Trattamento con agopuntura in un modello murino di disfunzione cognitiva cronica indotta da ipossia

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per l'implementazione di un trattamento di anestesia lieve e agopuntura su un modello murino di ipossia cronica e la conduzione di test comportamentali per valutare le alterazioni cognitive post-trattamento.

Abstract

Il trattamento dei disturbi del nervo centrale ha costantemente posto sfide significative al campo medico. L'agopuntura, una pratica non farmacologica radicata nella medicina tradizionale cinese, prevede l'inserimento di aghi sottili in punti precisi del corpo ed è comunemente impiegata per la gestione di diverse condizioni. Recentemente, l'agopuntura è emersa come un promettente intervento terapeutico per una serie di malattie neurologiche, tra cui ansia e disturbi respiratori. Tuttavia, il potenziale dell'agopuntura nel trattamento della disfunzione cognitiva indotta dall'ipossia cronica non è stato ancora esplorato. Questo documento presenta un protocollo completo per stabilire un modello murino di deterioramento cognitivo cronico indotto da ipossia, somministrare una lieve anestesia, eseguire un trattamento di agopuntura e valutare i cambiamenti comportamentali e le capacità di memoria utilizzando test in campo aperto e labirinti d'acqua. Il protocollo passo-passo fornisce istruzioni dettagliate su come localizzare e posizionare con precisione i punti di agopuntura e gli aghi per il miglioramento cognitivo. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono condurre studi sistematici per valutare a fondo il potenziale terapeutico dell'agopuntura per la disfunzione cognitiva.

Introduzione

La popolazione mondiale sta attualmente affrontando un problema critico di invecchiamento, con conseguente rapido aumento della prevalenza dei disturbi cognitivi. L'incidenza mondiale del deterioramento cognitivo è di circa 53,97 per 1000 anni-persona¹. L'ipossia cerebrale cronica causata da disfunzioni vascolari o disturbi circolatori/respiratori rimane uno dei principali fattori di rischio per la demenza legata all'età². Studi precedenti hanno dimostrato che l'ipossia cerebrale può aumentare la deposizione di amiloide-β modificando l'espressione di BACE1³. Inoltre, l'ipossia è stata associata a disregolazione delle cellule gliali e neuroinfiammazione ^4,5. Nonostante la crescente portata di questo problema, attualmente mancano farmaci occidentali efficaci per prevenire il declino cognitivo indotto dall'ipossia cronica. La medicina tradizionale cinese non farmacologica, in particolare l'agopuntura, è stata utilizzata per migliaia di anni per trattare i disturbi cognitivi e ha mostrato risultati promettenti nell'alleviare le malattie neurodegenerative ^6,7. I punti di agopuntura di Baihui, Shenting e Zusanli sono punti efficaci per il trattamento della disfunzione cognitiva ^8,9. Studi clinici hanno dimostrato che la terapia con elettroagopuntura migliora significativamente i punteggi Montreal Cognitive Assessment (MoCA) e Mini-Mental State Examination (MMSE) nei pazienti con deterioramento cognitivo vascolare e migliora efficacemente la disfunzione cognitiva⁸. Sebbene gli studi abbiano suggerito che l'agopuntura può migliorare significativamente la capacità di memoria dei ratti con legatura arteriosa, un modello di ipossia cerebrale acuta¹⁰, un modello di ipossia cerebrale acuta, non esiste alcun rapporto sugli effetti dell'agopuntura in qualsiasi modello di roditore con disturbi cognitivi indotti da ipossia cronica. La mancanza di ricerca sul meccanismo ne ha notevolmente ostacolato l'applicazione clinica.

