şekilde anlaşılmadan, KOA hastaları analjezik ilaçların aşırı kullanımı ve yüksek yan etki insidansı riski altındadır⁸. Çoğu tedavi stratejisi sadece kısa süreler için etkilidir ve hastalığın patogenezinden ziyade sadece semptomların geçici olarak hafifletilmesine odaklanır. Bu nedenle, KOA ağrısı tedavi için bir öncelik ve zorluk olmaya devam etmekte ve ciddi bir klinik zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, Tuina, KOA tedavisinde etkilenen eklem çevresindeki iskelet kaslarını doğrudan uyarabilir ve bazı faydalar sağlayabilir. Önceki tanımla birleştirildiğinde, iskelet kası dokusunun KOA'daki rolünü incelemek ideal bir terapidir ve iskelet kası dokusunun inflamasyondaki rolünü açıklığa kavuşturmak, KOA'nın Tuina'sı için daha iyi teorik destek sağlayabilir.

Çalışmalar, masaj terapisinin, osteopatik manipülatif tedavinin ve spinal manipülasyonun ağrıyı hafifletmeye ve vücut fonksiyonunu geri kazanmaya yardımcı olabileceğini göstermiştir^17,18. Bu manipülasyonlar lokal inflamasyona etki edebilir ve dış mekanik etki yoluyla spazmları ve analjeziyi hafifletebilir. Total diz artroplastisi sonrası ağrıyı hafifletebilir, analjezik ilaçların kullanımını azaltabilir, postoperatif iyileşmeyi teşvik edebilir ve biyomekanik dengeyi iyileştirebilirler¹⁹. İsveç masajı osteoartrit tedavisinde uygulanabilir ve stresi azaltabilir ve yaşam kalitesini artırabilir²⁰. Tuina'nın KOA üzerindeki terapötik etkisinden önce bazı çalışmalar yapılmıştır.

Bu deneyde ekibimiz, iskelet kasındaki PD-L1 ve ilgili enflamatuar faktörlerin ekspresyonunun KOA'yı indükleyip indükleyemeyeceğini ve sıçanlarda MIA kaynaklı KOA modeline dayalı gelişimini destekleyip destekleyemeyeceğini araştıracaktır. Tuina, artan inflamatuar faktör ekspresyonunun neden olduğu KOA semptomlarını hafifletip hafifletemeyeceğini görmek için de uygulanacaktır. Tuina, KOA gelişimini etkileyen iskelet kası iltihabında Tuina aracılı PD-1 yolu ile ağrı arasındaki ilişkiyi göstermek için PD-L1 inhibisyonu ile birleştirilecek ve KOA'da Tuina müdahalesinin terapötik mekanizmaları üzerine daha fazla çok seviyeli çalışmanın temelini atacaktır.

Özetle, bu makale, geleneksel Çin tıbbında "tendon ve kemik dengesizliği" teorisi için modern araştırma kanıtları sağlamak için, davranışsal göstergelerle birlikte, bağışıklık-inflamatuar faktör ekspresyonu perspektifinden KOA ve ağrısının gelişiminde iskelet kası iltihabı mekanizmalarının araştırılmasını ve detaylandırılmasını ve ayrıca Tuina'nın KOA üzerindeki terapötik etkilerini açıklamaktadır.

Protokol

Tüm deneyler, Dünya Tabipler Birliği Helsinki Bildirgesi'ndeki şartlara uyan Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (onay numarası: SYXK2018-0040) tarafından onaylanmış ve denetlenmiştir.

1. Hayvan hazırlama

1. 8 haftalık ve 180-220 g ağırlığındaki 32 Sprague Dawley (SD) erkek sıçan, 24 ± 2 ° C'de ve% 60 nemde 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüler altında belirli bir patojen içermeyen muhafaza aparatında standart bir kemirgen pelet diyeti ile. Hayvanlar üzerinde yapılan tüm deneysel işlemler, deney hayvanlarının refah etiğine ve hayvan deney güvenliği yönetmeliklerine uygundur.
2. Randomize edin ve 1 haftalık adaptif beslenmeden sonra sıçanları her biri sekiz hayvandan oluşan dört gruba ayırın: antiPD-L1 + Tuina (grup A), model (grup B), Tuina (grup C) ve sahte cerrahi (grup D).

