Tratamento com acupuntura em modelo murino de disfunção cognitiva induzida por hipóxia crônica

Resumo

Descrevemos um protocolo para implementação de anestesia leve e acupuntura em um modelo de camundongo com hipóxia crônica e realização de testes comportamentais para avaliar as alterações cognitivas pós-tratamento.

Resumo

O tratamento das desordens do sistema nervoso central tem consistentemente colocado desafios significativos para a área médica. A acupuntura, uma prática não farmacológica enraizada na medicina tradicional chinesa, envolve a inserção de agulhas finas em pontos precisos do corpo e é comumente empregada para o manejo de diversas condições. Recentemente, a acupuntura emergiu como uma intervenção terapêutica promissora para uma série de doenças neurológicas, incluindo ansiedade e distúrbios respiratórios. No entanto, o potencial da acupuntura no tratamento da disfunção cognitiva induzida pela hipóxia crônica ainda não foi explorado. Este artigo apresenta um protocolo abrangente para estabelecer um modelo de camundongo de comprometimento cognitivo induzido por hipóxia crônica, administrar anestesia leve, realizar tratamento de acupuntura e avaliar mudanças comportamentais e habilidades de memória usando testes de campo aberto e labirintos aquáticos. O protocolo passo-a-passo fornece instruções detalhadas sobre como localizar e posicionar com precisão acupontos e agulhas para melhoria cognitiva. Ao empregar esse protocolo, os pesquisadores podem realizar estudos sistemáticos para avaliar minuciosamente o potencial terapêutico da acupuntura para disfunção cognitiva.

Introdução

A população mundial enfrenta atualmente um problema crítico de envelhecimento, resultando em um rápido aumento na prevalência de distúrbios cognitivos. A incidência mundial de comprometimento cognitivo é de aproximadamente 53,97 por 1000 pessoas-ano¹. A hipóxia cerebral crônica causada por disfunção vascular ou distúrbios circulatórios/respiratórios continua sendo um dos principais fatores de risco para demência relacionada à idade². Estudos prévios demonstraram que a hipóxia cerebral pode aumentar a deposição de β amiloide modificando a expressão de BACE1³. Além disso, a hipóxia tem sido associada à desregulação das células gliais e neuroinflamação ^4,5. Apesar da crescente magnitude desse problema, atualmente faltam medicamentos ocidentais eficazes para prevenir o declínio cognitivo induzido pela hipóxia crônica. A medicina tradicional chinesa não farmacológica, particularmente a acupuntura, tem sido utilizada há milhares de anos para tratar distúrbios cognitivos e tem mostrado resultados promissores no alívio de doenças neurodegenerativas ^6,7. Os acupontos de Baihui, Shenting e Zusanli são pontos efetivos no tratamento da disfunção cognitiva ^8,9. Estudos clínicos demonstraram que a terapia eletroacupuntura melhora significativamente os escores Montreal Cognitive Assessment (MoCA) e Mini-Mental State Examination (MEEM) em pacientes com comprometimento cognitivo vascular e melhora efetivamente a disfunção cognitiva⁸. Embora estudos tenham sugerido que a acupuntura pode aumentar significativamente a capacidade de memória de ratos com ligadura arterial - um modelo de hipóxia cerebral aguda¹⁰, um modelo de hipóxia cerebral aguda, não há relato sobre os efeitos da acupuntura em qualquer modelo de roedor com distúrbios cognitivos induzidos por hipóxia crônica. A falta de pesquisas sobre o mecanismo tem impedido consideravelmente sua aplicação clínica.