Ricerche precedenti hanno dimostrato che sottoporre i ratti a un ambiente ipossico per un periodo di 8 settimane può aumentare significativamente i livelli di stress ossidativo e infiammazione nel cervello, con conseguente declino della funzione della memoria¹¹. Il presente studio si propone di indagare l'impatto dell'agopuntura sui modelli di roditori al fine di approfondire la nostra comprensione. Vale la pena notare, tuttavia, che l'anestesia è tipicamente necessaria durante il trattamento di agopuntura nei roditori a causa del potenziale di agitazione durante la stimolazione ripetuta. L'anestesia prolungata può avere un impatto significativo sulla funzione cognitiva nei topi, poiché la maggior parte dei farmaci anestetici può sopprimere l'attività neurale e impedire l'elaborazione delle informazioni, portando a deficit comportamentali¹². Diversi studi hanno dimostrato che la somministrazione di sevoflurano al 2,5% per una durata di 6 ore può compromettere notevolmente la memoria spaziale, la capacità di apprendimento e l'attenzione nei topi¹³. Inoltre, l'evidenza suggerisce che alte dosi di anestesia possono provocare la morte neuronale o danni ai nervi nei topi¹⁴. Pertanto, è imperativo identificare un approccio adeguato per ridurre al minimo la quantità complessiva di anestesia utilizzata. In questo studio, introduciamo un metodo di agopuntura efficace per il trattamento dei topi con deterioramento cognitivo, insieme a test comportamentali per valutare le loro capacità di memoria. È importante sottolineare che presentiamo una tecnica di anestesia pre-trattamento modificata che può ridurre efficacemente il dosaggio totale di anestesia somministrata durante l'esperimento.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato per la ricerca sugli animali e l'etica dell'Istituto di ricerca medica Hebei Yiling (numero di approvazione: N2022148). I topi maschi C57BL/6J del peso di 18-22 g (vedi Tabella dei materiali) sono stati ospitati nel nuovo centro di valutazione dei farmaci dell'Hebei Yiling Medical Research Institute. Sono stati forniti loro cibo normale e acqua pulita ed esposti alla luce artificiale per 12 ore al giorno. Le camere hanno mantenuto un intervallo di temperatura controllato di 20-26 °C e un'umidità relativa del 40%-70%.

1. Creazione di un modello murino di ipossia cronica (Figura 1)

1. Prima di iniziare l'esperimento, preparare gabbie per animali a pressione atmosferica normale e gabbie con un ambiente continuo a basso contenuto di ossigeno. Stabilisci un ambiente continuo a basso contenuto di ossigeno utilizzando un sistema di erogazione automatizzato del controllo del gas per lavare la camera con una miscela di ossigeno puro e azoto.
   NOTA: Questo sistema è programmato per controllare l'interruttore della valvola elettromagnetica, garantendo così un'erogazione precisa del gas sia in termini di tempo che di concentrazione.
2. Dividi in modo casuale i topi in tre gruppi: un gruppo di controllo (Con), un gruppo modello (CH) e un gruppo di elettroagopuntura (EA + CH). Posizionare i topi di controllo e modello/elettroagopuntura separatamente nelle due gabbie, con 10 topi per gabbia. Mantenere il ciclo di luce a 12 h/12 h (chiaro/scuro).
   NOTA: Nel gruppo di controllo non viene indotto alcun trattamento o ipossia (Con). Il gruppo modello (CH) è costituito da topi con ipossia cronica. Il gruppo dell'elettroagopuntura (EA + CH) comprende topi indotti dall'ipossia trattati con elettroagopuntura.
3. Per lo sviluppo di ipossia cronica, stabilire i parametri della camera a basso contenuto di ossigeno utilizzando un misuratore di ossigeno digitale per regolare la portata del gas e mantenere una concentrazione di ossigeno del 10%. Posizionare gli animali all'interno della camera a basso contenuto di ossigeno alle 9:00 e rimuoverli alle 17:00, per un totale di 8 ore di esposizione ininterrotta a basso contenuto di ossigeno al giorno per 3 mesi.
   NOTA: Quando si imposta l'erogazione di azoto gassoso per ridurre la concentrazione di ossigeno, si consiglia di procedere lentamente per evitare un'eccessiva introduzione di azoto gassoso in una sola volta, poiché porterà alla morte degli animali.
4. Valutare il modello di disfunzione cognitiva indotta da ipossia cronica utilizzando l'esame istologico e i test comportamentali: il test in campo aperto¹⁵ e il test del labirinto d'acqua¹⁶.

2. Anestesia (Figura 2)

1. Preparare la macchina per anestesia per piccoli animali (vedi Tabella dei materiali) e il termoforo a temperatura costante.
   NOTA: Durante l'anestesia, gli animali sono suscettibili all'ipotermia, sottolineando la necessità di utilizzare un termoforo a temperatura costante per l'isolamento.
2. Posizionare il topo nella scatola di induzione dell'anestesia e indurlo rapidamente con isoflurano al 2%-2,5% di ossigeno (vedere la tabella dei materiali) per circa 1 minuto.
   NOTA: Questo pretrattamento a breve termine è un passaggio cruciale per garantire che i topi possano prosperare a basso dosaggio di concentrazione per un lungo periodo di tempo.
3. Una volta che la loro eccitabilità è diminuita, pizzica la punta del mouse per controllare il suo riflesso. Quindi, trasferire il mouse sul termoforo a temperatura costante (37 °C).
4. Regolare la portata dell'anestesia a una concentrazione di circa lo 0,5%. Collegare la macchina per anestesia alla bocca e al naso del topo. Procedere con il trattamento di elettroagopuntura garantendo il mantenimento dell'anestesia.
   NOTA: L'effetto dell'anestesia è stato confermato quando i topi hanno smesso di sbattere le palpebre. L'effetto dell'anestesia può durare almeno 30 minuti.

