התערבות Tuina בהזרקת נתרן מונויודואצטט מודל חולדה של אוסטיאוארתריטיס בברך

Summary

פרוטוקול זה מתאר את שיטות ההתערבות של Tuina במודל חולדה הנגרמת על ידי הזרקת נתרן מונויודואצטט של דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA), המספק התייחסות ליישום של Tuina במודלים של בעלי חיים KOA. פרוטוקול זה גם לומד את המנגנון היעיל של Tuina עבור KOA, והתוצאות יסייעו לקדם את יישומו.

Abstract

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA), הפרעת מפרקים ניוונית נפוצה, מאופיינת בכאב כרוני ונכות, שיכולים להתקדם לנזק מבני בלתי הפיך של המפרק. מחקרים על הקשר בין סחוס מפרקי, שרירים, סינוביום, ורקמות אחרות סביב מפרק הברך ב- KOA הם בעלי חשיבות רבה. כיום, ניהול KOA כולל שינויים באורח החיים, פעילות גופנית, תרופות והתערבויות כירורגיות; עם זאת, הבהרת המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס כאב הקשור ל- KOA עדיין חסרה. כתוצאה מכך, כאב KOA נותר אתגר קליני מרכזי ועדיפות טיפולית. טווינה נמצאה כבעלת השפעה רגולטורית על המערכת המוטורית, החיסונית והאנדוקרינית, מה שהוביל לחקירה האם טווינה יכולה להקל על תסמיני KOA, הנגרמים על ידי הגברת הרגולציה של גורמים דלקתיים, ויתרה מכך, אם הגורמים הדלקתיים בשרירי השלד יכולים להגביר את התקדמות KOA.

חילקנו באקראי 32 חולדות זכרים מסוג Sprague Dawley (SD) (180-220 גרם) לארבע קבוצות של שמונה בעלי חיים כל אחת: antiPD-L1+Tuina (קבוצה A), מודל (קבוצה B), Tuina (קבוצה C) וניתוחי דמה (קבוצה D). עבור קבוצות A, B ו-C, הזרקנו 25 מיקרוליטר של תמיסת נתרן מונויודואצטט (MIA) (4 מ"ג MIA מדולל ב-25 מיקרוליטר של תמיסת מלח סטרילית) לחלל מפרק הברך הימני, ובקבוצה D הוזרק אותו כמות של מלח פיזיולוגי סטרילי. כל הקבוצות הוערכו באמצעות הבדיקות הכי פחות מלחיצות ביותר (סף נסיגה מכני של כפה, חביון תרמי של נסיגת כפות, נפיחות במפרק הברך הימני, ציון Lequesne MG, טמפרטורת העור) לפני ההזרקה ו -2, 9 ו -16 ימים לאחר ההזרקה.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) היא דלקת מפרקים ניוונית נפוצה, המאופיינת בכאב כרוני ונכות, ו- KOA חמור יחסית יוביל לנזק מבני בלתי הפיך למפרק¹. השכיחות העולמית הגבוהה של KOA הפכה לאתגר עולמי גדול בתחום בריאות הציבור ^2,3, הפוגע קשות באיכות החיים של חולים ^4,5. מחקרים הראו כי KOA משפיע על יותר מ -260 מיליון אנשים ברחבי העולם⁶. עם הזדקנות האוכלוסייה, שיעור השכיחות הכולל של KOA בסין הוא גבוה עד 17.0% מעל גיל 40, מה שמטיל נטל כבד על משפחותיהם של אלה שנפגעו ^7,8.

