Traitement d’acupuncture dans un modèle murin de dysfonctionnement cognitif induit par l’hypoxie chronique

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour mettre en œuvre un traitement d’anesthésie légère et d’acupuncture sur un modèle murin d’hypoxie chronique et effectuer des tests comportementaux pour évaluer les altérations cognitives post-traitement.

Résumé

Le traitement des troubles du nerf central a toujours posé des défis importants au domaine médical. L’acupuncture, une pratique non pharmacologique enracinée dans la médecine traditionnelle chinoise, implique l’insertion de fines aiguilles dans des points précis du corps et est couramment utilisée pour la gestion de diverses affections. Récemment, l’acupuncture est apparue comme une intervention thérapeutique prometteuse pour une gamme de maladies neurologiques, y compris l’anxiété et les troubles respiratoires. Cependant, le potentiel de l’acupuncture dans le traitement du dysfonctionnement cognitif induit par l’hypoxie chronique n’a pas encore été exploré. Cet article présente un protocole complet pour établir un modèle murin de déficience cognitive chronique induite par l’hypoxie, administrer une anesthésie légère, effectuer un traitement d’acupuncture et évaluer les changements de comportement et les capacités de mémoire à l’aide de tests en plein champ et de labyrinthes aquatiques. Le protocole étape par étape fournit des instructions détaillées sur la localisation et le positionnement précis des points d’acupuncture et des aiguilles pour l’amélioration cognitive. En utilisant ce protocole, les chercheurs peuvent mener des études systématiques pour évaluer en profondeur le potentiel thérapeutique de l’acupuncture pour le dysfonctionnement cognitif.

Introduction

La population mondiale est actuellement confrontée à un problème critique de vieillissement, entraînant une augmentation rapide de la prévalence des troubles cognitifs. L’incidence mondiale des troubles cognitifs est d’environ 53,97 pour 1000 années-personnes¹. L’hypoxie cérébrale chronique causée par un dysfonctionnement vasculaire ou des troubles circulatoires/respiratoires reste l’un des principaux facteurs de risque de démence liée à l’âge². Des études antérieures ont démontré que l’hypoxie cérébrale peut augmenter le dépôt de β amyloïde en modifiant l’expression³ de BACE1. De plus, l’hypoxie a été associée à un dérèglement des cellules gliales et à une neuroinflammation ^4,5. Malgré l’ampleur croissante de ce problème, il n’existe actuellement aucun médicament occidental efficace pour prévenir le déclin cognitif induit par l’hypoxie chronique. La médecine traditionnelle chinoise non pharmacologique, en particulier l’acupuncture, est utilisée depuis des milliers d’années pour traiter les troubles cognitifs et a montré des résultats prometteurs dans le soulagement des maladies neurodégénératives ^6,7. Les points d’acupuncture Baihui, Shenting et Zusanli sont des points efficaces pour traiter le dysfonctionnement cognitif ^8,9. Des études cliniques ont démontré que la thérapie par électro-acupuncture améliore significativement les scores de l’évaluation cognitive de Montréal (MoCA) et du mini-examen de l’état mental (MMSE) chez les patients atteints de troubles cognitifs vasculaires et améliore efficacement le dysfonctionnement cognitif⁸. Bien que des études aient suggéré que l’acupuncture peut améliorer considérablement la capacité de mémoire des rats atteints de ligature artérielle - un modèle d’hypoxie cérébrale aiguë¹⁰, un modèle d’hypoxie cérébrale aiguë, il n’y a aucun rapport sur les effets de l’acupuncture dans un modèle de rongeur présentant des troubles cognitifs induits par l’hypoxie chronique. Le manque de recherche sur le mécanisme a considérablement entravé son application clinique.