2. Dizde eklem içi monosodyum iyodoasetat (MIA) enjeksiyonu

NOT: Grup D hariç, tüm gruplarda MİA'nın diz eklem boşluğu enjeksiyonu ile KOA sıçan modeli hazırlanacaktır. D grubu için, sağ diz eklemi boşluğuna 25 μL steril fizyolojik salin enjekte edin.

1. Sıçanı anestezik bir kafese yerleştirerek ve ardından tamamen uyuşturulana kadar% 2.5 izofluran vererek uyuşturun. Genç sıçanın sırt üstü yattığı, uzuvlarının hareket etmeyi bıraktığı ve ayak parmağı sıkışması (pedal refleksi), palpebral refleks ve kas gevşemesinde yanıt olmadığı noktayı bekleyerek hayvanın tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.
2. Göz kuruluğunu önlemek için anestezi uygulanmış genç sıçanlara evcil hayvan göz merhemi ve göz damlası ekleyin.
3. Sıçanların sağ arka bacaklarını tıraş edin ve diz eklemini üç alternatif iyodofor ve% 75 etanol ile dezenfekte edin.
4. Standart bir deneysel durumu korumak için, diz fleksiyonunu 90°'lik hassas bir açıyla dikkatlice sabitleyin ve patellar ligamanın yukarı doğru yönlendirildiğinden emin olun. Daha sonra, sıçanların sağ diz eklem boşluğuna 25 μL steril salin çözeltisi içinde seyreltilmiş 4 mg MIA'dan oluşan 25 μL MIA çözeltisi enjekte edin.
   NOT: Bu enjeksiyon, prosedürde doğruluk ve tutarlılık sağlayan özel bir mikroenjektör ile gerçekleştirilmiştir^21,22,23. Fareleri uyanana kadar kafeslere geri koyun. Ameliyat geçiren hayvan, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmez.
5. Çalışmanın sonunda, 100 mg / kg'lık bir doz olarak% 1 pentobarbital sodyum enjekte ederek sıçanlara ötenazi yapın.

3. Tuina'nın Uygulanması

NOT: Tuina'nın uygulanması, "tendon ve kemik dengesizliği olan hastalar için önce tendonların tedavi edilmesi gerektiği" teorisi tarafından yönlendirilecektir. Modelin başarılı bir şekilde değerlendirilmesinin ardından hem A hem de B grupları ilk gün müdahaleye başladı ve her iki grup da 14 gün boyunca günde birer kez ameliyat edildi. Kalan iki grup herhangi bir müdahale olmaksızın sadece 14 gün boyunca gözlemlendi. Manipülasyon operatörleri, kuvvet, frekans ve ritmin tutarlılığını sağlamak için deneyden önce sıkı bir şekilde eğitilmelidir.

1. Deneysel Akupunktur²⁴ kullanılarak parmak yoğurma yöntemlerinin gerçekleştirileceği EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 ve GB34 (Şekil 1 ve Tablo 1) dahil olmak üzere sıçan akupunktur noktasını doğru bir şekilde bulun.
2. Fareyi, fare sabitleme ekipmanına yüzüstü pozisyonda sabitleyin.
3. Sakinleştikten ve alt ekstremiteler gevşedikten sonra, etkilenen uzvun EX-LE4 ve ST35'ini başparmak ve işaret parmağı ile aynı anda 4 dakika boyunca 120-140 kez/dk'da yoğurun.
4. Etkilenen uzvun ön ve medial-lateral kaslarını başparmak ve işaret parmağı ile SP10, ST34 ve diz eklemine yakın kaslara odaklanarak 120-140 kez/dk'da 3 dakika yoğurun. Sıçanın mücadele etmemesi için bu sert kasların yoğun bir şekilde manipüle edilmesini vurgulayın.
5. Etkilenen uzvun arka baldır kaslarını başparmak, işaret parmağı ve orta parmağı kullanarak 3 dakika boyunca 120-140 kez/dk ile yukarıdan aşağıya yoğurun. Tedavi alanını tam olarak ortaya çıkarmak için, etkilenen uzvun ayak bileği eklemini tutmak için yüzük parmağını ve küçük parmağı kullanın ve etkilenen uzvu hafifçe çekin. SP9, GB34 ve diz ekleminin yakınındaki kaslara, sert kaslara ve yoğunluğa vurgu yaparak odaklanın, böylece sıçan mücadele etmez.