Pesquisas anteriores demonstraram que submeter ratos a um ambiente hipóxico por um período de 8 semanas pode elevar significativamente os níveis de estresse oxidativo e inflamação no cérebro, resultando em um declínio na função de memória¹¹. O presente estudo tem como objetivo investigar o impacto da acupuntura em modelos de roedores, a fim de aprofundar nosso entendimento. Vale notar, no entanto, que a anestesia é tipicamente necessária durante o tratamento de acupuntura em roedores devido ao potencial de agitação durante estímulos repetidos. A anestesia prolongada pode afetar significativamente a função cognitiva em camundongos, pois a maioria dos fármacos anestésicos pode suprimir a atividade neural e impedir o processamento de informações, levando a déficits comportamentais¹². Vários estudos demonstraram que a administração de sevoflurano a 2,5% por uma duração de 6 h pode prejudicar notavelmente a memória espacial, a capacidade de aprendizagem e a atenção em camundongos¹³. Além disso, evidências sugerem que altas doses de anestesia podem resultar em morte neuronal ou lesão nervosa em camundongos¹⁴. Portanto, é imperativo identificar uma abordagem adequada para minimizar a quantidade total de anestesia utilizada. Neste estudo, apresentamos um método de acupuntura eficaz para o tratamento de camundongos com comprometimento cognitivo, juntamente com testes comportamentais para avaliar suas habilidades de memória. É importante ressaltar que apresentamos uma técnica anestésica pré-tratamento modificada que pode efetivamente reduzir a dose total de anestesia administrada durante o experimento.

Protocolo

Os experimentos com animais foram conduzidos com a aprovação do Comitê de Pesquisa e Ética Animal do Instituto de Pesquisa Médica Hebei Yiling (número de aprovação: N2022148). Camundongos machos C57BL/6J pesando 18-22 g (ver Tabela de Materiais) foram alojados no novo centro de avaliação de medicamentos do Instituto de Pesquisa Médica Hebei Yiling. Eles receberam alimentação normal e água limpa e foram expostos à luz artificial por 12 h diariamente. As salas mantiveram uma faixa de temperatura controlada de 20-26 °C e umidade relativa do ar de 40%-70%.

1. Estabelecimento de um modelo de camundongo com hipóxia crônica (Figura 1)

1. Antes de iniciar o experimento, prepare gaiolas de animais sob pressão atmosférica normal e gaiolas com um ambiente contínuo de baixo oxigênio. Estabeleça um ambiente contínuo de baixo oxigênio utilizando um sistema automatizado de fornecimento de gás para lavar a câmara com uma mistura de oxigênio e nitrogênio puros.
   NOTA: Este sistema é programado para controlar o interruptor da válvula eletromagnética, garantindo assim a entrega precisa do gás em termos de tempo e concentração.
2. Divida aleatoriamente os camundongos em três grupos: um grupo controle (Con), um grupo modelo (CH) e um grupo eletroacupuntura (EA + CH). Coloque camundongos controle e modelo/eletroacupuntura separadamente nas duas gaiolas, com 10 camundongos por gaiola. Manter o ciclo de luz em 12 h/12 h (claro/escuro).
   NOTA: Nenhum tratamento ou hipóxia é induzida no grupo controle (Con). O grupo modelo (HC) é composto por camundongos com hipóxia crônica. O grupo eletroacupuntura (EA + CH) é composto por camundongos induzidos por hipóxia tratados com eletroacupuntura.
3. Para o desenvolvimento de hipóxia crônica, estabelecer os parâmetros da câmara de baixo oxigênio utilizando um medidor de oxigênio digital para regular a taxa de fluxo de gás e manter uma concentração de oxigênio de 10%. Colocar os animais dentro da câmara de baixo oxigênio às 9:00 horas e retirá-los às 17:00 horas, resultando em um total de 8 h de exposição ininterrupta a baixo oxigênio por dia durante 3 meses.
   NOTA: Ao configurar a entrega de gás nitrogênio para reduzir a concentração de oxigênio, é aconselhável proceder lentamente para evitar uma introdução excessiva de gás nitrogênio de uma só vez, pois levará a mortes de animais.
4. Avaliar o modelo de disfunção cognitiva induzida por hipóxia crônica por meio de exame histológico e testes comportamentais: teste de campo aberto¹⁵ e teste do labirinto aquático¹⁶.

