무릎 골관절염의 나트륨 모노요오드아세트산 주사 유도 쥐 모델에 대한 Tuina 개입

요약

이 프로토콜은 무릎 골관절염(KOA)의 모노요오드아세트산 나트륨 주사 유도 쥐 모델에 대한 Tuina 개입 방법을 설명하며, 이는 KOA 동물 모델에서 Tuina의 적용에 대한 참조를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 KOA에 대한 Tuina의 효과적인 메커니즘을 연구하며, 그 결과는 그 적용을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

초록

흔한 퇴행성 관절 질환인 무릎 골관절염(KOA)은 만성 통증과 장애를 특징으로 하며, 이는 관절의 돌이킬 수 없는 구조적 손상으로 진행될 수 있습니다. 관절 연골, 근육, 활막 및 무릎 관절을 둘러싼 기타 조직 간의 연관성에 대한 조사는 매우 중요합니다. 현재 KOA 관리에는 생활 습관 수정, 운동, 약물 및 외과적 개입이 포함됩니다. 그러나 KOA 관련 통증의 기저에 있는 복잡한 메커니즘에 대한 해명은 아직 부족합니다. 결과적으로, KOA 통증은 여전히 중요한 임상적 과제이자 치료의 우선 순위로 남아 있습니다. 투이나는 운동계, 면역계, 내분비계에 조절 효과가 있는 것으로 밝혀져 염증 인자의 상향 조절로 인한 KOA 증상을 완화할 수 있는지, 더 나아가 골격근의 염증 인자가 KOA의 진행을 촉진할 수 있는지에 대한 탐구를 촉발했습니다.

32마리의 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐(180-220g)를 각각 8마리씩 4개 그룹, 즉 antiPD-L1+Tuina(그룹 A), 모델(그룹 B), Tuina(그룹 C) 및 가짜 수술(그룹 D)로 무작위 배정했습니다. 그룹 A, B, C의 경우 25μL의 모노요오드아세트산나트륨(MIA) 용액(25μL의 멸균 식염수로 희석한 MIA 4mg)을 오른쪽 무릎 관절강에 주입하고, 그룹 D의 경우 동일한 양의 멸균 생리식염수를 주입했습니다. 모든 그룹은 주사 전과 주사 후 2일, 9일, 16일 동안 스트레스가 가장 적은 테스트(발 기계적 금단 역치, 발 철수 열 잠복기, 오른쪽 무릎 관절 부종, Lequesne MG 점수, 피부 온도)를 사용하여 평가되었습니다.

서문

무릎 골관절염(KOA)은 만성 통증과 장애를 특징으로 하는 흔한 퇴행성 골관절염으로, 비교적 심한 골관절염은 관절에 돌이킬 수 없는 구조적 손상을 초래한다¹. KOA의 높은 세계적 유병률은 주요 글로벌 공중^{보건 과제가} 되었으며2,3 이는 환자의 삶의 질을 심각하게 손상시킨다^4,5. 연구에 따르면 KOA는 전 세계적으로 2억 6천만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치는 것으로 나타났습니다⁶. 인구 고령화로 인해 중국의 KOA 총 유병률은 40세 이상 17.0%에 달해 ^{7,8 감염자} 가족들에게 큰 부담이 되고 있다.

한의학에 따르면, KOA는 "마비"의 범주에 속하며^,9 황제의 내과 고전은 힘줄, 뼈 및 살을 마비와 연관시킵니다. 따라서 KOA에서 무릎 관절 주변의 연골, 근육, 활막 및 기타 조직 간의 연결에 주의를 기울여야 합니다. 현대의학에서는 관절염의 면역 항상성의 주요 구성 요소인 근육과 뼈의 염증이 관절염의 진행을 촉진합니다. 그러나 대부분의 연구는 골관절의 연골 염증과 활막 염증에 초점을 맞추고 있으며, 골격근의 염증 현상을 조사한 논문은 부족하다. 따라서 염증에서 골격근의 역할에 대한 더 많은 연구가 필요하며, KOA에 대한 보다 포괄적인 이해를 얻고 보다 효과적인 치료 방식에 대한 아이디어를 제공할 수 있습니다. 문헌 검토에서 면역 관련 인자 프로그램된 죽음 리간드 1(PD-L1)의 억제가 KOA 10,11의 진행을 악화시켰고, KOA 12 환자의 골격근에서^IL-15와 ^FOXO1의 차등 발현이 있었으며^, 말기 KOA 환자에서 상당한 골격근 염증이 있음을 확인했다. 이는 또한 걸음걸이의 변화와 관련이 있었습니다. 골격근은 IL-6와 같은 염증성 면역과 밀접한 관련이 있는 인자도 분비할 수 있으며, TNF-α도 PD-L1 경로 및 KOA^13,14,15와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다.