4. Davranış indeksinin ölçülmesi

1. Plantar mekanik ağrı eşiğinin ölçülmesi
   NOT: MIA enjeksiyonundan 1 gün önce ve enjeksiyondan 2, 9 ve 16 gün sonra plantar mekanik ağrı eşiklerini ölçün.
   1. Sıçanları, 30 dakikalık adaptasyon için oda sıcaklığında (22 ± 2) ° C'de sessiz bir ortamda paslanmaz çelik ızgara tabanlı ve plastik kafes gövdeli bir plantar test odasına getirin.
   2. Sıçanların sağ arka ayağının orta bölgesini dikey olarak uyarmak için 0,8 mm çapında plastik bir test iğnesine sahip bir elektronik mekanik ağrı test cihazı kullanın. Sıçanlar pençe geri çekme ve kaçınma reaksiyonları gösterene kadar stimülasyon yoğunluğunu eşit ve kademeli olarak artırın.
   3. Elektronik ekranın okunmasını, sıçanın sağ plantar ayağının mekanik ağrı eşiği olarak kaydedin.
   4. Her sıçanı 5 dakikalık aralıklarla 5x ölçün.
   5. Beş değerden maksimum ve minimum değerleri kaldırın. Sonuç olarak kırpılmış ortalama yöntemiyle ortadaki üç değerin ortalama değerini alın (Tablo 2).
2. Pençe mekanik çekilme eşiğinin ölçülmesi
   NOT: MIA enjeksiyonundan 1 gün önce, enjeksiyondan 2, 9 ve 16 gün sonra pençe mekanik çekilme eşiğini ölçün.
   1. Sıçanları, 30 dakikalık adaptasyon için oda sıcaklığında (22 ± 2) °C'de sessiz bir ortamda 30 °C cam tabanlı ve plastik kafes gövdeli ısıtılmış bir plantar test odasına getirin.
   2. Sıçan bir pençe geri çekme ve kaçınma tepkisi gösterene kadar 65 ° C'lik bir stimülasyon sıcaklığında bir ışık kaynağı ısıtma cihazı ile sağ arka plantar merkez alanını uyarın.
   3. Elektronik ekranın zaman okumasını sıçanın sağ plantar termal ağrı eşiği olarak kaydedin.
   4. Her sıçanı 5 dakikalık aralıklarla sürekli olarak 5x ölçün.
   5. Beş değerden maksimum ve minimum değerleri kaldırın. Sonuç olarak, kırpılmış ortalama yöntemiyle ortadaki üç değerin ortalama değerini alın (Tablo 3).

5. Sağ diz ekleminin şişliğinin ölçülmesi

NOT: MIA enjeksiyonundan 1 gün önce, enjeksiyondan 2, 9 ve 16 gün sonra sıçanların sağ diz ekleminin şişmesini ölçün.

1. Sıçanı anestezik bir kafese yerleştirerek ve tamamen uyuşturulana kadar% 2.5 izoflurana maruz bırakarak uyuşturun.
2. Fareyi ameliyat masasına düz bir pozisyonda yerleştirin.
3. Sağ diz ekleminin genişliğini sürmeli kaliperlerle ölçün (Şekil 2 ve Tablo 4).

6. Lequesne MG skorunun ölçülmesi

NOT: MIA enjeksiyonundan 2, 9 ve 16 gün sonra sıçanlarda Lequesne MG skorunu ölçün. Lequesne ve arkadaşları, terapötik müdahalelerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek kalça osteoartriti (ISH) için bir şiddet indeksi geliştirdiler. Dört parametreyi göz önünde bulunduruyoruz: ağrı stimülasyonu, yürüyüş değişikliği, eklem hareketliliği ve eklem şişmesi.