Des recherches antérieures ont démontré que le fait de soumettre des rats à un environnement hypoxique pendant une période de 8 semaines peut augmenter considérablement les niveaux de stress oxydatif et d’inflammation dans le cerveau, entraînant un déclin de la fonction de mémoire¹¹. La présente étude vise à étudier l’impact de l’acupuncture sur des modèles de rongeurs afin d’approfondir notre compréhension. Il convient toutefois de noter que l’anesthésie est généralement nécessaire pendant le traitement d’acupuncture chez les rongeurs en raison du potentiel d’agitation lors de stimulations répétées. L’anesthésie prolongée peut avoir un impact significatif sur la fonction cognitive chez la souris, car la plupart des médicaments anesthésiques peuvent supprimer l’activité neuronale et entraver le traitement de l’information, entraînant des déficits comportementaux¹². Plusieurs études ont montré que l’administration de 2,5 % de sévoflurane pendant une durée de 6 h peut notamment altérer la mémoire spatiale, la capacité d’apprentissage et l’attention chez la souris¹³. De plus, les preuves suggèrent que de fortes doses d’anesthésie peuvent entraîner la mort neuronale ou des lésions nerveuses chez la souris¹⁴. Par conséquent, il est impératif d’identifier une approche appropriée pour minimiser la quantité globale d’anesthésie utilisée. Dans cette étude, nous introduisons une méthode d’acupuncture efficace pour traiter les souris atteintes de troubles cognitifs, ainsi que des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités de mémoire. Il est important de noter que nous présentons une technique d’anesthésie de prétraitement modifiée qui peut réduire efficacement la dose totale d’anesthésie administrée pendant l’expérience.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité de la recherche animale et de l’éthique de l’Institut de recherche médicale du Hebei Yiling (numéro d’agrément : N2022148). Des souris C57BL/6J mâles pesant de 18 à 22 g (voir tableau des matériaux) ont été hébergées dans le nouveau centre d’évaluation des médicaments de l’Institut de recherche médicale Hebei Yiling. Ils ont reçu de la nourriture normale et de l’eau propre et ont été exposés à la lumière artificielle pendant 12 heures par jour. Les pièces ont maintenu une plage de température contrôlée de 20 à 26 °C et une humidité relative de 40 % à 70 %.

1. Mise en place d’un modèle murin d’hypoxie chronique (Figure 1)

1. Avant de commencer l’expérience, préparez des cages pour animaux sous pression atmosphérique normale et des cages avec un environnement continu à faible teneur en oxygène. Établissez un environnement continu à faible teneur en oxygène en utilisant un système automatisé de contrôle de l’administration des gaz pour rincer la chambre avec un mélange d’oxygène pur et d’azote.
   REMARQUE : Ce système est programmé pour contrôler l’interrupteur électromagnétique de la vanne, assurant ainsi une livraison précise du gaz en termes de temps et de concentration.
2. Divisez au hasard les souris en trois groupes : un groupe témoin (Con), un groupe modèle (CH) et un groupe d’électro-acupuncture (EA + CH). Placez séparément les souris témoins et les souris modèles/électro-acupuncture dans les deux cages, à raison de 10 souris par cage. Maintenez le cycle d’éclairage à 12 h/12 h (clair/foncé).
   REMARQUE : Aucun traitement ou hypoxie n’est induit dans le groupe témoin (Con). Le groupe modèle (CH) est constitué de souris souffrant d’hypoxie chronique. Le groupe électro-acupuncture (EA + CH) comprend des souris induites par l’hypoxie traitées par électro-acupuncture.
3. En cas d’hypoxie chronique, établissez les paramètres de la chambre à faible teneur en oxygène en utilisant un oxygénomètre numérique pour réguler le débit de gaz et maintenir une concentration d’oxygène de 10 %. Placez les animaux dans la chambre à faible teneur en oxygène à 9h00 et retirez-les à 17h00, ce qui donne un total de 8 heures d’exposition ininterrompue à un faible taux d’oxygène par jour pendant 3 mois.
   REMARQUE : Lors de la mise en place de l’administration d’azote gazeux pour réduire la concentration d’oxygène, il est conseillé de procéder lentement pour éviter une introduction excessive d’azote gazeux à la fois, car cela entraînerait la mort d’animaux.
4. Évaluer le modèle de dysfonctionnement cognitif induit par l’hypoxie chronique à l’aide d’un examen histologique et de tests comportementaux : le test en champ ouvert¹⁵ et le test du labyrinthe aquatique¹⁶.