현재 KOA에 사용할 수 있는 치료법에는 체중 조절, 운동, 약물 및 수술이 포함되며, 일반적으로 관절 내 주사, 진통제, 관절경 수술, 무릎 보철 주위 절골술^{등이 포함된다 16}. 현재 KOA 질환의 진행은 완전히 멈추거나 되돌릴 수 없으며, KOA 통증의 기저에 있는 복잡한 기전을 명확하게 이해하지 못하면 KOA 환자는 진통제 남용 및 높은 부작용 발생률의 위험에 처해 있다⁸. 대부분의 치료 전략은 단기간에만 효과적이며 질병의 발병기전보다는 증상의 일시적인 완화에만 초점을 맞춥니다. 따라서 KOA 통증은 치료의 우선 순위이자 과제로 남아 있어 심각한 임상적 도전을 제기합니다. 그러나 Tuina는 KOA 치료에서 영향을 받은 관절 주변의 골격근을 직접 자극할 수 있으며 몇 가지 이점을 제공할 수 있습니다. 이전 설명과 결합하여 KOA에서 골격근 조직의 역할을 연구하는 이상적인 치료법이며 염증에서 골격근 조직의 역할을 명확히 하는 것도 KOA의 Tuina에 대한 더 나은 이론적 지원을 제공할 수 있습니다.

연구에 따르면 마사지 요법, 정골 수기 요법 및 척추 조작은 통증을 완화하고 신체 기능을 회복하는 데 도움이 될 수 있습니다^17,18. 이러한 조작은 국소 염증에 작용하고 외부 기계적 작용을 통해 경련과 진통을 완화할 수 있습니다. 무릎 인공관절 전치환술 후 통증을 완화하고, 진통제 사용을 줄이고, 수술 후 회복을 촉진하고, 생체역학적 균형을 개선할 수 있다¹⁹. 스웨덴 마사지는 골관절염 치료에 가능하며 스트레스를 줄이고 삶의 질을 향상시킬 수 있습니다²⁰. KOA에 대한 Tuina의 치료 효과는 특정 연구에 선행되었습니다.

본 연구팀은 쥐의 MIA 유도 KOA 모델을 기반으로 골격근에서 PD-L1 및 관련 염증 인자의 발현이 KOA를 유도하고 발달을 촉진할 수 있는지 여부를 탐구할 것입니다. 염증인자 발현 증가로 인한 KOA 증상을 완화할 수 있는지 확인하기 위해 투이나도 시행할 예정이다. Tuina는 KOA 발달과 통증에 영향을 미치는 골격근 염증에서 Tuina 매개 PD-1 경로 사이의 연관성을 입증하기 위해 PD-L1 억제와 결합되어 KOA에 대한 Tuina 개입의 치료 메커니즘에 대한 추가 다단계 연구의 토대를 마련할 것입니다.

요약하면, 본 논문은 KOA의 발병에 따른 골격근 염증의 메커니즘과 통증, KOA에 대한 Tuina의 치료 효과에 대한 조사 및 정교화를 면역 염증 인자 발현의 관점에서 설명하고, 행동 관련 지표와 결합하여 한의학의 "힘줄과 뼈의 불균형" 이론에 대한 현대 연구 증거를 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 상하이 중국 전통 의학 대학 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: SYXK2018-0040)의 승인 및 감독을 받았으며, 이는 세계 의학 협회 헬싱키 선언의 규정을 준수합니다.

