慢性低酸素症誘発性認知機能障害のマウスモデルにおける鍼治療

要約

ここでは、慢性低酸素マウスモデルに軽度の麻酔と鍼治療を実施し、治療後の認知変化を評価するための行動テストを実施するためのプロトコルについて説明します。

要約

中枢神経疾患の治療は、常に医療分野に大きな課題を投げかけてきました。鍼灸治療は、伝統的な中国医学に根ざした非薬理学的実践であり、体の正確なポイントに細い鍼を挿入することを伴い、さまざまな状態の管理に一般的に採用されています。最近、鍼治療は、不安障害や呼吸器疾患を含むさまざまな神経疾患に対する有望な治療介入として浮上しています。しかし、慢性低酸素症によって引き起こされる認知機能障害の治療における鍼治療の可能性はまだ調査されていません。この論文では、慢性低酸素症誘発性認知障害のマウスモデルを確立し、軽度の麻酔を投与し、鍼治療を行い、オープンフィールドテストと水迷路を使用して行動変化と記憶能力を評価するための包括的なプロトコルを提示します。ステップバイステップのプロトコルは、認知機能を改善するためにツボと針を正確に位置決めし、配置するための詳細な指示を提供します。このプロトコルを採用することにより、研究者は体系的な研究を実施して、認知機能障害に対する鍼治療の治療の可能性を徹底的に評価することができます。

概要

現在、世界の人口は深刻な高齢化問題に直面しており、その結果、認知障害の有病率が急速に増加しています。認知障害の世界的な発生率は、1000人年あたり約53.97人です¹。血管機能障害や循環器・呼吸器疾患による慢性脳低酸素症は、加齢性認知症の主要な危険因子の1つです²。これまでの研究では、脳低酸素症がBACE1の発現^を修飾することにより、アミロイドβ沈着を増加させることが実証されています3。さらに、低酸素症はグリア細胞の調節不全や神経炎症と関連しています^4,5。この問題の深刻さが増しているにもかかわらず、慢性的な低酸素症による認知機能低下を予防する有効な西洋医学は、現在不足しています。非薬理学的伝統医学、特に鍼治療は、認知障害の治療に何千年もの間使用されており、神経変性疾患の緩和に有望な結果を示しています^6,7。Baihui、Shenting、およびZusanliのツボは、認知機能障害の治療に効果的なポイントです^8,9。臨床研究では、電気鍼治療が血管性認知障害のある患者のモントリオール認知評価(MoCA)およびミニメンタルステート検査(MMSE)スコアを大幅に改善し、認知機能障害を効果的に改善することが実証されています⁸。鍼治療は、動脈結紮(急性脳低酸素症モデル¹⁰、急性脳低酸素モデル)を有するラットの記憶能力を有意に向上させることができることが研究で示唆されているが、慢性低酸素症誘発性認知障害を有するげっ歯類モデルにおける鍼治療の効果に関する報告はない。メカニズムに関する研究の欠如は、その臨床応用をかなり妨げています。

これまでの研究では、ラットを低酸素環境に8週間さらすと、脳内の酸化ストレスと炎症のレベルが著しく上昇し、記憶機能が低下することが実証されています¹¹。本研究は、鍼治療がげっ歯類モデルに及ぼす影響を調査し、理解を深めることを目的としています。ただし、げっ歯類の鍼治療では、繰り返し刺激すると興奮する可能性があるため、通常、麻酔が必要になることは注目に値します。麻酔薬のほとんどが神経活動を抑制し、情報処理を阻害し、行動障害につながる可能性があるため、麻酔の長期化はマウスの認知機能に大きな影響を与える可能性があります¹²。いくつかの研究は、2.5%セボフルランを6時間投与すると、マウスの空間記憶、学習能力、および注意力を著しく損なう可能性があることを示しています¹³。さらに、高用量の麻酔がマウスの神経細胞死または神経損傷を引き起こす可能性があることを示唆する証拠^{があります14}。したがって、使用される麻酔の総量を最小限に抑えるための適切なアプローチを特定することが不可欠です。本研究では、認知機能障害のあるマウスの治療に有効な鍼治療法と、記憶力を評価するための行動テストについて紹介する。重要なのは、実験中に投与される麻酔の総投与量を効果的に減らすことができる修正された治療前の麻酔技術を提示することです。

