Kronik Hipoksiye Bağlı Bilişsel İşlev Bozukluğunun Fare Modelinde Akupunktur Tedavisi

Özet

Burada, kronik hipoksi fare modelinde hafif anestezi ve akupunktur tedavisi uygulamak ve tedavi sonrası bilişsel değişiklikleri değerlendirmek için davranışsal testler yapmak için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Merkezi sinir bozukluklarının tedavisi, tıp alanında sürekli olarak önemli zorluklar ortaya çıkarmıştır. Geleneksel Çin tıbbına dayanan farmakolojik olmayan bir uygulama olan akupunktur, ince iğnelerin vücuttaki kesin noktalara sokulmasını gerektirir ve çeşitli koşulların yönetimi için yaygın olarak kullanılır. Son zamanlarda, akupunktur, anksiyete ve solunum bozuklukları da dahil olmak üzere bir dizi nörolojik hastalık için umut verici bir terapötik müdahale olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, kronik hipoksinin neden olduğu bilişsel işlev bozukluğunun tedavisinde akupunkturun potansiyeli henüz araştırılmamıştır. Bu makale, kronik hipoksiye bağlı bilişsel bozukluğun bir fare modelini oluşturmak, hafif anestezi uygulamak, akupunktur tedavisi yapmak ve açık alan testleri ve su labirentleri kullanarak davranış değişikliklerini ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Adım adım protokol, bilişsel gelişim için akupunktur noktalarının ve iğnelerin doğru bir şekilde konumlandırılması ve konumlandırılması hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Araştırmacılar, bu protokolü kullanarak, bilişsel işlev bozukluğu için akupunkturun terapötik potansiyelini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için sistematik çalışmalar yürütebilirler.

Giriş

Küresel nüfus şu anda kritik bir yaşlanma sorunuyla karşı karşıyadır ve bu da bilişsel bozuklukların prevalansında hızlı bir artışa neden olmaktadır. Dünya çapında bilişsel bozukluk insidansı 1000 kişi-yıl başına yaklaşık 53,97'dir¹. Vasküler disfonksiyon veya dolaşım/solunum bozukluklarının neden olduğu kronik serebral hipoksi, yaşa bağlı demans için en önemli risk faktörlerinden biri olmaya devam etmektedir². Önceki çalışmalar, serebral hipoksinin BACE1 ekspresyonunu³ değiştirerek amiloid β birikimini artırabileceğini göstermiştir. Ek olarak, hipoksi, glial hücre düzensizliği ve nöroinflamasyon^ile ilişkilendirilmiştir ^4,5. Bu sorunun artan büyüklüğüne rağmen, kronik hipoksiye bağlı bilişsel gerilemeyi önlemek için etkili Batı ilaçları şu anda eksiktir. Farmakolojik olmayan geleneksel Çin tıbbı, özellikle akupunktur, bilişsel bozuklukları tedavi etmek için binlerce yıldır kullanılmaktadır ve nörodejeneratif hastalıkların hafifletilmesinde umut verici sonuçlar göstermiştir ^6,7. Baihui, Shenting ve Zusanli akupunktur noktaları, bilişsel işlev bozukluğunu tedavi etmek için etkili noktalardır ^8,9. Klinik çalışmalar, elektro-akupunktur tedavisinin vasküler bilişsel bozukluğu olan hastalarda Montreal Bilişsel Değerlendirme (MoCA) ve Mini Zihinsel Durum Muayenesi (MMSE) puanlarını önemli ölçüde iyileştirdiğini ve bilişsel işlev bozukluğunu etkili bir şekilde iyileştirdiğini göstermiştir⁸. Çalışmalar, akupunkturun arteriyel ligasyonlu sıçanların hafıza yeteneğini önemli ölçüde artırabileceğini öne sürse de - akut serebral hipoksi modelleri¹⁰, akut serebral hipoksi modeli, kronik hipoksi kaynaklı bilişsel bozuklukları olan herhangi bir kemirgen modelinde akupunkturun etkileri hakkında bir rapor yoktur. Mekanizma ile ilgili araştırma eksikliği, klinik uygulamasını önemli ölçüde engellemiştir.