על פי הרפואה הסינית, KOA שייך לקטגוריה של "שיתוק"⁹, והקלאסיקה של הקיסר הצהוב לרפואה פנימית מקשרת גידים, עצמות ובשר עם שיתוק. לכן, אנחנו צריכים לשים לב לקשר בין הסחוס, שריר, סינוביום, כמו גם רקמות אחרות סביב מפרק הברך ב KOA. ברפואה המודרנית, הן דלקת שרירים והן דלקת עצמות, שהם המרכיבים העיקריים של ההומאוסטזיס החיסוני של דלקת פרקים, מניעים את התקדמות כאבי KOA. עם זאת, מרבית המחקרים מתמקדים בדלקות סחוס ודלקות סינוביאליות במפרקי העצם, וקיים מיעוט מאמרים הבוחנים תופעות דלקתיות בשרירי השלד. לכן, יש צורך במחקר נוסף על תפקיד שרירי השלד בדלקת כדי להשיג הבנה מקיפה יותר של KOA ולספק רעיונות לשיטות טיפול יעילות יותר. בסקירת הספרות, מצאנו כי עיכוב של ליגנד המוות המתוכנת של גורם הקשור למערכת החיסון 1 (PD-L1) החמיר את ההתקדמות של KOA^10,11 וכי היה ביטוי דיפרנציאלי של IL-15 ו- FOXO1 בשרירי השלד של חולים עם KOA¹², כמו גם דלקת שרירי שלד משמעותית בחולים עם KOA סופני^, אשר היה קשור גם עם שינויים בהליכה. הוכח כי שריר השלד יכול גם להפריש גורמים הקשורים קשר הדוק לחסינות דלקתית כגון IL-6, וכי TNF-α קשור קשר הדוק גם למסלול PD-L1 ו- KOA^13,14,15.

נכון לעכשיו, טיפולים זמינים עבור KOA כוללים בקרת משקל, פעילות גופנית, תרופות, וניתוח, אשר בדרך כלל כוללים זריקות תוך מפרקיות, תרופות משככי כאבים, ניתוח ארתרוסקופי, אוסטאוטומיה periprosthetic של הברך¹⁶. נכון לעכשיו, לא ניתן לעצור או להפוך לחלוטין את התקדמות מחלת KOA, וללא הבנה ברורה של המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס כאבי KOA, חולי KOA נמצאים בסיכון לשימוש יתר בתרופות משככות כאבים ולשכיחות גבוהה של תופעות לוואי⁸. רוב אסטרטגיות הטיפול יעילות רק לתקופות קצרות ומתמקדות רק בהקלה זמנית של הסימפטומים ולא בפתוגנזה של המחלה. לכן, כאב KOA נשאר בראש סדר העדיפויות ואתגר לטיפול, ומציב אתגר קליני רציני. עם זאת, Tuina יכול ישירות לעורר את שרירי השלד סביב המפרק הפגוע בטיפול KOA והוא יכול לספק כמה יתרונות. בשילוב עם התיאור הקודם, זהו הטיפול האידיאלי ללמוד את תפקידה של רקמת שריר השלד ב- KOA, והבהרת תפקידה של רקמת שריר השלד בדלקת יכולה גם לספק תמיכה תיאורטית טובה יותר לטוינה של KOA.

מחקרים הראו כי טיפול בעיסוי, טיפול מניפולטיבי אוסטאופתי ומניפולציה בעמוד השדרה יכולים לעזור להקל על הכאב ולהחזיר את תפקוד הגוף^17,18. מניפולציות אלה יכולות לפעול על דלקת מקומית ולהקל על עוויתות ושיכוך כאבים באמצעות פעולה מכנית חיצונית. הם יכולים להקל על הכאב לאחר ארתרופלסטיקה מלאה של הברך, להפחית את השימוש בתרופות משככי כאבים, לקדם התאוששות לאחר הניתוח, ולשפר את האיזון הביומכני¹⁹. עיסוי שוודי אפשרי בטיפול בדלקת מפרקים ניוונית ויכול להפחית מתח ולשפר את איכות החיים²⁰. להשפעה הטיפולית של טווינה על KOA קדמו מחקרים מסוימים.

