Tratamiento con acupuntura en un modelo murino de disfunción cognitiva inducida por hipoxia crónica

Resumen

En este trabajo se describe un protocolo para la implementación de un tratamiento con anestesia leve y acupuntura en un modelo murino de hipoxia crónica y la realización de pruebas conductuales para evaluar las alteraciones cognitivas post-tratamiento.

Resumen

El tratamiento de los trastornos del sistema nervioso central ha planteado constantemente importantes desafíos en el campo de la medicina. La acupuntura, una práctica no farmacológica arraigada en la medicina tradicional china, implica la inserción de agujas finas en puntos precisos del cuerpo y se emplea comúnmente para el manejo de diversas afecciones. Recientemente, la acupuntura ha surgido como una intervención terapéutica prometedora para una variedad de enfermedades neurológicas, incluida la ansiedad y los trastornos respiratorios. Sin embargo, aún no se ha explorado el potencial de la acupuntura en el tratamiento de la disfunción cognitiva inducida por la hipoxia crónica. Este artículo presenta un protocolo completo para establecer un modelo de ratón de deterioro cognitivo crónico inducido por hipoxia, administrar anestesia suave, realizar un tratamiento de acupuntura y evaluar los cambios de comportamiento y las habilidades de memoria utilizando pruebas de campo abierto y laberintos de agua. El protocolo paso a paso proporciona instrucciones detalladas sobre cómo localizar y posicionar con precisión los puntos de acupuntura y las agujas para mejorar la cognición. Al emplear este protocolo, los investigadores pueden realizar estudios sistemáticos para evaluar a fondo el potencial terapéutico de la acupuntura para la disfunción cognitiva.

Introducción

La población mundial se enfrenta actualmente a un problema crítico de envejecimiento, lo que resulta en un rápido aumento en la prevalencia de trastornos cognitivos. La incidencia mundial de deterioro cognitivo es de aproximadamente 53,97 por cada 1000 años-persona¹. La hipoxia cerebral crónica causada por disfunción vascular o trastornos circulatorios/respiratorios sigue siendo uno de los principales factores de riesgo para la demencia relacionada con la edad². Estudios previos han demostrado que la hipoxia cerebral puede aumentar el depósito de amiloide β mediante la modificación de la expresión de BACE1³. Además, la hipoxia se ha asociado con la desregulación de las células gliales y la neuroinflamación ^4,5. A pesar de la creciente magnitud de este problema, actualmente faltan medicamentos occidentales eficaces para prevenir el deterioro cognitivo crónico inducido por la hipoxia. La medicina tradicional china no farmacológica, en particular la acupuntura, se ha utilizado durante miles de años para tratar trastornos cognitivos y ha mostrado resultados prometedores en el alivio de enfermedades neurodegenerativas ^6,7. Los puntos de acupuntura Baihui, Shenting y Zusanli son puntos efectivos para el tratamiento de la disfunción cognitiva ^8,9. Los estudios clínicos han demostrado que la terapia de electroacupuntura mejora significativamente las puntuaciones de la Evaluación Cognitiva de Montreal (MoCA) y el Miniexamen del Estado Mental (MMSE) en pacientes con deterioro cognitivo vascular y mejora eficazmente la disfunción cognitiva⁸. Aunque los estudios han sugerido que la acupuntura puede mejorar significativamente la capacidad de memoria de las ratas con ligadura arterial^{, no} hay informes sobre los efectos de la acupuntura en ningún modelo de roedor con trastornos cognitivos crónicos inducidos por hipoxia. La falta de investigación sobre el mecanismo ha impedido considerablemente su aplicación clínica.