1. 동물 준비

1. House 32 Sprague Dawley (SD) 수컷 쥐는 표준 설치류 펠릿 식단으로 24 ± 2 ° C 및 60 % 습도에서 12 시간 빛 / 12 시간 어두움주기 아래 특정 병원체가없는 하우징 장치에서 8 주 생후 180-220g입니다. 모든 동물실험은 실험동물의 복지윤리 및 동물실험안전규정을 준수한다.
2. 적응 섭식 1주일 후 쥐를 각각 8마리씩 4개 그룹(antiPD-L1+Tuina(그룹 A), 모델(그룹 B), Tuina(그룹 C) 및 가짜 수술(그룹 D)로 무작위 배정하고 케이지에 넣습니다.

2. 무릎에 요오드화아세트산일나트륨(MIA)의 관절 내 주사

참고: 그룹 D를 제외하고 KOA 랫트 모델은 모든 그룹에서 MIA의 무릎 관절강 주사로 준비됩니다. 그룹 D의 경우 25μL의 멸균 생리식염수를 오른쪽 무릎 관절강에 주입합니다.

1. 쥐를 마취 케이지에 넣은 다음 완전히 마취될 때까지 2.5% 이소플루란을 주입하여 마취합니다. 어린 쥐가 등을 대고 누워서 팔다리가 움직이지 않고 발가락 꼬집기(페달 반사), 손바닥 반사 및 근육 이완에 반응이 없는 시점을 기다려 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다.
2. 마취된 어린 쥐에게 애완 동물 눈 연고와 안약을 넣어 안구 건조를 방지하십시오.
3. 쥐의 오른쪽 뒷다리를 면도하고 요오드포와 75% 에탄올을 번갈아 가며 세 번 번갈아 사용하여 무릎 관절을 소독합니다.
4. 표준화된 실험 조건을 유지하려면 슬개골 인대가 위쪽을 향하도록 무릎 굴곡을 90°의 정확한 각도로 조심스럽게 고정합니다. 그 후, 25μL의 멸균 식염수 25μL에 희석된 MIA 4mg으로 구성된 MIA 용액 25μL를 쥐의 오른쪽 무릎 관절강에 주입합니다.
   참고: 이 주입은 특수 마이크로인젝터로 수행되어 절차^21,22,23에서 정확성과 일관성을 보장합니다. 쥐가 깨어날 때까지 다시 우리에 넣으십시오. 수술을 받은 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌아가지 않습니다.
5. 연구가 끝나면 1% 펜토바르비탈 나트륨을 100mg/kg 용량으로 주사하여 쥐를 안락사시킵니다.

3. Tuina 구현

알림: Tuina의 구현은 "힘줄과 뼈 불균형이 있는 환자의 경우 힘줄을 먼저 치료해야 한다"는 이론에 따라 진행됩니다. A군과 B군 모두 모델을 성공적으로 평가한 후 첫날에 중재를 시작했으며, 두 그룹 모두 14일 동안 하루에 한 번 수술을 받았다. 나머지 두 그룹은 아무런 개입 없이 14일 동안만 관찰되었습니다. 조작 작업자는 힘, 주파수 및 리듬의 일관성을 보장하기 위해 실험 전에 엄격하게 교육을 받아야 합니다.

1. EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 및 GB34(그림 1 및 표 1)를 포함한 쥐 경혈을 정확하게 찾아 실험적 침술²⁴를 사용하여 손가락 주무르기를 수행합니다.
2. 쥐 고정 장비에 엎드린 자세로 쥐를 고정합니다.
3. 조용해지고 하지가 이완되면 해당 사지의 EX-LE4와 ST35를 엄지와 검지로 동시에 4-분당 120회씩 140분 동안 반죽합니다.
4. SP10, ST34 및 무릎 관절 근처 근육에 초점을 맞춰 엄지와 검지로 120-140회/분으로 3분 동안 영향을 받은 사지의 전방 및 내측 근육을 반죽합니다. 쥐가 발버둥 치지 않도록 뻣뻣한 근육을 강렬하게 조작하는 것을 강조하십시오.
5. 엄지, 검지, 중지를 사용하여 분당 120-140회씩 3분 동안 영향을 받은 사지의 종아리 뒤쪽 근육을 위에서 아래로 주무릅니다. 치료 부위를 완전히 노출시키려면 약지와 새끼 손가락을 사용하여 환부의 발목 관절을 잡고 환부를 부드럽게 잡아당깁니다. SP9, GB34 및 무릎 관절 근처의 근육에 집중하고 쥐가 고군분투하지 않도록 경직된 근육과 강도에 중점을 둡니다.