3. Trattamento di elettroagopuntura

1. Per migliorare efficacemente la disfunzione cognitiva, selezionare punti di agopuntura specifici, come Baihui (GV20), Shenting (GV24) e Zusanli bilaterale (ST36), sulla base della teoria della medicina tradizionale cinese e dell'esperienza clinica (Figura 3). Somministrare il trattamento di elettroagopuntura 2 settimane prima del completamento del processo di modellazione.
   1. Individuare il punto di agopuntura GV20 sulla linea mediana della fronte, nel punto medio di una linea che collega la punta delle orecchie⁷. La profondità di inserimento dell'ago per agopuntura deve essere di 2 mm.
   2. Individuare il punto di agopuntura GV24 1,3 mm direttamente sopra il punto medio degli occhi del mouse sulla linea mediana della fronte¹⁷. La profondità di inserimento dell'ago per agopuntura deve essere di 2 mm.
   3. Localizzare il punto di agopuntura ST36 all'esterno dell'articolazione del ginocchio, circa 2 mm sotto la testa del perone ^18,19. La profondità di inserimento dell'ago per agopuntura deve essere di 3-4 mm.
2. Preparare aghi per agopuntura monouso (vedere la tabella dei materiali) e un dispositivo per elettroagopuntura (vedere la tabella dei materiali) per la procedura (figura 4).
3. Posizionare il topo in posizione prona in leggera anestesia con isoflurano allo 0,5%, assicurandosi che la testa e gli arti siano immobilizzati. Tenere un ago in acciaio inossidabile (diametro: 0,18 mm; lunghezza: 7 mm) con la mano destra, usando il pollice, l'indice e il medio.
4. Eseguire l'agopuntura sui punti di agopuntura GV20 e GV24 trasversalmente per 2 mm di profondità, sollevando la pelle sulla testa del topo con la mano sinistra. Perforare il punto di agopuntura ST36 verticalmente per una profondità di 3-4 mm toccando la testa del perone sul lato laterale dell'articolazione del ginocchio del topo e premendo sulla pelle con il pollice sinistro.
   NOTA: Per i punti di agopuntura situati sulla testa, si consiglia di inserire gli aghi nella sequenza di GV24 seguita da GV20. Questo ordine facilita la comodità operativa. I punti di agopuntura sono posizioni anatomiche discrete piuttosto che punti stazionari. Di conseguenza, lievi deviazioni nell'angolo di inserimento dell'ago non hanno alcun effetto sull'efficacia terapeutica, analogamente osservata nei pazienti sottoposti a trattamento di elettroagopuntura in ambito clinico.
5. Collegare il dispositivo elettronico di agopuntura agli aghi, con GV20 e l'ST36 sinistro collegati a un set di elettrodi e GV24 e l'ST36 destro collegati a un altro (Figura 4). Selezionare la modalità ad onda continua, con un'intensità di corrente elettrica di 2 mA e una frequenza di 2 Hz ^20,21. Confermare il trattamento ideale osservando lievi tremori locali nei punti di agopuntura e una tranquilla tolleranza da parte del topo.
   1. Quando si collega lo strumento elettrico per agopuntura, collegare l'estremità prossimale dell'ago. Questo aiuta a ridurre al minimo l'impatto causato dal peso della linea di connessione e di conseguenza migliora la prevenzione del distacco dell'ago. Se necessario, utilizzare del nastro adesivo per fissare l'ago inserito orizzontalmente e la linea di connessione.
6. Somministrare il trattamento giornaliero per 30 minuti al giorno per 6 giorni consecutivi, con un solo giorno di riposo tra un ciclo di trattamento e l'altro.

4. Test in campo aperto (Figura 5)

NOTA: Il test in campo aperto è un metodo convenzionale utilizzato per valutare il comportamento autonomo, il comportamento esplorativo, le capacità cognitive e il comportamento ansioso di animali da esperimento in ambienti nuovi e sconosciuti²². È costituito da una scatola di reazione in campo aperto e da un dispositivo di registrazione.