Önceki araştırmalar, sıçanların 8 haftalık bir süre boyunca hipoksik bir ortama maruz bırakılmasının beyindeki oksidatif stres ve iltihaplanma düzeylerini önemli ölçüde artırabileceğini ve bunun da hafıza fonksiyonunda bir düşüşe neden olabileceğini göstermiştir¹¹. Bu çalışma, anlayışımızı ilerletmek için akupunkturun kemirgen modelleri üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlamaktadır. Bununla birlikte, tekrarlanan stimülasyon sırasında ajitasyon potansiyeli nedeniyle kemirgenlerde akupunktur tedavisi sırasında tipik olarak anestezinin gerekli olduğunu belirtmek gerekir. Uzun süreli anestezi, farelerde bilişsel işlevi önemli ölçüde etkileyebilir, çünkü çoğu anestezik ilaç nöral aktiviteyi baskılayabilir ve bilgi işlemeyi engelleyerek davranışsal eksikliklere yol açabilir¹². Birkaç çalışma, 6 saatlik bir süre boyunca% 2.5 sevofluran uygulanmasının farelerde uzamsal hafızayı, öğrenme yeteneğini ve dikkati önemli ölçüde bozabileceğini göstermiştir¹³. Ayrıca, kanıtlar yüksek dozda anestezinin farelerde nöronal ölüme veya sinir hasarına neden olabileceğini düşündürmektedir¹⁴. Bu nedenle, kullanılan toplam anestezi miktarını en aza indirmek için uygun bir yaklaşım belirlemek zorunludur. Bu çalışmada, bilişsel bozukluğu olan fareleri tedavi etmek için etkili bir akupunktur yöntemi ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek için davranışsal testler sunuyoruz. Daha da önemlisi, deney sırasında uygulanan toplam anestezi dozunu etkili bir şekilde azaltabilen modifiye edilmiş bir tedavi öncesi anestezi tekniği sunuyoruz.

Protokol

Hayvan deneyleri, Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hayvan Araştırmaları ve Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir (onay numarası: N2022148). 18-22 g ağırlığındaki erkek C57BL / 6J fareleri (Malzeme Tablosuna bakınız) Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nün yeni ilaç değerlendirme merkezine yerleştirildi. Onlara normal yiyecek ve temiz su sağlandı ve günde 12 saat yapay ışığa maruz bırakıldı. Odalar, 20-26 °C kontrollü bir sıcaklık aralığını ve% 40 -% 70 bağıl nemi korudu.

1. Kronik hipoksi fare modelinin kurulması (Şekil 1)

1. Deneye başlamadan önce, normal atmosferik basınç altında hayvan kafesleri ve sürekli düşük oksijenli bir ortama sahip kafesler hazırlayın. Odayı saf oksijen ve nitrojen karışımıyla yıkamak için otomatik bir gaz kontrol dağıtım sistemi kullanarak sürekli düşük oksijenli bir ortam oluşturun.
   NOT: Bu sistem, elektromanyetik valf anahtarını kontrol etmek için programlanmıştır, böylece hem zaman hem de konsantrasyon açısından gazın hassas bir şekilde iletilmesini sağlar.
2. Fareleri rastgele üç gruba ayırın: bir kontrol grubu (Con), bir model grubu (CH) ve bir elektro-akupunktur grubu (EA + CH). Kontrol ve model/elektro-akupunktur farelerini, kafes başına 10 fare olacak şekilde iki kafese ayrı ayrı yerleştirin. Işık döngüsünü 12 saat/12 saatte (aydınlık/koyu) koruyun.
   NOT: Kontrol grubunda (Con) herhangi bir tedavi veya hipoksi indüklenmez. Model grubu (CH), kronik hipoksisi olan farelerden oluşur. Elektro-akupunktur grubu (EA + CH), elektro-akupunktur ile tedavi edilen hipoksi kaynaklı fareleri içerir.
3. Kronik hipoksi geliştirmek için, gaz akış hızını düzenlemek ve% 10'luk bir oksijen konsantrasyonunu korumak için bir dijital oksijen ölçer kullanarak düşük oksijen odasının parametrelerini oluşturun. Hayvanları sabah 9:00'da düşük oksijen odasına yerleştirin ve akşam 5:00'te çıkarın, böylece 3 ay boyunca günde toplam 8 saat kesintisiz düşük oksijene maruz kalın.
   NOT: Oksijen konsantrasyonunu azaltmak için nitrojen gazı dağıtımını ayarlarken, hayvan ölümlerine yol açacağından, bir kerede aşırı nitrojen gazı girişini önlemek için yavaş ilerlemeniz önerilir.
4. Histoloji muayenesi ve davranış testleri kullanarak kronik hipoksiye bağlı bilişsel işlev bozukluğu modelini değerlendirin: açık alan testi¹⁵ ve su labirenti testi¹⁶.