2. Anestesia (Figura 2)

1. Prepare a máquina de anestesia de pequenos animais (ver Tabela de Materiais) e a almofada de aquecimento de temperatura constante.
   OBS: Durante a anestesia, os animais são suscetíveis à hipotermia, ressaltando a necessidade do uso de uma almofada de aquecimento em temperatura constante para isolamento.
2. Coloque o rato na caixa de indução anestésica e induza rapidamente com isoflurano a 2%-2,5% em oxigénio (ver Tabela de Materiais) durante aproximadamente 1 minuto.
   NOTA: Este pré-tratamento a curto prazo é um passo crucial para garantir que os ratos possam prosperar sob dosagem de baixa concentração por um longo período de tempo.
3. Uma vez que sua excitabilidade diminuiu, aperte o dedo do mouse para verificar seu reflexo. Em seguida, transfira o mouse para a almofada de aquecimento de temperatura constante (37 °C).
4. Ajustar o fluxo de anestesia para aproximadamente 0,5% de concentração. Conecte o aparelho de anestesia à boca e ao nariz do mouse. Prossiga com o tratamento de eletroacupuntura, garantindo a manutenção da anestesia.
   NOTA: O efeito da anestesia foi confirmado quando os ratos pararam de piscar. O efeito da anestesia pode durar pelo menos 30 minutos.

3. Tratamento eletroacupuntura

1. Para melhorar efetivamente a disfunção cognitiva, selecione acupontos específicos, como Baihui (GV20), Shenting (GV24) e Zusanli bilateral (ST36), com base na teoria da medicina tradicional chinesa e na experiência clínica (Figura 3). Administrar o tratamento de eletroacupuntura 2 semanas antes da conclusão do processo de modelagem.
   1. Localizar o acuponto GV20 na linha média da testa, no ponto médio de uma linha que liga as pontas das orelhas⁷. A profundidade de inserção da agulha de acupuntura deve ser de 2 mm.
   2. Localizar o acuponto GV24 1,3 mm diretamente acima do ponto médio dos olhos do camundongo na linha média da testa¹⁷. A profundidade de inserção da agulha de acupuntura deve ser de 2 mm.
   3. Localizar o acuponto ST36 na parte externa da articulação do joelho, cerca de 2 mm abaixo da cabeça da fíbula^18,19. A profundidade de inserção da agulha de acupuntura deve ser de 3-4 mm.
2. Prepare agulhas de acupuntura descartáveis (ver Tabela de Materiais) e um dispositivo de eletroacupuntura (ver Tabela de Materiais) para o procedimento (Figura 4).
3. Coloque o camundongo em decúbito ventral sob anestesia leve com isoflurano a 0,5%, garantindo que suas cabeças e membros estejam imobilizados. Segure uma agulha de aço inoxidável (diâmetro: 0,18 mm; comprimento: 7 mm) com a mão direita, usando o polegar, o indicador e o dedo médio.
4. Realizar acupuntura nos acupontos GV20 e GV24 transversalmente por 2 mm de profundidade, levantando a pele da cabeça do mouse com a mão esquerda. Puncione o acuponto ST36 verticalmente para 3-4 mm de profundidade tocando a cabeça da fíbula na face lateral da articulação do joelho do mouse e pressionando a pele com o polegar esquerdo.
   OBS: Para os acupontos localizados na cabeça, é aconselhável inserir as agulhas na sequência de VG24 seguido de VG20. Esta ordem facilita a conveniência operacional. Os pontos de acupuntura são locais anatômicos discretos e não estacionários. Consequentemente, pequenos desvios no ângulo de inserção da agulha não têm efeito sobre a eficácia terapêutica, da mesma forma observados em pacientes que recebem tratamento com eletroacupuntura em ambientes clínicos.
5. Conectar o aparelho de acupuntura eletrônica às agulhas, com GV20 e ST36 esquerdo conectados a um conjunto de eletrodos e GV24 e ST36 direito conectados a outro (Figura 4). Selecione o modo de onda contínua, com intensidade de corrente elétrica de 2 mA e frequência de 2 Hz^20,21. Confirme o tratamento ideal observando tremores leves locais em acupontos e tolerância silenciosa pelo mouse.
   1. Ao conectar o instrumento de acupuntura elétrica, conecte a extremidade proximal da agulha. Isso ajuda a minimizar o impacto causado pelo peso da linha de conexão e, consequentemente, melhora a prevenção do descolamento da agulha. Se necessário, utilize fita adesiva para fixar a agulha inserida horizontalmente e a linha de conexão.
6. Administrar o tratamento diário por 30 min cada dia durante 6 dias consecutivos, com um único dia de descanso entre cada ciclo de tratamento.