Investigaciones anteriores han demostrado que someter a ratas a un ambiente hipóxico durante un período de 8 semanas puede elevar significativamente los niveles de estrés oxidativo e inflamación en el cerebro, lo que resulta en una disminución de^{la función de} la memoria. El presente estudio tiene como objetivo investigar el impacto de la acupuntura en modelos de roedores con el fin de ampliar nuestra comprensión. Vale la pena señalar, sin embargo, que la anestesia generalmente se requiere durante el tratamiento de acupuntura en roedores debido a la posibilidad de agitación durante la estimulación repetida. La anestesia prolongada puede afectar significativamente la función cognitiva en ratones, ya que la mayoría de los fármacos anestésicos pueden suprimir la actividad neuronal e impedir el procesamiento de la información, lo que conduce a déficits conductuales¹². Varios estudios han demostrado que la administración de sevoflurano al 2,5% durante 6 h puede perjudicar notablemente la memoria espacial, la capacidad de aprendizaje y la atención en ratones¹³. Además, la evidencia sugiere que altas dosis de anestesia pueden provocar la muerte neuronal o daño nervioso en ratones¹⁴. Por lo tanto, es imperativo identificar un enfoque adecuado para minimizar la cantidad total de anestesia utilizada. En este estudio, presentamos un método de acupuntura eficaz para tratar ratones con deterioro cognitivo, junto con pruebas de comportamiento para evaluar sus capacidades de memoria. Es importante destacar que presentamos una técnica de anestesia previa al tratamiento modificada que puede reducir eficazmente la dosis total de anestesia administrada durante el experimento.

Protocolo

Los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Investigación y Ética Animal del Instituto de Investigación Médica Yiling de Hebei (número de aprobación: N2022148). Los ratones machos C57BL/6J con un peso de 18-22 g (ver Tabla de materiales) se alojaron en el centro de evaluación de nuevos fármacos del Instituto de Investigación Médica de Hebei Yiling. Se les proporcionó comida normal y agua limpia y se les expuso a luz artificial durante 12 horas diarias. Las habitaciones mantuvieron un rango de temperatura controlado de 20-26 °C y una humedad relativa del 40%-70%.

1. Establecimiento de un modelo murino de hipoxia crónica (Figura 1)

1. Antes de comenzar el experimento, prepare las jaulas de los animales bajo presión atmosférica normal y las jaulas con un ambiente continuo con poco oxígeno. Establezca un entorno continuo con bajo contenido de oxígeno mediante la utilización de un sistema automatizado de suministro de control de gas para enjuagar la cámara con una mezcla de oxígeno puro y nitrógeno.
   NOTA: Este sistema está programado para controlar el interruptor de la válvula electromagnética, lo que garantiza un suministro preciso de gas en términos de tiempo y concentración.
2. Divida aleatoriamente a los ratones en tres grupos: un grupo de control (Con), un grupo modelo (CH) y un grupo de electroacupuntura (EA + CH). Coloque los ratones de control y de modelo/electroacupuntura por separado en las dos jaulas, con 10 ratones por jaula. Mantenga el ciclo de luz a 12 h/12 h (claro/oscuro).
   NOTA: No se induce tratamiento ni hipoxia en el grupo control (Con). El grupo modelo (CH) está formado por ratones con hipoxia crónica. El grupo de electroacupuntura (EA + CH) comprende ratones inducidos por hipoxia tratados con electroacupuntura.
3. Para desarrollar hipoxia crónica, establezca los parámetros de la cámara de bajo oxígeno utilizando un medidor de oxígeno digital para regular el caudal de gas y mantener una concentración de oxígeno del 10%. Colocar a los animales dentro de la cámara de bajo oxígeno a las 9:00 am y retirarlos a las 5:00 pm, dando como resultado un total de 8 h de exposición ininterrumpida a bajo oxígeno por día durante 3 meses.
   NOTA: Al configurar el suministro de gas nitrógeno para reducir la concentración de oxígeno, se recomienda proceder lentamente para evitar una introducción excesiva de gas nitrógeno de una vez, ya que provocará la muerte de animales.
4. Evaluar el modelo de disfunción cognitiva inducida por hipoxia crónica mediante examen histológico y pruebas conductuales: la prueba de campo abierto¹⁵ y la prueba del laberinto de agua¹⁶.