2. Anesthésie (Figure 2)

1. Préparez l’appareil d’anesthésie pour petits animaux (voir le tableau des matériaux) et le coussin chauffant à température constante.
   REMARQUE : Pendant l’anesthésie, les animaux sont sensibles à l’hypothermie, ce qui souligne la nécessité d’utiliser un coussin chauffant à température constante pour l’isolation.
2. Placez la souris dans la boîte d’induction de l’anesthésie et induisez rapidement avec de l’isoflurane à 2 % à 2,5 % dans de l’oxygène (voir le tableau des matériaux) pendant environ 1 min.
   REMARQUE : Ce prétraitement à court terme est une étape cruciale pour s’assurer que les souris peuvent se développer sous une faible dose de concentration pendant une période prolongée.
3. Une fois leur excitabilité diminuée, pincez l’orteil de la souris pour vérifier son réflexe. Ensuite, transférez la souris sur le coussin chauffant à température constante (37 °C).
4. Ajustez le débit de l’anesthésie à une concentration d’environ 0,5 %. Connectez l’appareil d’anesthésie à la bouche et au nez de la souris. Procéder au traitement d’électro-acupuncture tout en assurant le maintien de l’anesthésie.
   REMARQUE : L’effet de l’anesthésie a été confirmé lorsque les souris ont cessé de cligner des yeux. L’effet de l’anesthésie peut durer au moins 30 minutes.

3. Traitement d’électro-acupuncture

1. Pour améliorer efficacement le dysfonctionnement cognitif, sélectionnez des points d’acupuncture spécifiques, tels que le Baihui (GV20), le Shenting (GV24) et le Zusanli bilatéral (ST36), en fonction de la théorie de la médecine traditionnelle chinoise et de l’expérience clinique (Figure 3). Administrer un traitement d’électro-acupuncture 2 semaines avant la fin du processus de modélisation.
   1. Localisez le point d’acupuncture GV20 sur la ligne médiane du front, au milieu d’une ligne reliant le bout des oreilles⁷. La profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture doit être de 2 mm.
   2. Localisez le point d’acupuncture GV24 à 1,3 mm directement au-dessus du point médian des yeux de la souris sur la ligne médiane du front¹⁷. La profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture doit être de 2 mm.
   3. Localisez le point d’acupuncture ST36 à l’extérieur de l’articulation du genou, à environ 2 mm sous la tête du péroné^18,19. La profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture doit être de 3 à 4 mm.
2. Préparez des aiguilles d’acupuncture jetables (voir le tableau des matériaux) et un appareil d’électro-acupuncture (voir le tableau des matériaux) pour l’intervention (figure 4).
3. Placez la souris en position couchée sous anesthésie légère avec 0,5 % d’isoflurane, en veillant à ce que sa tête et ses membres soient immobilisés. Tenez une aiguille en acier inoxydable (diamètre : 0,18 mm ; longueur : 7 mm) avec la main droite, en utilisant le pouce, l’index et le majeur.
4. Effectuez l’acupuncture aux points d’acupuncture GV20 et GV24 transversalement sur une profondeur de 2 mm, en soulevant la peau de la tête de la souris avec la main gauche. Percez le point d’acupuncture ST36 verticalement sur une profondeur de 3 à 4 mm en touchant la tête fibulaire sur le côté latéral de l’articulation du genou de la souris et en appuyant sur la peau avec le pouce gauche.
   REMARQUE : Pour les points d’acupuncture situés sur la tête, il est conseillé d’insérer les aiguilles dans la séquence GV24 suivie de GV20. Cette commande facilite la commodité opérationnelle. Les points d’acupuncture sont des emplacements anatomiques discrets plutôt que des points fixes. Par conséquent, de légères déviations dans l’angle d’insertion de l’aiguille n’ont aucun effet sur l’efficacité thérapeutique, de la même manière que chez les patients recevant un traitement d’électro-acupuncture en milieu clinique.
5. Connectez l’appareil d’acupuncture électronique aux aiguilles, avec GV20 et le ST36 gauche connectés à un jeu d’électrodes et GV24 et le ST36 droit connectés à un autre (Figure 4). Sélectionnez le mode onde continue, avec une intensité de courant électrique de 2 mA et une fréquence de 2 Hz ^20,21. Confirmez le traitement idéal en observant localement de légers tremblements aux points d’acupuncture et une tolérance silencieuse de la souris.
   1. Lors de la connexion de l’instrument d’acupuncture électrique, connectez l’extrémité proximale de l’aiguille. Cela permet de minimiser l’impact causé par le poids de la ligne de connexion et améliore par conséquent la prévention du détachement de l’aiguille. Si nécessaire, utilisez du ruban adhésif pour fixer l’aiguille insérée horizontalement et la ligne de connexion.
6. Administrer le traitement quotidien pendant 30 minutes chaque jour pendant 6 jours consécutifs, avec un seul jour de repos entre chaque cycle de traitement.

4. Essai en champ libre (figure 5)

REMARQUE : Le test en champ libre est une méthode conventionnelle utilisée pour évaluer le comportement autonome, le comportement exploratoire, les capacités cognitives et le comportement anxieux des animaux de laboratoire dans des environnements nouveaux et inconnus²². Il se compose d’une boîte de réaction à champ ouvert et d’un appareil d’enregistrement.