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プロトコル

動物実験は、河北宜陵医学研究所動物研究倫理委員会(承認番号:N2022148)の承認を得て実施された。体重18-22gの雄のC57BL/6Jマウス( 資料表参照)を河北宜陵医学研究所の新薬評価センターに収容した。彼らは通常の食料ときれいな水を与え、毎日12時間人工光にさらされました。部屋は20〜26°Cの制御された温度範囲と40%〜70%の相対湿度を維持しました。

1. 慢性低酸素マウスモデルの確立(図1)

1. 実験開始前に、常圧下の動物ケージと低酸素環境を継続して準備する。自動ガス制御供給システムを利用して、純粋な酸素と窒素の混合物でチャンバーを洗い流すことにより、継続的な低酸素環境を確立します。
   注:このシステムは、電磁バルブスイッチを制御するようにプログラムされているため、時間と濃度の両面でガスを正確に供給できます。
2. マウスを対照群(Con)、モデル群(CH)、電気鍼治療群(EA + CH)の3つのグループにランダムに分けます。コントロールマウスとモデル鍼治療マウス/電気鍼治療マウスを2つのケージに別々に配置し、ケージごとに10匹のマウスを配置します。ライトサイクルを12時間/ 12時間(ライト/ダーク)に維持します。
   注:対照群(Con)では治療や低酸素症は誘発されません。モデル群(CH)は、慢性低酸素症のマウスで構成されています。電気鍼治療群(EA + CH)は、電気鍼治療で治療された低酸素誘発マウスを含む。
3. 慢性低酸素症を発症する場合は、デジタル酸素計を利用してガス流量を調整し、酸素濃度を10%に維持することにより、低酸素チャンバーのパラメータを確立します。動物を午前9:00に低酸素チャンバーに入れ、午後5:00に動物を除去すると、3か月間、1日あたり合計8時間の連続した低酸素曝露が可能になります。
   注意: 酸素濃度を下げるために窒素ガスの供給を設定する場合は、動物の死亡につながるため、一度に窒素ガスが過剰に導入されないようにゆっくりと進めることをお勧めします。
4. 慢性低酸素症誘発性認知機能障害モデルを組織学的検査と行動検査(オープンフィールドテスト¹⁵ と水迷路テスト¹⁶)を使用して評価します。

2.麻酔(図2)

1. 小動物麻酔器( 材料表参照)と恒温温パッドを準備します。
   注:麻酔中、動物は低体温症になりやすいため、断熱のために恒温加熱パッドを使用する必要性が強調されています。
2. マウスを麻酔導入ボックスに入れ、酸素中の2%〜2.5%イソフルラン( 材料表を参照)で約1分間すばやく誘導します。
   注:この短期間の前処理は、マウスが低濃度の投与量で長期間繁栄できるようにするための重要なステップです。
3. 興奮性が低下したら、マウスのつま先をつまんで反射を確認します。次に、マウスを恒温加熱パッド(37°C)に移します。
4. 麻酔流量を約0.5%濃度に調整します。麻酔器をマウスの口と鼻に接続します。電気鍼治療は、麻酔の維持を確実にしながら進めます。
   注:麻酔の効果は、マウスがまばたきを止めたときに確認されました。麻酔の効果は少なくとも30分間持続します。