1. Per eseguire la prova, preparare un cubo a pareti bianche di 50 cm × 50 cm × 30 cm, con il fondo diviso in 25 quadrati uguali di 10 cm × 10 cm.
2. Posizionare il mouse nella casella di reazione in campo aperto per l'acclimatazione. Consenti al mouse di esplorare la stanza di prova e familiarizzare con il nuovo ambiente durante il periodo di acclimatazione. Eseguire il test in campo aperto dopo aver acclimatato il topo all'ambiente sperimentale per 1 ora.
   NOTA: Questo garantisce la minimizzazione dell'ansia o dello stress indotto dalle alterazioni dell'ambiente, consentendo così esiti più precisi durante le successive valutazioni comportamentali.
3. Posiziona il mouse al centro della scatola e monitoralo per 10 minuti dopo aver permesso al mouse di adattarsi all'ambiente per 2 minuti.
   1. Utilizzare un sistema di tracciamento video (vedere la tabella dei materiali) per registrare la traiettoria di movimento del mouse, la distanza totale percorsa, il tempo trascorso nell'area centrale, la velocità di attraversamento dell'area centrale e il numero di ingressi nell'area centrale durante il test.
   2. Eseguire le operazioni pertinenti come indicato nel manuale del prodotto del sistema di tracciamento video. Ogni topo viene sottoposto a un singolo test e inizia l'esplorazione dalla stessa posizione all'interno della scatola.
   3. Dopo ogni test, pulire la scatola da campo aperta con etanolo al 75% per evitare falsi risultati causati dall'interferenza degli odori quando si utilizza un mouse.

5. Labirinto d'acqua (Figura 5)

NOTA: Il test del labirinto d'acqua è spesso impiegato come strumento di valutazione comportamentale in esperimenti che coinvolgono topi per valutare le loro capacità di apprendimento spaziale e di memoria²³.

1. Preparare un serbatoio d'acqua circolare con un diametro di 120 cm e una profondità di 30 cm. Dividi il serbatoio in quattro quadranti uguali: I, II, III e IV. Se si utilizzano topi neri nell'esperimento, utilizzare un serbatoio di acqua bianca; Per i topi bianchi, utilizzare un serbatoio delle acque nere.
2. Posiziona delle tende intorno al serbatoio dell'acqua circolare per evitare che il topo veda i ricercatori durante il test.
3. Posizionare diversi marcatori sulla superficie superiore del serbatoio dell'acqua come segnali visivi per l'orientamento spaziale. Assicurarsi che questi marcatori rimangano fermi per tutta la durata dell'esperimento per mantenere la coerenza.
4. Posizionare una piattaforma circolare con un diametro di 10 cm nel quadrante III del serbatoio dell'acqua come area di destinazione designata. Assicurati che la piattaforma possa essere facilmente spostata e fissata in qualsiasi posizione desiderata.
5. Durante l'esperimento, introdurre acqua nel serbatoio mantenendo un intervallo di temperatura di 22-24 °C.
   1. Assicurarsi che il livello dell'acqua rimanga costantemente 1 cm sopra la piattaforma target. Includi una concentrazione del 20% di biossido di titanio non tossico nell'acqua per ottenere un netto contrasto tra i topi neri e lo sfondo bianco. Questo contrasto facilita la registrazione da parte della fotocamera dei movimenti del mouse e dei parametri rilevanti.
6. Condurre un test di esplorazione spaziale continua di 5 giorni posizionando in sequenza ciascun topo nei quadranti I, II, III e IV.
   1. Posiziona il mouse rivolto verso il muro. Allontanati dal labirinto per evitare che il mouse usi la posizione dello sperimentatore come punto di riferimento. Registra il tempo impiegato dal mouse per trovare la piattaforma.
   2. Se il mouse non riesce a localizzare la piattaforma subacquea entro 90 secondi, guidare il mouse verso la piattaforma e fornire un periodo di apprendimento di 30 secondi. Inoltre, registrare il periodo di latenza come 90 s.
   3. Se il mouse individua la piattaforma subacquea entro 90 secondi, lasciarla rimanere sulla piattaforma per 10 secondi per l'apprendimento prima di rimuoverla dal serbatoio dell'acqua.
   4. Asciuga il topo con un asciugamano e rimettilo nella sua gabbia.
   5. Ruota la posizione di ciascun mouse in ogni quadrante ogni 20 minuti. Registra la distanza di nuoto, la velocità e il tempo impiegato da ciascun mouse per trovare la piattaforma (il periodo di latenza) utilizzando il sistema di tracciamento video (vedi Tabella dei materiali), eseguendo le operazioni pertinenti come indicato nel manuale del prodotto.
   6. Posiziona la piattaforma a 1 cm sopra la superficie dell'acqua il giorno 1. Posiziona la piattaforma a una profondità di 1 cm sotto la superficie dell'acqua nei giorni 2-5.
7. Il giorno 6, rimuovi la piattaforma dal quadrante di destinazione e conduci un test di esplorazione spaziale.
   1. Posiziona il mouse nel quadrante I per esplorare liberamente per 90 s. Il computer registra la traiettoria di nuoto del mouse, il tempo trascorso nel quadrante bersaglio e il numero di volte in cui attraversa la piattaforma.
      NOTA: Al fine di ridurre al minimo gli errori sperimentali causati da fattori umani, è importante mantenere la posizione del punto di riferimento fissa nell'esperimento del labirinto d'acqua. Inoltre, lo sperimentatore dovrebbe ritirarsi immediatamente dopo aver messo il topo in acqua. Al termine dell'esperimento, i topi devono essere asciugati con un asciugamano e rimessi nelle loro gabbie per mantenere il calore.

6. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE) (Figura 6)

NOTA: L'esame istologico della regione ippocampale aiuta a valutare l'istituzione del modello di ipossia e a determinare l'efficacia del trattamento con agopuntura.

1. Dopo l'esperimento comportamentale, anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 20 mg/kg di pentobarbital sodico e perfonderlo con una soluzione di paraformaldeide al 10% (vedere Tabella dei materiali) per garantire la completa perfusione corporea. Isolare il tessuto cerebrale e immergerlo in una soluzione di paraformaldeide al 10% a temperatura ambiente (RT) per 3 giorni per ottenere la fissazione.
2. Metti i campioni di cervello in una scatola di inclusione. Successivamente, lavare i campioni di cervello processati con acqua corrente per 6 ore.
3. Utilizzare un processatore di tessuti automatizzato per disidratare i campioni utilizzando una serie di soluzioni alcoliche con concentrazioni crescenti, vale a dire, etanolo al 60% per 1 ora, etanolo al 70% per 1 ora, etanolo al 90% per 1 ora, etanolo al 95% per 2 ore e, infine, etanolo al 100% per 2 ore.
4. Immergere i campioni di tessuto nello xilene per 2 ore per ottenere la trasparenza. Successivamente, al termine del processo di disidratazione, trasferire i campioni permeabilizzati in cera di paraffina riscaldata a 60 °C per 3 h. Infine, incorporali in un processore automatico.
5. Utilizzare un'affettatrice rotativa per ottenere sezioni da 4 μm. Successivamente, sottoporre le sezioni alla colorazione con ematossilina per una durata compresa tra 3 e 8 minuti, seguita da colorazione con eosina per 1-3 minuti.
6. Trasferire in sequenza le sezioni macchiate in contenitori separati di alcool puro e xilene. Quindi, sigillare e fissare le sezioni colorate con gomma neutra in preparazione all'esame patologico al microscopio ottico.
7. Utilizzare uno scanner per diapositive (vedere Tabella dei materiali) per scansionare le fette. Successivamente, utilizzare il software di visualizzazione per ottenere i risultati della colorazione HE per la regione ippocampale. Confronta la disposizione dei neuroni e la condensazione dei nuclei neuronali.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Caratterizzazione delle traiettorie di locomozione del topo nell'esperimento in campo aperto
La mappa della traiettoria rivela che i topi del gruppo normale mostrano una profonda inclinazione per l'esplorazione in ambienti sconosciuti. Le loro traiettorie di attività sono concentrate principalmente negli angoli, coprendo l'intero campo aperto (pannello di sinistra). Al contrario, il gruppo di topi modello di ipossia a lungo termine mostra un desiderio significativamente diminuito di esplorare nuovi a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

L'agopuntura, una pratica medica non farmacologica nata in Cina oltre 2.000 anni fa, prevede l'inserimento di aghi sottili in punti specifici del corpo noti come punti di agopuntura. Si ritiene che questi punti siano collegati da canali o meridiani attraverso i^{quali scorre} l'energia vitale del corpo, o "qi". Stimolando questi punti, l'agopuntura mira a ripristinare l'equilibrio e l'armonia del corpo. È stato dimostrato che tratta efficacemente varie condizioni, tra cui dolore cronico, ansia/depre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106