2. Anestesia (Figura 2)

1. Prepare la máquina de anestesia para animales pequeños (consulte la tabla de materiales) y la almohadilla térmica de temperatura constante.
   NOTA: Durante la anestesia, los animales son susceptibles a la hipotermia, lo que subraya la necesidad de emplear una almohadilla térmica a temperatura constante para el aislamiento.
2. Coloque el ratón en la caja de inducción de anestesia e induzca rápidamente con isoflurano al 2%-2,5% en oxígeno (ver Tabla de Materiales) durante aproximadamente 1 min.
   NOTA: Este pretratamiento a corto plazo es un paso crucial para garantizar que los ratones puedan prosperar bajo dosis de baja concentración durante un período prolongado de tiempo.
3. Una vez que su excitabilidad disminuya, pellizca el dedo del pie del ratón para comprobar su reflejo. A continuación, transfiera el ratón a la almohadilla térmica de temperatura constante (37 °C).
4. Ajuste el caudal de anestesia a una concentración de aproximadamente 0,5%. Conecte la máquina de anestesia a la boca y la nariz del ratón. Proceda con el tratamiento de electroacupuntura mientras se asegura el mantenimiento de la anestesia.
   NOTA: El efecto de la anestesia se confirmó cuando los ratones dejaron de parpadear. El efecto de la anestesia puede durar al menos 30 minutos.

3. Tratamiento de electroacupuntura

1. Para mejorar eficazmente la disfunción cognitiva, seleccione puntos de acupuntura específicos, como Baihui (GV20), Shenting (GV24) y Zusanli bilateral (ST36), basándose en la teoría de la medicina tradicional china y la experiencia clínica (Figura 3). Administrar el tratamiento de electroacupuntura 2 semanas antes de la finalización del proceso de modelado.
   1. Localice el punto de acupuntura GV20 en la línea media de la frente, en el punto medio de una línea que conecta las puntas de las orejas⁷. La profundidad de inserción de la aguja de acupuntura debe ser de 2 mm.
   2. Localice el punto de acupuntura GV24 a 1,3 mm directamente por encima del punto medio de los ojos del ratón en la línea media de la frente¹⁷. La profundidad de inserción de la aguja de acupuntura debe ser de 2 mm.
   3. Localice el punto de acupuntura ST36 en la parte externa de la articulación de la rodilla, aproximadamente 2 mm por debajo de la cabeza del peroné^18,19. La profundidad de inserción de la aguja de acupuntura debe ser de 3-4 mm.
2. Prepare agujas de acupuntura desechables (ver Tabla de Materiales) y un dispositivo de electroacupuntura (ver Tabla de Materiales) para el procedimiento (Figura 4).
3. Coloque al ratón en posición prona bajo anestesia suave con isoflurano al 0,5%, asegurándose de que sus cabezas y extremidades estén inmovilizadas. Sostenga una aguja de acero inoxidable (diámetro: 0,18 mm; longitud: 7 mm) con la mano derecha, usando el pulgar, el índice y el dedo medio.
4. Realizar acupuntura en los puntos de acupuntura GV20 y GV24 transversalmente a 2 mm de profundidad, levantando la piel de la cabeza del ratón con la mano izquierda. Perfore el punto de acupuntura ST36 verticalmente a una profundidad de 3-4 mm tocando la cabeza del peroné en el lado lateral de la articulación de la rodilla del ratón y presionando la piel con el pulgar izquierdo.
   NOTA: Para los puntos de acupuntura localizados en la cabeza, es recomendable insertar las agujas en la secuencia de GV24 seguida de GV20. Este pedido facilita la comodidad operativa. Los puntos de acupuntura son ubicaciones anatómicas discretas en lugar de puntos estacionarios. En consecuencia, las ligeras desviaciones en el ángulo de inserción de la aguja no tienen ningún efecto sobre la eficacia terapéutica, lo que se observa de manera similar en pacientes que reciben tratamiento de electroacupuntura en entornos clínicos.
5. Conecte el dispositivo electrónico de acupuntura a las agujas, con GV20 y el ST36 izquierdo conectados a un juego de electrodos y GV24 y el ST36 derecho conectados a otro (Figura 4). Seleccione el modo de onda continua, con una intensidad de corriente eléctrica de 2 mA y una frecuencia de 2 Hz^20,21. Confirme el tratamiento ideal observando temblores leves locales en los puntos de acupuntura y tolerancia silenciosa por parte del ratón.
   1. Al conectar el instrumento de acupuntura eléctrica, conecte el extremo proximal de la aguja. Esto ayuda a minimizar el impacto causado por el peso de la línea de conexión y, en consecuencia, mejora la prevención del desprendimiento de la aguja. Si es necesario, utilice cinta adhesiva para asegurar la aguja insertada horizontalmente y la línea de conexión.
6. Administrar el tratamiento diario durante 30 minutos cada día durante 6 días consecutivos, con un solo día de descanso entre cada ciclo de tratamiento.