3.電気鍼治療

1. 認知機能障害を効果的に改善するには、伝統的な中国医学の理論と臨床経験に基づいて、白慧(GV20)、神亭(GV24)、両側図山里(ST36)などの特定のツボを選択します(図3)。モデリングプロセスが完了する2週間前に電気鍼治療を実施します。
   1. GV20の経穴を額の正中線、耳の先端を結ぶ線の中間点に位置^{決めします7}。鍼の挿入深さは2mmでなければなりません。
   2. 額の正中線上のマウスの目の中点の真上に1.3mmのGV24経穴¹⁷を見つけます。鍼の挿入深さは2mmでなければなりません。
   3. 腓骨の頭から約2mm下の膝関節の外側にST36経穴を見つけます^18,19。鍼の挿入深さは3〜4mmでなければなりません。
2. 処置のために、使い捨ての鍼( 材料表を参照)と電気鍼治療装置( 材料表を参照)を準備します(図4)。
3. マウスを腹臥位に置き、0.5%イソフルランを含む軽度の麻酔をかけ、頭と手足が固定されるようにします。ステンレス製の針(直径0.18mm、長さ7mm)を右手で親指、人差し指、中指で持ちます。
4. GV20とGV24のツボを横方向に2mmの深さで鍼治療を行い、左手でマウスの頭の皮膚を持ち上げます。マウスの膝関節の外側にある腓骨頭に触れ、左手の親指で皮膚を押して、ST36のツボを垂直に3〜4mmの深さで穴を開けます。
   注意: 頭部にあるツボについては、GV24の後にGV20の順番で針を挿入することをお勧めします。この順序により、操作の利便性が向上します。経穴は、静止したツボではなく、個別の解剖学的位置です。その結果、鍼の挿入角度のわずかなずれは、臨床現場で電気鍼治療を受けている患者に見られるように、治療効果に影響を与えません。
5. 電子鍼治療装置を鍼に接続し、GV20と左ST36を1つの電極セットに接続し、GV24と右ST36を別の電極セットに接続します(図4)。電流強度2mA、周波数2Hzの連続波モードを選択します^20,21。ツボの局所的な軽度の震えとマウスの静かな耐性を観察することにより、理想的な治療法を確認します。
   1. 電気鍼灸器具を接続するときは、針の近位端を接続します。これにより、接続ラインの重量による影響を最小限に抑え、針の脱落防止に優れています。必要に応じて、粘着テープを使用して、水平に挿入された針と接続線を固定します。
6. 毎日30分間、6日間連続して毎日治療を行い、各治療サイクルの間に1日の休息を挟みます。

4. 野外試験(図5)

注:オープンフィールドテストは、新しい環境やなじみのない環境における実験動物の自律行動、探索行動、認知能力、および不安行動を評価するために使用される従来の方法です²²。これは、オープンフィールド反応ボックスと記録装置で構成されています。

1. テストを実施するには、50 cm×50 cm × 30 cmの白い壁の立方体を用意し、底を10 cm×10 cmの25の等しい正方形に分割します。
2. マウスをオープンフィールドリアクションボックスに置いて順応させます。順応期間中は、マウスが試験室を探索し、新しい環境に慣れるようにします。マウスを実験環境に1時間順応させた後、オープンフィールドテストを実施します。
   注:これにより、環境の変化によって引き起こされる不安やストレスを最小限に抑えることができるため、その後の行動評価でより正確な結果を得ることができます。
3. マウスをボックスの中央に置き、マウスを10分間環境に適応させた後、2分間監視します。
   1. ビデオトラッキングシステム( 資料表を参照)を使用して、マウスの動きの軌跡、総移動距離、中央エリアで費やした時間、中央エリアを横切る速度、およびテスト中の中央エリアへの進入回数を記録します。
   2. ビデオトラッキングシステムの製品マニュアルの指示に従って、関連する操作を実行します。各マウスは 1 回のテストを受け、ボックス内の同じ場所から探索を開始します。
   3. 各テストの後、マウス使用時の臭いの干渉によって引き起こされる誤った結果を防ぐために、オープンフィールドボックスを75%エタノールで洗浄します。

5.水迷路(図5)