4. Teste de campo aberto (Figura 5)

OBS: O teste de campo aberto é um método convencional utilizado para avaliar o comportamento autônomo, o comportamento exploratório, as habilidades cognitivas e o comportamento de ansiedade de animais experimentais em ambientes novos e não^familiares22. Consiste em uma caixa de reação de campo aberto e um dispositivo de gravação.

1. Para realizar o teste, prepare um cubo de paredes brancas medindo 50 cm × 50 cm × 30 cm, com o fundo dividido em 25 quadrados iguais medindo 10 cm × 10 cm.
2. Coloque o mouse na caixa de reação de campo aberto para aclimatação. Permita que o mouse explore a sala de testes e se familiarize com o novo ambiente durante o período de aclimatação. Realizar o teste de campo aberto após aclimatar o camundongo ao ambiente experimental por 1 h.
   OBS: Isso garante a minimização da ansiedade ou estresse induzidos por alterações no ambiente, possibilitando resultados mais precisos durante as avaliações comportamentais subsequentes.
3. Coloque o mouse no centro da caixa e monitore-o por 10 min depois de permitir que o mouse se adapte ao ambiente por 2 min.
   1. Use um sistema de rastreamento de vídeo (consulte a Tabela de Materiais) para registrar a trajetória do movimento do mouse, a distância total percorrida, o tempo gasto na área central, a velocidade de cruzamento da área central e o número de entradas na área central durante o teste.
   2. Execute as operações relevantes conforme as instruções no manual do produto do sistema de rastreamento de vídeo. Cada mouse passa por um único teste e começa a exploração do mesmo local dentro da caixa.
   3. Após cada teste, limpe a caixa de campo aberto com etanol 75% para evitar qualquer falso resultado causado pela interferência do odor ao usar um mouse.

5. Labirinto aquático (Figura 5)

NOTA: O teste do labirinto aquático é frequentemente empregado como uma ferramenta de avaliação comportamental em experimentos envolvendo camundongos para avaliar suas capacidades de aprendizagem espacial e memória²³.

1. Prepare um reservatório de água circular com diâmetro de 120 cm e profundidade de 30 cm. Divida o tanque em quatro quadrantes iguais: I, II, III e IV. Se usar ratos pretos no experimento, use um tanque de água branca; Para ratos brancos, use um tanque de água preto.
2. Coloque cortinas ao redor do tanque de água circular para evitar que o rato veja os pesquisadores durante o teste.
3. Posicione diferentes marcadores na superfície superior do tanque de água como pistas visuais para orientação espacial. Certifique-se de que esses marcadores permaneçam estacionários durante todo o experimento para manter a consistência.
4. Situar uma plataforma circular com um diâmetro de 10 cm no quadrante III da caixa d'água como a área alvo designada. Certifique-se de que a plataforma possa ser facilmente movida e protegida em qualquer local desejado.
5. Durante todo o experimento, introduza água no tanque, mantendo uma faixa de temperatura de 22-24 °C.
   1. Certifique-se de que o nível da água permaneça consistentemente 1 cm acima da plataforma alvo. Inclua uma concentração de 20% de dióxido de titânio não tóxico na água para conseguir um contraste distinto entre os ratos pretos e o fundo branco. Esse contraste facilita a gravação da câmera dos movimentos do mouse e parâmetros relevantes.
6. Realizar um teste de exploração espacial contínua de 5 dias colocando sequencialmente cada camundongo nos quadrantes I, II, III e IV.
   1. Posicione o mouse voltado para a parede. Afaste-se do labirinto para evitar que o mouse use a posição do experimentador como ponto de referência. Registre o tempo que o mouse leva para encontrar a plataforma.
   2. Se o mouse não conseguir localizar a plataforma subaquática dentro de 90 s, guie o mouse para a plataforma e forneça um período de aprendizado de 30 s. Além disso, registre o período de latência como 90 s.
   3. Se o mouse localizar a plataforma subaquática dentro de 90 s, deixe-a permanecer na plataforma por 10 s para aprendizado antes de removê-la do tanque de água.
   4. Seque o rato com uma toalha e devolva-o à gaiola.
   5. Gire o posicionamento de cada mouse em cada quadrante a cada 20 min. Registre a distância de natação, a velocidade e o tempo de cada mouse para encontrar a plataforma (o período de latência) usando o sistema de rastreamento de vídeo (consulte a Tabela de Materiais), realizando as operações relevantes conforme as instruções no manual do produto.
   6. Coloque a plataforma 1 cm acima da superfície da água no dia 1. Coloque a plataforma a uma profundidade de 1 cm abaixo da superfície da água nos dias 2-5.
7. No dia 6, remova a plataforma do quadrante alvo e realize um teste de exploração espacial.
   1. Coloque o mouse no Quadrante I para explorar livremente por 90 s. O computador registra a trajetória de natação do mouse, o tempo gasto no quadrante alvo e o número de vezes que ele cruza a plataforma.
      NOTA: Para minimizar erros experimentais causados por fatores humanos, é importante manter a posição do ponto de referência fixa no experimento de labirinto aquático. Além disso, o experimentador deve recuar imediatamente após colocar o camundongo na água. Após a conclusão do experimento, os camundongos devem ser secos com uma toalha e colocados de volta em suas gaiolas para manter o calor.