בניסוי זה, הצוות שלנו יחקור אם הביטוי של PD-L1 וגורמים דלקתיים קשורים בשרירי השלד יכול לגרום ל-KOA ויקדם את פיתוחו בהתבסס על מודל KOA המושרה על ידי MIA בחולדות. Tuina ייושם גם כדי לראות אם זה יכול להקל על תסמיני KOA הנגרמים על ידי ביטוי מוגבר של גורמים דלקתיים. Tuina ישולב עם עיכוב PD-L1 כדי להדגים את הקשר בין מסלול PD-1 בתיווך Tuina בדלקת שרירי השלד המשפיעה על התפתחות KOA וכאב, ותניח את הבסיס למחקרים רב-שכבתיים נוספים על המנגנונים הטיפוליים של התערבות Tuina ב- KOA.

לסיכום, מאמר זה מתאר את החקירה וההרחבה של מנגנוני דלקת שרירי השלד בהתפתחות KOA והכאב שלה, כמו גם את ההשפעות הטיפוליות של Tuina על KOA, מנקודת מבט של ביטוי גורמים דלקתיים חיסוניים, בשילוב עם אינדיקטורים הקשורים להתנהגות, כדי לספק ראיות מחקריות מודרניות לתיאוריית "חוסר האיזון של גידים ועצמות" ברפואה הסינית המסורתית.

Protocol

כל הניסויים אושרו ופוקחו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (מספר אישור: SYXK2018-0040), התואמת את התנאים בהצהרת הלסינקי של ההסתדרות הרפואית העולמית.

1. הכנת בעלי חיים

1. בית 32 Sprague Dawley (SD) חולדות זכרים בני 8 שבועות ובמשקל 180-220 גרם במכשיר דיור ספציפי ללא פתוגנים תחת 12 שעות אור/12 שעות מחזורים כהים ב 24 ± 2 ° C ו 60% לחות עם דיאטה סטנדרטית כדורי מכרסמים. כל פעולות הניסוי בבעלי חיים עומדות באתיקה של רווחת חיות ניסוי ובתקנות בטיחות ניסויים בבעלי חיים.
2. חילקו חולדות באופן אקראי לכלוב לארבע קבוצות של שמונה בעלי חיים כל אחת לאחר שבוע אחד של האכלה אדפטיבית: antiPD-L1+Tuina (קבוצה A), מודל (קבוצה B), Tuina (קבוצה C) וניתוח דמה (קבוצה D).

2. הזרקה תוך מפרקית של מונוסודיום יודואצטט (MIA) בברך

הערה: למעט קבוצה D, מודל חולדת KOA יוכן על ידי הזרקת חלל מפרק הברך של MIA בכל הקבוצות. עבור קבוצה D, יש להזריק 25 μL של מלח פיזיולוגי סטרילי לחלל מפרק הברך הימני.

1. הרדימו את החולדה על ידי הכנסתה לכלוב הרדמה ולאחר מכן החדרת 2.5% איזופלורן עד להרדמה מלאה. ודאו שהחיה מורדמת לחלוטין על ידי המתנה לנקודה שבה החולדה הצעירה שוכבת על גבה, גפיה מפסיקות לזוז, ואין תגובה בצביטה בבוהן (רפלקס פדלים), רפלקס מישוש והרפיית שרירים.
2. הוסיפו משחת עיניים לחיות מחמד וטיפות עיניים לחולדות הצעירות המורדמות כדי למנוע יובש בעיניים.
3. לגלח את הגפה האחורית הימנית של החולדות ולחטא את מפרק הברך עם שלושה סיבובים לסירוגין של יודופור ו 75% אתנול.
4. כדי לשמור על מצב ניסוי סטנדרטי, קבע בזהירות את כיפוף הברך בזווית מדויקת של 90°, וודא שהרצועה הפטלרית מכוונת כלפי מעלה. לאחר מכן, להזריק 25 μL של תמיסת MIA, המורכבת מ 4 מ"ג של MIA מדולל ב 25 μL של תמיסת מלח סטרילית לתוך חלל מפרק הברך הימני של החולדות.
   הערה: הזרקה זו בוצעה עם מיקרו-מזרק מיוחד, המבטיח דיוק ועקביות בהליך^21,22,23. החזירו את החולדות לכלובים עד שיתעוררו. בעל החיים שעבר ניתוח אינו מוחזר לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
5. בסוף המחקר, הרדימו את החולדות על ידי הזרקת 1% נתרן pentobarbital כמינון של 100 מ"ג / ק"ג.