4. Prueba de campo abierto (Figura 5)

NOTA: La prueba de campo abierto es un método convencional utilizado para evaluar el comportamiento autónomo, el comportamiento exploratorio, las habilidades cognitivas y el comportamiento de ansiedad de animales de experimentación en entornos nuevos y desconocidos²². Consta de una caja de reacción de campo abierto y un dispositivo de grabación.

1. Para realizar la prueba, prepare un cubo de paredes blancas que mida 50 cm × 50 cm × 30 cm, con el fondo dividido en 25 cuadrados iguales que midan 10 cm × 10 cm.
2. Coloque el mouse en el cuadro de reacción de campo abierto para aclimatarse. Permita que el ratón explore la sala de pruebas y se familiarice con el nuevo entorno durante el período de aclimatación. Realizar la prueba de campo abierto después de aclimatar al ratón al entorno experimental durante 1 h.
   NOTA: Esto garantiza la minimización de la ansiedad o el estrés inducido por alteraciones en el entorno, lo que permite obtener resultados más precisos durante las evaluaciones conductuales posteriores.
3. Coloque el mouse en el centro de la caja y vigílelo durante 10 minutos después de permitir que el mouse se adapte al entorno durante 2 minutos.
   1. Utilice un sistema de seguimiento de video (ver Tabla de materiales) para registrar la trayectoria del movimiento del mouse, la distancia total recorrida, el tiempo de permanencia en el área central, la velocidad de cruce del área central y el número de entradas en el área central durante la prueba.
   2. Realice las operaciones pertinentes según las instrucciones del manual del producto del sistema de seguimiento de video. Cada ratón se somete a una única prueba y comienza a explorar desde el mismo lugar dentro de la caja.
   3. Después de cada prueba, limpie la caja de campo abierto con etanol al 75% para evitar resultados falsos causados por la interferencia de olores al usar un mouse.

5. Laberinto de agua (Figura 5)

NOTA: La prueba del laberinto de agua se emplea con frecuencia como una herramienta de evaluación del comportamiento en experimentos con ratones para evaluar sus capacidades de aprendizaje espacial y memoria²³.

1. Prepare un tanque de agua circular con un diámetro de 120 cm y una profundidad de 30 cm. Divide el tanque en cuatro cuadrantes iguales: I, II, III y IV. Si usa ratones negros en el experimento, use un tanque de agua blanca; Para los ratones blancos, use un tanque de agua negro.
2. Coloque cortinas alrededor del tanque de agua circular para evitar que el ratón vea a los investigadores durante la prueba.
3. Coloque diferentes marcadores en la superficie superior del tanque de agua como señales visuales para la orientación espacial. Asegúrese de que estos marcadores permanezcan estacionarios durante todo el experimento para mantener la coherencia.
4. Coloque una plataforma circular con un diámetro de 10 cm en el cuadrante III del tanque de agua como el área objetivo designada. Asegúrese de que la plataforma se pueda mover y asegurar fácilmente en cualquier ubicación deseada.
5. A lo largo del experimento, introduce agua en el tanque manteniendo un rango de temperatura de 22-24 °C.
   1. Asegúrese de que el nivel del agua permanezca constantemente a 1 cm por encima de la plataforma objetivo. Incluya una concentración del 20% de dióxido de titanio no tóxico en el agua para lograr un contraste distintivo entre los ratones negros y el fondo blanco. Este contraste facilita que la cámara registre los movimientos del ratón y los parámetros relevantes.
6. Realice una prueba de exploración espacial continua de 5 días colocando secuencialmente cada ratón en los cuadrantes I, II, III y IV.
   1. Coloque el ratón mirando hacia la pared. Aléjese del laberinto para evitar que el ratón utilice la posición del experimentador como punto de referencia. Registre el tiempo que tarda el ratón en encontrar la plataforma.
   2. Si el ratón no localiza la plataforma submarina en un plazo de 90 s, guíe al ratón hasta la plataforma y proporcione un período de aprendizaje de 30 s. Además, registre el período de latencia como 90 s.
   3. Si el ratón localiza la plataforma subacuática dentro de los 90 s, déjela permanecer en la plataforma durante 10 s para aprender antes de sacarla del tanque de agua.
   4. Seca al ratón con una toalla y devuélvelo a su jaula.
   5. Gire la ubicación de cada ratón en cada cuadrante cada 20 minutos. Registre la distancia de natación de cada ratón, la velocidad y el tiempo que tarda en encontrar la plataforma (el período de latencia) utilizando el sistema de seguimiento de vídeo (consulte la tabla de materiales), realizando las operaciones pertinentes según las instrucciones del manual del producto.
   6. Coloque la plataforma a 1 cm por encima de la superficie del agua el día 1. Coloque la plataforma a una profundidad de 1 cm por debajo de la superficie del agua en los días 2-5.
7. El día 6, retire la plataforma del cuadrante objetivo y realice una prueba de exploración espacial.
   1. Coloque el ratón en el cuadrante I para explorar libremente durante 90 s. La computadora registra la trayectoria de natación del mouse, el tiempo que pasa en el cuadrante objetivo y el número de veces que cruza la plataforma.
      NOTA: Con el fin de minimizar los errores experimentales causados por factores humanos, es importante mantener fija la posición del punto de referencia en el experimento del laberinto de agua. Además, el experimentador debe retirarse inmediatamente después de colocar al ratón en el agua. Una vez finalizado el experimento, los ratones deben secarse con una toalla y volver a colocarse en sus jaulas para mantener el calor.