2. Anestezi (Şekil 2)

1. Küçük hayvan anestezi makinesini hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve sabit sıcaklıklı ısıtma yastığı.
   NOT: Anestezi sırasında hayvanlar hipotermiye karşı hassastır ve bu da yalıtım için sabit sıcaklıkta bir ısıtma yastığı kullanılması gerekliliğinin altını çizer.
2. Fareyi anestezi indüksiyon kutusuna yerleştirin ve yaklaşık 1 dakika boyunca oksijende% 2 -% 2.5 izofluran ile hızlı bir şekilde indükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Bu kısa süreli ön işlem, farelerin düşük konsantrasyonlu dozaj altında uzun süre gelişebilmesini sağlamak için çok önemli bir adımdır.
3. Uyarılabilirlikleri azaldığında, refleksini kontrol etmek için farenin ayak parmağını sıkıştırın. Ardından, fareyi sabit sıcaklıktaki ısıtma yastığına (37 °C) aktarın.
4. Anestezi akış hızını yaklaşık% 0,5 konsantrasyona ayarlayın. Anestezi makinesini farenin ağzına ve burnuna bağlayın. Anestezinin sürdürülmesini sağlarken elektro-akupunktur tedavisine devam edin.
   NOT: Anestezinin etkisi, farelerin yanıp sönmesi durduğunda doğrulandı. Anestezinin etkisi en az 30 dakika sürebilir.