3. יישום טווינא

הערה: היישום של Tuina יונחה על ידי התיאוריה כי "עבור חולים עם חוסר איזון גידים ועצמות, גידים צריכים להיות מטופלים הראשון". שתי הקבוצות A ו-B החלו את ההתערבות ביום הראשון לאחר ההערכה המוצלחת של המודל, ושתי הקבוצות נותחו פעם ביום במשך 14 יום. שתי הקבוצות הנותרות נצפו במשך 14 יום בלבד ללא כל התערבות. מפעילי המניפולציה חייבים להיות מאומנים בקפידה לפני הניסוי כדי להבטיח את עקביות הכוח, התדר והקצב.

1. אתר במדויק את נקודת הדיקור של החולדות, כולל EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 ו-GB34 (איור 1 וטבלה 1), שבה שיטות לישת אצבעות יבוצעו באמצעות דיקור ניסיוני²⁴.
2. תקן את החולדה במצב נוטה על ציוד קיבוע חולדה.
3. לאחר שקט והגפיים התחתונות רגועות, לשו את EX-LE4 ו- ST35 של הגפה הפגועה עם האגודל והאצבע המורה בו זמנית למשך 4 דקות במהירות 120-140 פעמים לדקה.
4. יש ללוש את השרירים הקדמיים והמדיאליים-צדדיים של הגפה הפגועה עם האגודל והאצבע המורה למשך 3 דקות במהירות של 120-140 פעמים לדקה, תוך התמקדות ב-SP10, ST34 ובשרירים הסמוכים למפרק הברך. הדגישו את המניפולציה של אותם שרירים נוקשים בעוצמה, כך שהחולדה לא תיאבק.
5. ללוש את שרירי השוק האחוריים של הגפה הפגועה מלמעלה למטה במשך 3 דקות במהירות 120-140 פעמים לדקה באמצעות האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית. כדי לחשוף באופן מלא את אזור הטיפול, השתמש באצבע הקמיצה ובאצבע הקטנה כדי להחזיק את מפרק הקרסול של הגפה הפגועה ולמשוך בעדינות את האיבר הפגוע. התמקדו ב-SP9, GB34 ובשרירים הסמוכים למפרק הברך עם דגש על השרירים הנוקשים והעוצמה כדי שהחולדה לא תתקשה.