6. Tinción de hematoxilina y eosina (HE) (Figura 6)

NOTA: El examen histológico de la región del hipocampo ayuda a evaluar el establecimiento del modelo de hipoxia y a determinar la eficacia del tratamiento con acupuntura.

1. Después del experimento conductual, anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de pentobarbital sódico y perfundirlo con una solución de paraformaldehído al 10% (ver Tabla de materiales) para asegurar una perfusión corporal completa. Aislar el tejido cerebral y sumergirlo en una solución de paraformaldehído al 10% a temperatura ambiente (RT) durante 3 días para lograr la fijación.
2. Coloque las muestras de cerebro en una caja de inclusión. Posteriormente, lavar las muestras de cerebro procesadas con agua corriente durante 6 h.
3. Emplee un procesador de tejidos automatizado para deshidratar las muestras utilizando una serie de soluciones de alcohol con concentraciones crecientes, a saber, etanol al 60% durante 1 h, etanol al 70% durante 1 h, etanol al 90% durante 1 h, etanol al 95% durante 2 h y, finalmente, etanol al 100% durante 2 h.
4. Sumerja las muestras de tejido en xileno durante 2 h para lograr transparencia. Posteriormente, una vez finalizado el proceso de deshidratación, transferir las muestras permeabilizadas a cera de parafina calentada a 60 °C durante 3 h. Por último, insértelos en un procesador automático.
5. Utilice una cortadora rotativa para obtener secciones de 4 μm. Posteriormente, someter las secciones a tinción con hematoxilina durante un período de 3-8 min, seguido de tinción con eosina durante 1-3 min.
6. Transfiera secuencialmente las secciones teñidas a recipientes separados de alcohol puro y xileno. Luego, selle y asegure las secciones teñidas con goma neutra en preparación para el examen patológico bajo un microscopio óptico.
7. Emplee un escáner de diapositivas (consulte la Tabla de materiales) para escanear los cortes. Posteriormente, utilice el software de visualización para obtener los resultados de la tinción HE para la región del hipocampo. Compara la disposición de las neuronas y la condensación de los núcleos neuronales.

Resultados

Caracterización de las trayectorias de locomoción del ratón en el experimento de campo abierto
El mapa de trayectoria revela que los ratones del grupo normal muestran una profunda inclinación por la exploración en entornos desconocidos. Sus trayectorias de actividad se concentran principalmente en las esquinas mientras cubren todo el campo abierto (panel izquierdo). Por el contrario, el grupo de ratones modelo de hipoxia a largo plazo muestra un deseo significativamente disminuido de explorar nue...

Discusión

La acupuntura, una práctica médica no farmacológica originaria de China hace más de 2.000 años, consiste en la inserción de agujas finas en puntos específicos del cuerpo conocidos como puntos de acupuntura. Se cree que estos puntos están conectados por canales o meridianos a través de los^{cuales fluye la} energía vital del cuerpo, o "qi". Al estimular estos puntos, la acupuntura tiene como objetivo restaurar el equilibrio y la armonía del cuerpo. Se ha demostrado que trata eficazmente div...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106