1. Pour effectuer le test, préparez un cube à parois blanches mesurant 50 cm × 50 cm × 30 cm, le fond étant divisé en 25 carrés égaux mesurant 10 cm × 10 cm.
2. Placez la souris dans la boîte de réaction en champ libre pour l’acclimatation. Laissez la souris explorer la salle d’examen et familiarisez-vous avec le nouvel environnement pendant la période d’acclimatation. Effectuez le test en plein champ après avoir acclimaté la souris à l’environnement expérimental pendant 1 h.
   REMARQUE : Cela garantit la minimisation de l’anxiété ou du stress induit par les altérations de l’environnement, permettant ainsi des résultats plus précis lors des évaluations comportementales ultérieures.
3. Placez la souris au centre de la boîte et surveillez-la pendant 10 min après avoir laissé la souris s’adapter à l’environnement pendant 2 min.
   1. Utilisez un système de suivi vidéo (voir Tableau des matières) pour enregistrer la trajectoire de mouvement de la souris, la distance totale parcourue, le temps passé dans la zone centrale, la vitesse de traversée de la zone centrale et le nombre d’entrées dans la zone centrale pendant le test.
   2. Effectuez les opérations appropriées comme indiqué dans le manuel du produit du système de suivi vidéo. Chaque souris subit un seul test et commence l’exploration à partir du même endroit dans la boîte.
   3. Après chaque test, nettoyez la boîte à champ ouvert avec de l’éthanol à 75 % pour éviter tout faux résultat causé par des interférences d’odeurs lors de l’utilisation d’une souris.

5. Labyrinthe aquatique (Figure 5)

REMARQUE : Le test du labyrinthe aquatique est fréquemment utilisé comme outil d’évaluation comportementale dans des expériences impliquant des souris pour évaluer leurs capacités d’apprentissage spatial et de mémoire²³.

1. Préparez un réservoir d’eau circulaire d’un diamètre de 120 cm et d’une profondeur de 30 cm. Divisez le réservoir en quatre quadrants égaux : I, II, III et IV. Si vous utilisez des souris noires dans l’expérience, utilisez un réservoir d’eau blanche ; Pour les souris blanches, utilisez un réservoir d’eau noire.
2. Placez des rideaux autour du réservoir d’eau circulaire pour empêcher la souris de voir les chercheurs pendant le test.
3. Placez différents marqueurs sur la surface supérieure du réservoir d’eau comme repères visuels pour l’orientation spatiale. Assurez-vous que ces marqueurs restent immobiles tout au long de l’expérience pour maintenir la cohérence.
4. Placer une plate-forme circulaire d’un diamètre de 10 cm dans le quadrant III du réservoir d’eau comme zone cible désignée. Assurez-vous que la plate-forme peut être facilement déplacée et sécurisée à l’endroit souhaité.
5. Tout au long de l’expérience, introduisez de l’eau dans le réservoir tout en maintenant une plage de température de 22 à 24 °C.
   1. Assurez-vous que le niveau d’eau reste constamment à 1 cm au-dessus de la plate-forme cible. Incluez une concentration de 20 % de dioxyde de titane non toxique dans l’eau pour obtenir un contraste distinct entre les souris noires et le fond blanc. Ce contraste facilite l’enregistrement par la caméra des mouvements de la souris et des paramètres pertinents.
6. Effectuez un test d’exploration spatiale continue de 5 jours en plaçant séquentiellement chaque souris dans les quadrants I, II, III et IV.
   1. Positionnez la souris face au mur. Éloignez-vous du labyrinthe pour éviter que la souris n’utilise la position de l’expérimentateur comme point de référence. Enregistrez le temps que la souris met à trouver la plate-forme.
   2. Si la souris ne parvient pas à localiser la plate-forme sous-marine dans les 90 s, guidez-la vers la plate-forme et offrez-lui une période d’apprentissage de 30 s. De plus, enregistrez la période de latence à 90 s.
   3. Si la souris localise la plate-forme sous-marine dans les 90 s, laissez-la rester sur la plate-forme pendant 10 s pour apprendre avant de la retirer du réservoir d’eau.
   4. Séchez la souris avec une serviette et remettez-la dans sa cage.
   5. Faites pivoter l’emplacement de chaque souris dans chaque quadrant toutes les 20 minutes. Enregistrez la distance de nage, la vitesse et le temps nécessaire pour trouver la plate-forme (la période de latence) de chaque souris à l’aide du système de suivi vidéo (voir Tableau des matériaux), en effectuant les opérations pertinentes comme indiqué dans le manuel du produit.
   6. Placez la plate-forme à 1 cm au-dessus de la surface de l’eau le jour 1. Placez la plate-forme à une profondeur de 1 cm sous la surface de l’eau les jours 2 à 5.
7. Le jour 6, retirez la plate-forme du quadrant cible et effectuez un test d’exploration spatiale.
   1. Placez la souris dans le quadrant I pour explorer librement pendant 90 s. L’ordinateur enregistre la trajectoire de nage de la souris, le temps passé dans le quadrant cible et le nombre de fois qu’elle traverse la plate-forme.
      REMARQUE : Afin de minimiser les erreurs expérimentales causées par des facteurs humains, il est important de maintenir la position du point de référence fixe dans l’expérience du labyrinthe aquatique. De plus, l’expérimentateur doit immédiatement battre en retraite après avoir placé la souris dans l’eau. Une fois l’expérience terminée, les souris doivent être séchées avec une serviette et remises dans leurs cages pour maintenir la chaleur.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) (figure 6)