4. מדידת מדד התנהגותי

1. מדידת סף כאב מכני פלנטרי
   הערה: יש למדוד את ספי הכאב המכניים של הכפית יום אחד לפני הזרקת MIA וכן 2, 9 ו-16 ימים לאחר ההזרקה.
   1. הביאו את החולדות לחדר בדיקה פלנטרי עם תחתית רשת מנירוסטה וגוף כלוב פלסטיק בסביבה שקטה בטמפרטורת החדר (22 ± 2) מעלות צלזיוס למשך 30 דקות של הסתגלות.
   2. השתמש בבודק כאב מכני אלקטרוני עם מחט בדיקה פלסטית בקוטר 0.8 מ"מ כדי לגרות את האזור המרכזי של כף הרגל האחורית הימנית של החולדות בצורה אנכית. מגבירים באופן שווה והדרגתי את עוצמת הגירוי עד שהחולדות מראות תגובות של נסיגת כפות והימנעות.
   3. הקלט את קריאת המסך האלקטרוני כסף הכאב המכני של כף הרגל הפלנטרית הימנית של החולדה.
   4. מדדו כל חולדה פי 5 במרווחים של 5 דקות.
   5. הסר את ערכי המקסימום והמינימום מחמשת הערכים. קח את הערך הממוצע של שלושת הערכים האמצעיים בשיטת הממוצע החתוך כתוצאה (טבלה 2).
2. מדידת סף משיכה מכני של כפות הרגליים
   הערה: יש למדוד את סף המשיכה המכנית של כפות הרגליים יום אחד לפני הזרקת MIA, 2, 9 ו-16 ימים לאחר ההזרקה.
   1. הביאו את החולדות לחדר בדיקה פלנטרי מחומם עם תחתית זכוכית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס וגוף כלוב פלסטיק בסביבה שקטה בטמפרטורת החדר (22 ± 2) מעלות צלזיוס למשך 30 דקות של הסתגלות.
   2. עוררו את אזור מרכז הפלנטר האחורי הימני באמצעות מכשיר חימום מקור אור בטמפרטורת גירוי של 65 מעלות צלזיוס עד שהחולדה מראה תגובת נסיגה והימנעות מכפה.
   3. הקלט את קריאת הזמן של המסך האלקטרוני כסף הכאב התרמי הפלנטרי הנכון של החולדה.
   4. מדדו כל חולדה פי 5 ברציפות במרווחים של 5 דקות.
   5. הסר את ערכי המקסימום והמינימום מחמשת הערכים. קח את הערך הממוצע של שלושת הערכים האמצעיים בשיטת הממוצע החתוך כתוצאה (טבלה 3).

5. מדידת נפיחות במפרק ברך ימין

הערה: מדדו את הנפיחות של מפרק הברך הימני של חולדות יום אחד לפני הזרקת MIA, 2, 9 ו-16 ימים לאחר ההזרקה.

1. מרדימים את החולדה על ידי הכנסתה לכלוב הרדמה וחשיפתה לאיזופלורן 2.5% עד להרדמה מלאה.
2. הניחו את החולדה במצב שטוח על שולחן הניתוחים.
3. מדדו את רוחב מפרק ברך ימין בעזרת קליפרים של ורנייה (איור 2 וטבלה 4).

6. מדידת ציון Lequesne MG

הערה: מדדו את ציון Lequesne MG בחולדות ב-2, 9 ו-16 ימים לאחר הזרקת MIA. Lequesne et al פיתחו מדד של חומרה עבור osteoarthritis עבור הירך (ISH), אשר ניתן להשתמש בו כדי להעריך את היעילות של התערבויות טיפוליות. אנו לוקחים בחשבון ארבעה פרמטרים: גירוי כאב, שינוי הליכה, תנועתיות מפרקים ונפיחות במפרקים.

1. הביאו את החולדות לפלטפורמת מניפולציה בסביבה שקטה בטמפרטורת החדר (22 ± 2) מעלות צלזיוס.
2. בקשו משני מפעילים, עיוורים זה לזה, למדוד את תגובת גירוי הכאב המקומי, שינוי ההליכה, תנועת המפרקים ונפיחות המפרקים.
   1. לגרות את הצד הצידי של מפרק ברך ימין עם מחט בדיקה פלסטית ולקבל ציון בסולם של 0-3 בהתאם לתגובה. 0 אין תגובה; 3 תגובה טובה; 1 התכווצות של האיבר הפגוע; 2 התכווצות ועווית של האיבר הפגוע, מלווה בתגובות כלליות קלות, כגון רעד, ליקוק ומציצה.
   2. הניחו את החולדה על שולחן הניתוחים והתבוננו בהליכה של גפיה האחוריות הימניות. ציון בסולם של 0-3 בהתאם לתגובה. 0 אין הפרעה בתנועת הגפה הפגועה, ריצה רגילה ועבודת רגליים חזקה; 3 האיבר הפגוע אינו יכול להשתתף בהליכה, לגעת בקרקע או לדרוך על הקרקע; 1 טרקים קלים במהלך ריצה עם דריכות חזקות; 2 האיבר הפגוע משתתף בהליכה, אך ההפרעה בתנועה של החולדות (טרקים) ברורה.
   3. כופפו והרחיבו את מפרק הברך הימני של החולדה ביד והתבוננו בניידות המפרק. ציון בסולם של 0-3 בהתאם לתגובה. 0 זווית ניידות משותפת של יותר מ-90°; 3 זווית ניידות משותפת של פחות מ-15°; זווית ניידות משותפת אחת או 45°-90°; 2 זווית תנועתיות מפרקים של 15°-45°.
   4. געו במפרק הברך הימני של החולדה והשוו את התגובה לזו של חולדה רגילה. ציון בסולם של 0-2 בהתאם לתגובה. 0 אין נפיחות ברורה וסימנים גרמיים גלויים; 2 נפיחות מסומנת וללא סימנים גרמיים; 1 נפיחות קלה וסימנים גרמיים שטחיים.
   5. הוסף ציונים אלה כדי להפיק את ציון Lequesne MG עבור כל חולדה וחשב את הערך הממוצע באמצעות שיטת החיתוך (טבלה 5).