1. Sıçanları oda sıcaklığında (22 ± 2) ° C'de sessiz bir ortamda bir manipülasyon platformuna getirin.
2. Birbirine kör olan iki operatöre sahip olun, lokal ağrı stimülasyon yanıtını, yürüyüş değişikliğini, eklem hareketini ve eklem şişmesini ölçün.
   1. Sağ diz ekleminin lateral tarafını plastik bir test iğnesi ile uyarın ve cevaba göre 0-3 arasında bir ölçekte puanlayın. 0 yanıt yok; 3 iyi bir yanıt; 1 etkilenen uzuv kasılması; 2 etkilenen uzuvda kasılma ve spazm, titreme, yalama ve emme gibi hafif genelleştirilmiş reaksiyonların eşliğinde.
   2. Fareyi ameliyat masasına yerleştirin ve sağ arka bacaklarının yürüyüşünü gözlemleyin. Yanıta göre 0-3 arasında puan verin. 0 etkilenen uzvun hareketinde bozulma yok, normal koşu ve güçlü ayak hareketi; 3 etkilenen uzuv yürümeye katılamaz, yere dokunamaz veya yere basamaz; 1 güçlü vuruşlarla koşu sırasında hafif trekking; 2 Etkilenen uzuv yürümeye katılır, ancak sıçanların hareketindeki bozukluk (trekking) açıktır.
   3. Sıçanın sağ diz eklemini elle esnetin ve uzatın ve eklem hareketliliğini gözlemleyin. Yanıta göre 0-3 arasında puan verin. 90 ° 'den fazla 0 eklem hareketlilik açısı; 15 ° 'den az 3 eklem hareketlilik açısı; 1 eklem hareketlilik açısı veya 45 ° -90 °; 15 ° -45 ° 2 eklem hareketlilik açısı.
   4. Sıçanın sağ diz eklemine dokunun ve yanıtı normal bir sıçanınkiyle karşılaştırın. Yanıta göre 0-2 arasında puan verin. 0 belirgin şişlik ve görünür kemik işaretleri yok; 2 belirgin şişlik ve kemik izi yok; 1 hafif şişlik ve yüzeysel kemik lekeleri.
   5. Her sıçan için Lequesne MG skorunu üretmek için bu skorları ekleyin ve kesilmiş yöntemle ortalama değeri hesaplayın (Tablo 5).

7. Cilt sıcaklığının ölçülmesi

NOT: MIA enjeksiyonundan 1 gün önce ve enjeksiyondan 9 ve 16 gün sonra cilt sıcaklığını ölçün.

1. Sıçanı anestezik bir kafese yerleştirerek ve ardından tamamen uyuşturulana kadar izofluran vererek uyuşturun.
2. Sıçanı oda sıcaklığında (22 ± 2) ° C'de ameliyat masasına yan pozisyonda yerleştirin.
3. Ayağı elinizle hafifçe kavrayarak sağ diz eklemini düzeltin. Filr kızılötesi kamera ile cilt sıcaklığını belirlemek için fotoğraf çekin.
4. Destekleyici düzenleme yazılımını kullanarak diz ekleminin ve sıçanın diz ekleminin etrafındaki cilt sıcaklığını okuyun. Sıcaklığın kademeli olarak düştüğü ayak bileği eklemi ve diz ekleminde kontrol noktaları ayarlayın.

8. İstatistiksel analiz

1. Deneysel verileri çeyrek olarak ifade etmek için istatistiksel yazılım kullanın.
2. Aykırı değerlerle başa çıkmak için trim ortalama yöntemini kullanın. Davranış testlerinin sonuçları, ortalamanın ortalama ± standart hatası olarak not edilir.
3. Gruplar arasında karşılaştırma yapmak için bağımsız örneklem t-testi yapın. Davranışsal verileri, iki yönlü tekrarlanan varyans analizi (ANOVA) ve ardından Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testlerini kullanarak analiz edin. Verilerin normallik veya homoskedastisite göstermediği durumlarda, parametrik olmayan bir test yapın (Kruskal-Wallis k örnekleri).
   NOT: P < 0.05 , farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterir. Tüm veriler, uygulanan istatistiksel testlerin varsayımlarını karşılamaktadır.

Sonuçlar

Açıklanan protokol, Yueyang Entegre Geleneksel Çin ve Batı Tıbbı Hastanesi'nde klinik bir ortamda uygulandı. Şekil 1, sıçanlarda itilen akupunktur noktalarının tam yerini göstermektedir ve Tablo 1 , bu noktaları uyarmanın ortak faydalarını göstermektedir. Tablo 2 ve Tablo 3 , PD-1 yolağı inhibisyonu olmasa bile, Tuina tedavisi ile elde edilen kayda değer ağrı rahatlamasına dair ikna edici kanıtlar sunmaktadır. Tablo...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, standardize davranış göstergeleri kullanarak Tuina müdahalesi sonrası KOA gelişimini değerlendirmek, Tuina'nın KOA için mekanizmalarını ve iskelet kası ile KOA arasındaki ilişkiyi araştırmak. Farmakolojik ve cerrahi tedavilerin aksine, Tuina motor, bağışıklık ve endokrin sistemler üzerinde olumlu bir düzenleyici etkiye sahiptir. Tuina, farklı hedeflere göre hareket ederek hastalığın neden olduğu iltihabı ve ağrıyı hafifletebilir. Örneğin, TLR4 yolunu ve miRNA'y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390