3. Elektro-akupunktur tedavisi

1. Bilişsel işlev bozukluğunu etkili bir şekilde iyileştirmek için, geleneksel Çin tıbbı teorisine ve klinik deneyime dayanarak Baihui (GV20), Shenting (GV24) ve bilateral Zusanli (ST36) gibi spesifik akupunktur noktalarını seçin (Şekil 3). Modelleme işleminin tamamlanmasından 2 hafta önce elektro-akupunktur tedavisi uygulayın.
   1. GV20 akupunktur noktasını alnın orta hattında, kulak uçlarını birleştiren bir çizginin orta noktasında^{bulun 7}. Akupunktur iğnesi batırma derinliği 2 mm olmalıdır.
   2. GV24 akupunktur noktasını, alnın 1.3 orta çizgisinde, farenin gözlerinin orta noktasının¹⁷ mm üzerine yerleştirin. Akupunktur iğnesi batırma derinliği 2 mm olmalıdır.
   3. ST36 akupunktur noktasını diz ekleminin dış tarafında, fibula^18,19 başının yaklaşık 2 mm altına yerleştirin. Akupunktur iğnesi batırma derinliği 3-4 mm olmalıdır.
2. Prosedür için tek kullanımlık akupunktur iğneleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir elektro-akupunktur cihazı (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın (Şekil 4).
3. Fareyi hafif anestezi altında% 0.5 izofluran ile yüzüstü pozisyona getirin, başlarının ve uzuvlarının hareketsiz olduğundan emin olun. Başparmak, işaret parmağı ve orta parmağı kullanarak paslanmaz çelik bir iğneyi (çap: 0,18 mm; uzunluk: 7 mm) sağ elinizle tutun.
4. GV20 ve GV24 akupunktur noktalarında 2 mm derinlik için enine akupunktur uygulayın ve farenin kafasındaki cildi sol elinizle kaldırın. ST36 akupunktur noktasını, farenin diz ekleminin yan tarafındaki fibula kafasına dokunarak ve sol başparmağınızla cilde bastırarak 3-4 mm derinlik için dikey olarak delin.
   NOT: Kafada bulunan akupunktur noktaları için, iğnelerin GV24 ve ardından GV20 dizisine yerleştirilmesi tavsiye edilir. Bu sipariş operasyonel kolaylığı kolaylaştırır. Akupunktur noktaları, durağan noktalardan ziyade ayrı anatomik konumlardır. Sonuç olarak, iğne batırma açısındaki hafif sapmaların, klinik ortamlarda elektro-akupunktur tedavisi alan hastalarda benzer şekilde görülen terapötik etkinlik üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
5. Elektronik akupunktur cihazını, GV20 ve sol ST36 bir elektrot setine bağlı ve GV24 ve sağ ST36 diğerine bağlı olacak şekilde iğnelere bağlayın (Şekil 4). 2 mA elektrik akımı yoğunluğu ve 2 Hz^20,21 frekansı ile sürekli dalga modunu seçin. Akupunktur noktalarında lokal hafif titremeleri ve farenin sessiz toleransını gözlemleyerek ideal tedaviyi onaylayın.
   1. Elektrikli akupunktur aletini bağlarken, iğnenin proksimal ucunu bağlayın. Bu, bağlantı hattının ağırlığının neden olduğu etkiyi en aza indirmeye yardımcı olur ve sonuç olarak iğne ayrılmasının önlenmesini iyileştirir. Gerekirse, yatay olarak yerleştirilmiş iğneyi ve bağlantı hattını sabitlemek için yapışkan bant kullanın.
6. Günlük tedaviyi art arda 6 gün boyunca her gün 30 dakika uygulayın ve her tedavi döngüsü arasında tek bir gün dinlenin.

4. Açık alan testi (Şekil 5)

NOT: Açık alan testi, deney hayvanlarının yeni ve alışılmadık ortamlarda özerk davranışlarını, keşif davranışlarını, bilişsel yeteneklerini ve kaygı davranışlarını değerlendirmek için kullanılan geleneksel bir yöntemdir²². Bir açık alan reaksiyon kutusu ve bir kayıt cihazından oluşur.

1. Testi yapmak için, 50 cm × 50 cm × 30 cm ölçülerinde beyaz duvarlı bir küp hazırlayın, alt kısmı 10 cm × 10 cm ölçülerinde 25 eşit kareye bölünsün.
2. Alıştırma için fareyi açık alan reaksiyon kutusuna yerleştirin. Farenin test odasını keşfetmesine ve alışma döneminde yeni ortama alışmasına izin verin. Fareyi 1 saat boyunca deney ortamına alıştırdıktan sonra açık alan testini yapın.
   NOT: Bu, ortamdaki değişikliklerin neden olduğu kaygı veya stresin en aza indirilmesini garanti eder, böylece sonraki davranışsal değerlendirmeler sırasında daha kesin sonuçlar elde edilmesini sağlar.
3. Fareyi kutunun ortasına yerleştirin ve farenin 2 dakika boyunca ortama uyum sağlamasına izin verdikten sonra 10 dakika boyunca izleyin.
   1. Test sırasında farenin hareket yörüngesini, kat edilen toplam mesafeyi, orta alanda geçirilen süreyi, orta alandan geçme hızını ve orta alana giriş sayısını kaydetmek için bir video izleme sistemi (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
   2. Video takip sisteminin ürün kılavuzunda belirtildiği şekilde ilgili işlemleri gerçekleştirin. Her fare tek bir teste tabi tutulur ve kutunun içindeki aynı konumdan keşfe başlar.
   3. Her testten sonra, fare kullanırken koku parazitinden kaynaklanan yanlış sonuçları önlemek için açık alan kutusunu %75 etanol ile temizleyin.