7. מדידת טמפרטורת העור

הערה: יש למדוד את טמפרטורת העור יום אחד לפני הזרקת MIA ו-9 ו-16 ימים לאחר ההזרקה.

1. מרדימים את החולדה על ידי הכנסתה לכלוב הרדמה ולאחר מכן החדרת איזופלורן עד שהיא מורדמת במלואה.
2. הניחו את החולדה במצב רוחבי על שולחן הניתוחים, בטמפרטורת החדר (22 ± 2) מעלות צלזיוס.
3. יישרו את מפרק ברך ימין על ידי אחיזה עדינה בכף הרגל עם היד. צלם כדי לקבוע את טמפרטורת העור באמצעות מצלמת אינפרא אדום Filr.
4. קרא את טמפרטורת העור של מפרק הברך וסביב מפרק הברך של החולדה באמצעות תוכנת עריכה תומכת. הגדר נקודות בקרה במפרק הקרסול ובמפרק הברך שבהן הטמפרטורה יורדת בהדרגה.

8. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבטא את נתוני הניסוי ברביעונים.
2. השתמש בשיטת ממוצע החיתוך כדי להתמודד עם החריגים. התוצאות של מבחנים התנהגותיים מצוינות כממוצע ± טעות התקן של הממוצע.
3. ביצוע בדיקות t של דגימות בלתי תלויות להשוואה בין קבוצות. נתח את הנתונים ההתנהגותיים באמצעות ניתוח דו-כיווני חוזר של שונות (ANOVA), ואחריו מבחני השוואה מרובים של Bonferroni. כאשר הנתונים אינם מפגינים נורמליות או הומוסדסטיות, בצע בדיקה לא פרמטרית (Kruskal-Wallis k samples).
   הערה: P < 0.05 מציין שההבדלים מובהקים סטטיסטית. כל הנתונים עומדים בהנחות היסוד של המבחנים הסטטיסטיים המיושמים.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר יושם במסגרת קלינית בבית החולים Yueyang לרפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת. איור 1 מראה את המיקום המדויק של נקודות הדיקור שנדחפו בחולדות, וטבלה 1 מדגימה את היתרונות המשותפים של גירוי הנקודות האלה. טבלה 2 וטבלה 3 מציעות ראיות משכנעות ...

Discussion

מחקר זה נועד להעריך את השיפור של KOA לאחר התערבות Tuina באמצעות אינדיקטורים התנהגותיים סטנדרטיים ולחקור את המנגנונים של Tuina עבור KOA ואת הקשר בין שרירי השלד ו- KOA. שלא כמו טיפולים תרופתיים וכירורגיים, לטוינה יש השפעה רגולטורית חיובית על המערכת המוטורית, החיסונית והאנדוקרינית. Tuina יכול להקל על דל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390