REMARQUE : L’examen histologique de la région de l’hippocampe aide à évaluer l’établissement du modèle d’hypoxie et à déterminer l’efficacité du traitement d’acupuncture.

1. Après l’expérience comportementale, anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 20 mg/kg de pentobarbital sodique et la perfuser avec une solution de paraformaldéhyde à 10 % (voir tableau des matériaux) pour assurer une perfusion corporelle complète. Isolez le tissu cérébral et plongez-le dans une solution de paraformaldéhyde à 10 % à température ambiante (RT) pendant 3 jours pour obtenir une fixation.
2. Placez les échantillons de cerveau dans une boîte d’intégration. Ensuite, laver les échantillons de cerveau traités à l’eau courante pendant 6 h.
3. Utiliser un processeur de tissus automatisé pour déshydrater les échantillons à l’aide d’une série de solutions alcooliques à concentrations croissantes, à savoir 60 % d’éthanol pendant 1 h, 70 % d’éthanol pendant 1 h, 90 % d’éthanol pendant 1 h, 95 % d’éthanol pendant 2 h et enfin, 100 % d’éthanol pendant 2 h.
4. Immerger les échantillons de tissu dans du xylène pendant 2 h pour obtenir une transparence. Par la suite, une fois le processus de déshydratation terminé, transférez les échantillons perméabilisés dans de la cire de paraffine chauffée à 60 °C pendant 3 h. Enfin, intégrez-les dans un processeur automatique.
5. Utilisez une trancheuse rotative pour obtenir des sections de 4 μm. Par la suite, soumettre les coupes à une coloration à l’hématoxyline pendant une durée allant de 3 à 8 min, suivie d’une coloration à l’éosine pendant 1 à 3 min.
6. Transférez séquentiellement les sections colorées dans des récipients séparés d’alcool pur et de xylène. Ensuite, scellez et fixez les sections colorées avec de la gomme neutre en vue d’un examen pathologique au microscope optique.
7. Utilisez un scanner de lames (voir la table des matériaux) pour numériser les tranches. Par la suite, utilisez le logiciel de visualisation pour obtenir les résultats de coloration HE pour la région de l’hippocampe. Comparez la disposition des neurones et la condensation des noyaux neuronaux.

Résultats

Caractérisation des trajectoires de locomotion des souris dans l’expérience en plein champ
La carte de trajectoire révèle que les souris du groupe normal présentent une profonde inclination pour l’exploration dans des environnements inconnus. Leurs trajectoires d’activité sont principalement concentrées dans les coins tout en couvrant l’ensemble du champ ouvert (panneau de gauche). En revanche, le groupe de souris modèles d’hypoxie à long terme présente un désir considérablement ...

Discussion

L’acupuncture, une pratique médicale non pharmacologique originaire de Chine il y a plus de 2 000 ans, implique l’insertion de fines aiguilles dans des points spécifiques du corps appelés points d’acupuncture. On pense que ces points sont reliés par des canaux ou des méridiens à travers lesquels^circule l’énergie vitale du corps, ou « qi ». En stimulant ces points, l’acupuncture vise à rétablir l’équilibre et l’harmonie du corps. Il a été démontré qu’il traite effica...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106