5. Su labirenti (Şekil 5)

NOT: Su labirenti testi, farelerin uzamsal öğrenme ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek için yapılan deneylerde davranışsal bir değerlendirme aracı olarak sıklıkla kullanılmaktadır²³.

1. 120 cm çapında ve 30 cm derinliğinde dairesel bir su deposu hazırlayın. Tankı dört eşit çeyreğe bölün: I, II, III ve IV. Deneyde siyah fare kullanıyorsanız, beyaz bir su deposu kullanın; Beyaz fareler için siyah su deposu kullanın.
2. Test sırasında farenin araştırmacıları görmesini önlemek için dairesel su deposunun etrafına perdeler yerleştirin.
3. Uzamsal yönlendirme için görsel ipuçları olarak su deposunun üst yüzeyine farklı işaretler yerleştirin. Tutarlılığı korumak için bu belirteçlerin deney boyunca sabit kaldığından emin olun.
4. Belirlenen hedef alan olarak su deposunun III. çeyreğine 10 cm çapında dairesel bir platform yerleştirin. Platformun istenen herhangi bir yere kolayca taşınabilmesini ve emniyete alınabilmesini sağlayın.
5. Deney boyunca, 22-24 °C sıcaklık aralığını korurken tanka su verin.
   1. Su seviyesinin sürekli olarak hedef platformun 1 cm üzerinde kaldığından emin olun. Siyah fareler ve beyaz arka plan arasında belirgin bir kontrast elde etmek için suya% 20 toksik olmayan titanyum dioksit konsantrasyonu ekleyin. Bu kontrast, kameranın farenin hareketlerini ve ilgili parametreleri kaydetmesini kolaylaştırır.
6. Her fareyi sırayla I, II, III ve IV kadranlarına yerleştirerek 5 günlük sürekli uzamsal keşif testi gerçekleştirin.
   1. Fareyi duvara bakacak şekilde konumlandırın. Farenin deneycinin konumunu referans noktası olarak kullanmasını önlemek için labirentten uzaklaşın. Farenin platformu bulması için geçen süreyi kaydedin.
   2. Fare 90 saniye içinde su altı platformunu bulamazsa, fareyi platforma yönlendirin ve 30 saniyelik bir öğrenme süresi sağlayın. Ayrıca, gecikme süresini 90 sn olarak kaydedin.
   3. Fare su altı platformunu 90 saniye içinde bulursa, su tankından çıkarmadan önce öğrenmesi için 10 saniye platformda kalmasına izin verin.
   4. Fareyi bir havluyla kurulayın ve kafesine geri koyun.
   5. Her farenin yerleşimini her 20 dakikada bir her çeyrekte bir döndürün. Video izleme sistemini kullanarak her farenin yüzme mesafesini, hızını ve platformu bulmak için geçen süreyi (gecikme süresi) kaydedin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ürün kılavuzunda belirtildiği gibi ilgili işlemleri gerçekleştirin.
   6. Platformu 1. günde su yüzeyinden 1 cm yükseğe yerleştirin. Platformu 2-5. günlerde su yüzeyinin 1 cm altına yerleştirin.
7. 6. Günde, platformu hedef kadrandan kaldırın ve bir uzamsal keşif testi yapın.
   1. 90 saniye boyunca özgürce keşfetmek için fareyi Çeyrek I'e yerleştirin. Bilgisayar, farenin yüzme yörüngesini, hedef kadranda harcanan zamanı ve platformu kaç kez geçtiğini kaydeder.
      NOT: İnsan faktörlerinden kaynaklanan deneysel hataları en aza indirmek için, su labirenti deneyinde referans noktasının konumunu sabit tutmak önemlidir. Ek olarak, deneyci fareyi suya yerleştirdikten hemen sonra geri çekilmelidir. Deney tamamlandıktan sonra, fareler bir havlu ile kurutulmalı ve sıcaklığı korumak için kafeslerine geri yerleştirilmelidir.