6. Coloração hematoxilina e eosina (HE) (Figura 6)

OBS: O exame histológico da região hipocampal auxilia na avaliação do estabelecimento do modelo de hipóxia e na determinação da eficácia do tratamento com acupuntura.

1. Após o experimento comportamental, anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 20 mg/kg de pentobarbital sódico e perfundi-lo com solução de paraformaldeído a 10% (ver Tabela de Materiais) para garantir a perfusão corporal completa. Isolar o tecido cerebral e mergulhá-lo em solução de paraformaldeído a 10% à temperatura ambiente (TR) por 3 dias para obter a fixação.
2. Coloque as amostras de cérebro em uma caixa de incorporação. Posteriormente, lave as amostras cerebrais processadas com água corrente por 6 h.
3. Empregar um processador de tecidos automatizado para desidratar as amostras usando uma série de soluções alcoólicas com concentrações crescentes, a saber, etanol 60% por 1 h, etanol 70% por 1 h, etanol 90% por 1 h, etanol 95% por 2 h e, finalmente, etanol 100% por 2 h.
4. Mergulhe os espécimes de tecido em xileno por 2 h para obter transparência. Posteriormente, após a conclusão do processo de desidratação, transferir as amostras permeabilizadas para cera de parafina aquecida a 60 °C por 3 h. Finalmente, incorpore-os em um processador automático.
5. Utilize um fatiador rotativo para obter seções de 4 μm. Em seguida, submeter os cortes à coloração de hematoxilina por um tempo que variou de 3-8 min, seguido de coloração de eosina por 1-3 min.
6. Transfira sequencialmente as seções coradas para recipientes separados de álcool puro e xileno. Em seguida, selar e fixar os cortes corados com goma neutra em preparação para exame anatomopatológico em microscópio óptico.
7. Utilize um scanner de slides (consulte Tabela de materiais) para digitalizar as fatias. Posteriormente, utilizar o software de visualização para obter os resultados da coloração HE para a região hipocampal. Comparar o arranjo dos neurônios e a condensação dos núcleos neuronais.

Resultados

Caracterização das trajetórias de locomoção de camundongos no experimento de campo aberto
O mapa de trajetória revela que camundongos do grupo normal exibem uma profunda inclinação para exploração em ambientes desconhecidos. Suas trajetórias de atividade se concentram principalmente nos cantos, cobrindo todo o campo aberto (painel esquerdo). Em contraste, o grupo modelo de hipóxia de longo prazo de camundongos exibe um desejo significativamente diminuído de explorar novos ambientes. Eles ...

Discussão

A acupuntura, uma prática médica não farmacológica originária da China há mais de 2.000 anos, envolve a inserção de agulhas finas em pontos específicos do corpo conhecidos como pontos de acupuntura. Acredita-se que esses pontos estejam conectados por canais ou meridianos através dos quais a energia vital do corpo, ou "qi", flui²⁴. Ao estimular esses pontos, a acupuntura visa restaurar o equilíbrio e a harmonia do corpo. Tem sido demonstrado que trata efetivamente várias condições, in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106