4. 행동지수 측정

1. 족저 기계적 통증 역치 측정
   알림: MIA 주사 1일 전과 주사 후 2일, 9일, 16일에 발바닥 기계적 통증 역치를 측정합니다.
   1. 쥐를 스테인리스 스틸 격자 바닥과 플라스틱 케이지 본체가 있는 발바닥 시험실로 데려가 30분 동안 적응할 수 있는 실온(22 ± 2) °C의 조용한 환경에서 실험합니다.
   2. 직경 0.8mm의 플라스틱 테스트 바늘이 있는 전자 기계식 통증 테스터를 사용하여 쥐의 오른쪽 뒷발 중앙 영역을 수직으로 자극합니다. 쥐가 발 후퇴 및 회피 반응을 보일 때까지 자극 강도를 균일하고 점차적으로 증가시킵니다.
   3. 전자 화면의 판독값을 쥐의 오른쪽 발바닥 발바닥의 기계적 통증 역치로 기록합니다.
   4. 각 쥐를 5분 간격으로 5번 측정합니다.
   5. 5개 값에서 최대값과 최소값을 제거합니다. 절사 평균법을 통해 중간 세 값의 평균값을 결과로 취합니다(표 2).
2. 발 기계적 인출 임계값 측정
   알림: MIA 주입 1일 전, 주사 후 2일, 9일, 16일 후에 발 기계적 인출 임계값을 측정합니다.
   1. 쥐를 30°C 유리 바닥과 플라스틱 케이지 본체가 있는 가열된 발바닥 시험실로 데려가 실온(22 ± 2)°C의 조용한 환경에서 30분 동안 적응시킵니다.
   2. 쥐가 발 후퇴 및 회피 반응을 보일 때까지 자극 온도 65°C에서 광원 가열 장치로 오른쪽 뒷발바닥 중앙 부위를 자극합니다.
   3. 전자 화면의 시간 판독값을 쥐의 오른쪽 발바닥 열 통증 역치로 기록합니다.
   4. 각 쥐를 5분 간격으로 연속적으로 5번 측정합니다.
   5. 5개 값에서 최대값과 최소값을 제거합니다. 절사 평균법을 통해 중간 세 값의 평균값을 결과로 취합니다(표 3).

5. 오른쪽 무릎 관절의 붓기 측정

NOTE: MIA 주사 1일 전, 주사 후 2일, 9일, 16일 후에 쥐의 오른쪽 무릎 관절의 부종을 측정합니다.

1. 쥐를 마취 케이지에 넣고 완전히 마취될 때까지 2.5% 이소플루란에 노출시켜 마취합니다.
2. 쥐를 수술대의 평평한 위치에 놓습니다.
3. 버니어 캘리퍼스로 오른쪽 무릎 관절의 너비를 측정합니다(그림 2 및 표 4).

6. Lequesne MG 점수 측정

참고: MIA 주입 후 2일, 9일, 16일에 쥐의 Lequesne MG 점수를 측정합니다. Lequesne 등은 치료 개입의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있는 고관절 골관절염(ISH)의 중증도 지수를 개발했습니다. 통증 자극, 보행 변화, 관절 가동성, 관절 부종의 네 가지 매개변수를 고려합니다.