注:水迷路テストは、マウスの空間学習と記憶能力を評価するための実験で、行動評価ツールとして頻繁に採用されています²³。

1. 直径120cm、深さ30cmの円形の水槽を用意します。タンクをI、II、III、IVの4つの等しい象限に分割します。実験で黒いマウスを使用する場合は、白い水タンクを使用してください。白いマウスの場合は、黒い水タンクを使用してください。
2. 円形の水槽の周りにカーテンを敷き、テスト中にマウスが研究者を見ないようにします。
3. 水タンクの上面にさまざまなマーカーを配置して、空間方向を示す視覚的な手がかりとします。一貫性を維持するために、実験全体を通してこれらのマーカーが静止していることを確認してください。
4. 水タンクの象限IIIに直径10cmの円形プラットフォームを指定されたターゲットエリアとして配置します。プラットフォームを簡単に移動し、任意の場所に固定できることを確認します。
5. 実験全体を通して、22〜24°Cの温度範囲を維持しながらタンクに水を導入します。
   1. 水位がターゲットプラットフォームから常に1cm上に保たれるようにします。20%濃度の無毒な二酸化チタンを水中に含めて、黒いマウスと白い背景の間に明確なコントラストを実現します。このコントラストにより、マウスの動きと関連するパラメータをカメラが記録しやすくなります。
6. 各マウスを象限I、II、III、IVに順番に配置して、5日間の連続空間探索テストを実施します。
   1. マウスを壁に向けて配置します。迷路から離れて、マウスが実験者の位置を参照点として使用しないようにします。マウスがプラットフォームを見つけるのにかかった時間を記録します。
   2. マウスが90秒以内に水中プラットフォームを見つけられない場合は、マウスをプラットフォームに誘導し、30秒の学習期間を提供します。さらに、待機時間を 90 秒として記録します。
   3. マウスが90秒以内に水中プラットフォームを見つけた場合は、水タンクから取り外す前に、学習のために10秒間プラットフォームにとどまらせてください。
   4. マウスをタオルで乾かし、ケージに戻します。
   5. 各象限の各マウスの配置を 20 分ごとに回転させます。ビデオトラッキングシステム( 資料表を参照)を使用して、各マウスの泳ぐ距離、速度、およびプラットフォームを見つけるのにかかった時間(遅延時間)を記録し、製品マニュアルの指示に従って関連する操作を実行します。
   6. 1日目にプラットフォームを水面から1cm上に設置します。2〜5日目に水面下1cmの深さにプラットフォームを置きます。
7. 6 日目に、ターゲット クアドラントからプラットフォームを取り外し、空間探索テストを実施します。
   1. マウスを象限 I に置いて、90 秒間自由に探索します。コンピューターは、マウスの遊泳軌跡、ターゲット象限で費やした時間、およびマウスがプラットフォームを横切った回数を記録します。
      注:人的要因によって引き起こされる実験エラーを最小限に抑えるために、水迷路実験では基準点の位置を固定しておくことが重要です。さらに、実験者はマウスを水中に置いた後、すぐに後退する必要があります。実験終了後、マウスをタオルで乾かし、ケージに戻して暖かさを保ちます。

6. ヘマトキシリンとエオシン(HE)の染色(図6)

注:海馬領域の組織学的検査は、低酸素モデルの確立を評価し、鍼治療の有効性を判断するのに役立ちます。

1. 行動実験の後、20 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけ、10%パラホルムアルデヒド溶液( 材料表を参照)で灌流して、完全な体灌流を確保します。.脳組織を単離し、室温(RT)で10%パラホルムアルデヒド溶液に3日間浸漬して固定します。
2. 脳サンプルを埋め込みボックスに入れます。続いて、処理した脳サンプルを流水で6時間洗浄します。
3. 自動組織処理装置を使用して、濃度を上げた一連のアルコール溶液、すなわち、60%エタノールで1時間、70%エタノールで1時間、95%エタノールで2時間、最後に100%エタノールで2時間、サンプルを脱水します。
4. 組織標本をキシレンに2時間浸漬し、透明性を確保します。続いて、脱水プロセスが完了したら、透過処理したサンプルを60°Cに3時間加熱したパラフィンワックスに移します。最後に、それらを自動プロセッサに埋め込みます。
5. ロータリースライサーを使用して、4μmの切片を取得します。続いて、切片を3〜8分間ヘマトキシリン染色し、続いて1〜3分間エオシン染色します。
6. 染色した切片を、純アルコールとキシレンの別々の容器に順次移します。次に、光学顕微鏡での病理学的検査に備えて、染色切片を中性ガムで密封して固定します。
7. スライドスキャナー( 材料表を参照)を使用してスライスをスキャンします。続いて、表示ソフトウェアを利用して、海馬領域のHE染色結果を取得します。ニューロンの配置とニューロン核の凝縮を比較します。

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結果

オープンフィールド実験におけるマウスの移動軌跡の特性評価
軌道図から、正常群のマウスは、不慣れな環境での探索に強い傾向を示すことがわかった。その活動の軌跡は、主にコーナーに集中し、オープンフィールド全体をカバーしています(左パネル)。対照的に、長期低酸素モデル群のマウスは、新しい環境を探索したいという欲求が著しく減少している。それらは主に?...

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ディスカッション

鍼灸は、2,000年以上前に中国で発祥した非薬理学的医療行為で、経穴と呼ばれる体の特定の部位に細い鍼を刺します。これらの点は、身体の生命エネルギー、つまり「気」が流れるチャネルまたは経絡によって接続されていると考えられています²⁴。鍼灸治療は、これらのツボを刺激することで、体のバランスと調和を取り戻すことを目的としています。慢性疼痛、不安/う?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106