6. Hematoksilen ve eozin (HE) boyaması (Şekil 6)

NOT: Hipokampal bölgenin histolojik muayenesi, hipoksi modelinin kurulmasına ve akupunktur tedavisinin etkinliğinin belirlenmesine yardımcı olur.

1. Davranışsal deneyden sonra, fareyi 20 mg / kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve tam vücut perfüzyonunu sağlamak için% 10 paraformaldehit çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ile perfüze edin. Beyin dokusunu izole edin ve fiksasyonu sağlamak için 3 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) %10 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
2. Beyin örneklerini bir gömme kutusuna yerleştirin. Daha sonra, işlenmiş beyin örneklerini 6 saat boyunca akan su ile yıkayın.
3. 1 saat boyunca %60 etanol, 1 saat boyunca %70 etanol, 1 saat boyunca %90 etanol, 1 saat boyunca %90 etanol, 2 saat boyunca %95 etanol ve son olarak 2 saat boyunca %100 etanol gibi artan konsantrasyonlara sahip bir dizi alkol çözeltisi kullanarak numuneleri kurutmak için otomatik bir doku işlemcisi kullanın.
4. Şeffaflık elde etmek için doku örneklerini 2 saat boyunca ksilene daldırın. Daha sonra, dehidrasyon işleminin tamamlanmasını takiben, geçirgen numuneleri 3 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtılmış parafin mumuna aktarın. Son olarak, bunları otomatik bir işlemciye gömün.
5. 4 μm'lik kesitler elde etmek için döner bir dilimleyici kullanın. Daha sonra, bölümleri 3-8 dakika arasında değişen bir süre boyunca hematoksilen boyamaya, ardından 1-3 dakika boyunca eozin boyamaya tabi tutun.
6. Lekeli bölümleri sırayla ayrı saf alkol ve ksilen kaplarına aktarın. Ardından, optik mikroskop altında patolojik incelemeye hazırlanırken lekeli bölümleri nötr sakızla kapatın ve sabitleyin.
7. Dilimleri taramak için bir slayt tarayıcı kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Daha sonra, hipokampal bölge için HE boyama sonuçlarını elde etmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Nöronların düzenini ve nöronal çekirdeklerin yoğunlaşmasını karşılaştırın.

Sonuçlar

Açık alan deneyinde fare hareket yörüngelerini karakterize etme
Yörünge haritası, normal gruptaki farelerin, alışılmadık ortamlarda keşif için derin bir eğilim sergilediğini ortaya koymaktadır. Aktivite yörüngeleri, tüm açık alanı kaplarken (sol panel) öncelikle köşelerde yoğunlaşmıştır. Buna karşılık, uzun vadeli hipoksi model fare grubu, yeni çevreyi keşfetmek için önemli ölçüde azalmış bir istek gösterir. Açık alanın merkezine (orta panel) doğru herhan...

Tartışmalar

2.000 yıldan uzun bir süre önce Çin'de ortaya çıkan farmakolojik olmayan bir tıbbi uygulama olan akupunktur, akupunktur noktaları olarak bilinen vücuttaki belirli noktalara ince iğnelerin sokulmasını içerir. Bu noktaların, vücudun hayati enerjisinin veya "qi"nin aktığı kanallar veya meridyenlerle birbirine bağlandığına inanılıyor²⁴. Akupunktur bu noktaları uyararak vücuda denge ve uyumu yeniden kazandırmayı amaçlar. Kronik ağrı, anksiyete/depresyon, sindirim sorunlar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106