1. 실온(22 ± 2) °C의 조용한 환경에서 쥐를 조작 플랫폼으로 가져옵니다.
2. 두 명의 작업자가 서로 눈을 멀게 하여 국소 통증 자극 반응, 보행 변화, 관절 움직임 및 관절 부종을 측정하도록 합니다.
   1. 플라스틱 테스트 바늘로 오른쪽 무릎 관절의 측면을 자극하고 반응에 따라 0-3의 척도로 점수를 매깁니다. 0 응답 없음; 3 좋은 반응; 1 영향을 받는 사지의 수축; 2 영향을 받은 팔다리의 수축 및 경련, 떨림, 핥기, 빨기와 같은 경미한 전신 반응을 동반함.
   2. 쥐를 수술대에 놓고 오른쪽 뒷다리의 걸음걸이를 관찰합니다. 응답에 따라 0-3의 척도로 점수를 매깁니다. 0 영향을 받은 팔다리의 움직임에 방해가 없고, 정상적으로 달리며, 강한 발놀림을 해야 합니다. 3 영향을 받은 팔다리는 걷거나, 땅에 닿거나, 땅을 밟을 수 없습니다. 1 강한 발구르기로 달리는 동안 가벼운 트레킹; 2 감염된 팔다리는 걷기에 참여하지만 쥐의 움직임 (트레킹)에 방해가 분명합니다.
   3. 쥐의 오른쪽 무릎 관절을 손으로 구부리고 펴서 관절 가동성을 관찰합니다. 응답에 따라 0-3의 척도로 점수를 매깁니다. 0 90° 이상의 관절 가동 각도; 3 관절 가동 각도 15° 미만; 1 관절 이동성 각도 또는 45 ° -90 °; 15°-45°의 2개의 관절 이동성.
   4. 쥐의 오른쪽 무릎 관절을 만지고 반응을 정상 쥐의 반응과 비교합니다. 응답에 따라 0-2의 척도로 점수를 매깁니다. 0 뚜렷한 부종과 눈에 띄는 뼈 표시가 없습니다. 2 뚜렷한 부종과 뼈 자국 없음; 1 경미한 부기 및 표재성 뼈 표시.
   5. 이 점수를 추가하여 각 쥐에 대한 Lequesne MG 점수를 생성하고 trimmed 방법을 통해 평균값을 계산합니다(표 5).

7. 피부 온도 측정

알림: MIA 주사 1일 전과 주사 후 9일과 16일에 피부 온도를 측정하십시오.

1. 쥐를 마취 케이지에 넣은 다음 완전히 마취될 때까지 이소플루란을 주입하여 마취합니다.
2. 쥐를 실온(22 ± 2) °C에서 수술대의 측면 위치에 놓습니다.
3. 손으로 발을 부드럽게 잡아 오른쪽 무릎 관절을 곧게 펴십시오. Filr 적외선 카메라를 사용하여 피부 온도를 측정하는 사진.
4. 지원 편집 소프트웨어를 사용하여 쥐의 무릎 관절과 무릎 관절 주변의 피부 온도를 읽습니다. 발목 관절과 무릎 관절에 온도가 서서히 내려가는 조절점을 설정합니다.

8. 통계 분석

1. 통계 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 사분위수로 표현할 수 있습니다.
2. 평균 절사 방법을 사용하여 특이치를 처리합니다. 행동 테스트의 결과는 평균의 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다.
3. 그룹 간 비교를 위해 독립 표본 t-검정을 수행합니다. 이원 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 사용한 후 Bonferroni의 다중 비교 검정을 사용하여 행동 데이터를 분석합니다. 데이터가 정규성 또는 동질성을 나타내지 않는 경우 비모수 검정(Kruskal-Wallis k 표본)을 수행합니다.
   참고: P < 0.05 는 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 나타냅니다. 모든 데이터는 적용되는 통계 검정의 가정을 충족합니다.

결과

설명된 프로토콜은 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine의 임상 환경에서 구현되었습니다. 그림 1은 쥐에서 밀어 넣은 경혈의 정확한 위치를 보여주며, 표 1 은 이러한 점을 자극하는 일반적인 이점을 보여줍니다. 표 2 및 표 3 은 PD-1 경로 억제가 없는 경우에도 Tuina 요법을 통해 달성된 주목할 만한 통증 완화에 대한 강?...

토론

본 연구는 표준화된 행동지표를 이용하여 투이나의 중재 후 KOA의 개선을 평가하고, KOA에 대한 투이나의 기전과 골격근과 KOA의 연관성을 조사하는 것을 목적으로 한다. 약물 및 수술 요법과 달리 Tuina는 운동계, 면역계 및 내분비계에 긍정적인 조절 효과가 있습니다. Tuina는 다양한 표적에 작용하여 질병으로 인한 염증과 통증을 완화할 수 있습니다. 예를 들어, TLR4 경로와 miRNA를 조절함으로써 신경?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390