Лечение иглоукалыванием на мышиной модели хронической когнитивной дисфункции, вызванной гипоксией

Резюме

В этой статье мы опишем протокол применения мягкой анестезии и иглоукалывания на мышиной модели с хронической гипоксией и проведения поведенческих тестов для оценки когнитивных изменений после лечения.

Аннотация

Лечение центральных нервных расстройств неизменно ставит перед медициной серьезные задачи. Иглоукалывание, нефармакологическая практика, уходящая корнями в традиционную китайскую медицину, включает в себя введение тонких игл в точные точки на теле и обычно используется для лечения различных заболеваний. В последнее время иглоукалывание стало многообещающим терапевтическим вмешательством при ряде неврологических заболеваний, включая тревожные и респираторные расстройства. Тем не менее, потенциал иглоукалывания в лечении когнитивной дисфункции, вызванной хронической гипоксией, еще не изучен. В данной работе представлен комплексный протокол для создания мышиной модели хронических когнитивных нарушений, вызванных гипоксией, введения мягкой анестезии, проведения лечения иглоукалыванием и оценки поведенческих изменений и способностей памяти с использованием тестов в открытом поле и водных лабиринтов. Пошаговый протокол содержит подробные инструкции по точному нахождению и позиционированию акупунктурных точек и игл для улучшения когнитивных функций. Используя этот протокол, исследователи могут проводить систематические исследования для тщательной оценки терапевтического потенциала иглоукалывания при когнитивной дисфункции.

Введение

В настоящее время население планеты сталкивается с серьезной проблемой старения, что приводит к быстрому росту распространенности когнитивных расстройств. Распространенность когнитивных нарушений во всем мире составляет приблизительно 53,97 на 1000 человеко-лет¹. Хроническая церебральная гипоксия, вызванная сосудистой дисфункцией или нарушениями кровообращения/дыхания, остается одним из основных факторов риска возрастной деменции². Предыдущие исследования показали, что церебральная гипоксия может увеличивать отложение амилоидных β путем модификации экспрессии BACE1³. Кроме того, гипоксия ассоциировалась с дисрегуляцией глиальных клеток и нейровоспалением ^4,5. Несмотря на растущие масштабы этой проблемы, эффективных западных лекарств для предотвращения хронического снижения когнитивных функций, вызванных гипоксией, в настоящее время не существует. Нефармакологическая традиционная китайская медицина, в частности иглоукалывание, использовалась на протяжении тысячелетий для лечения когнитивных расстройств и показала многообещающие результаты в облегчении нейродегенеративных^{заболеваний.} Акупунктурные точки Байхуэй, Шэньтин и Цзусанли являются эффективными точками для лечения когнитивной дисфункции ^8,9. Клинические исследования показали, что электроакупунктурная терапия значительно улучшает показатели Монреальского когнитивного теста (MoCA) и мини-обследования психического состояния (MMSE) у пациентов с сосудистыми когнитивными нарушениями и эффективно улучшает когнитивную дисфункцию⁸. Несмотря на то, что исследования показали, что иглоукалывание может значительно улучшить способность к запоминанию у крыс с артериальной перевязкой (острая церебральная гипоксия^{, модель} острой церебральной гипоксии), нет никаких сообщений о влиянии иглоукалывания ни на одной модели грызунов с хроническими когнитивными расстройствами, вызванными гипоксией. Отсутствие исследований этого механизма значительно затруднило его клиническое применение.

Предыдущие исследования показали, что воздействие на крыс гипоксической среды в течение 8 недель может значительно повысить уровень окислительного стресса и воспаления в головном мозге, что приводит к^{снижению функции памяти}. Настоящее исследование направлено на изучение влияния иглоукалывания на модели грызунов с целью углубления нашего понимания. Однако стоит отметить, что анестезия, как правило, требуется во время лечения иглоукалыванием у грызунов из-за возможности возбуждения при повторной стимуляции. Длительная анестезия может значительно повлиять на когнитивные функции у мышей, поскольку большинство анестетиков могут подавлять нейронную активность и препятствовать обработке информации, что приводит к^{поведенческим} нарушениям. Несколько исследований показали, что введение 2,5% севофлурана в течение 6 часов может заметно ухудшить пространственную память, способность к обучению и внимание у мышей¹³. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что высокие дозы анестезии могут привести к гибели нейронов или повреждению нервов у мышей¹⁴. Поэтому крайне важно определить подходящий подход, чтобы свести к минимуму общий объем используемой анестезии. В этом исследовании мы представляем эффективный метод иглоукалывания для лечения мышей с когнитивными нарушениями, а также поведенческие тесты для оценки их способностей к памяти. Важно отметить, что мы представляем модифицированную технику анестезии перед лечением, которая позволяет эффективно снизить общую дозу анестезии, вводимой во время эксперимента.

протокол

Эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по исследованиям и этике на животных Хэбэйского медицинского научно-исследовательского института Илина (номер разрешения: N2022148). Самцы мышей C57BL/6J массой 18-22 г (см. таблицу материалов) были размещены в новом центре оценки лекарственных средств Хэбэйского медицинского научно-исследовательского института Илин. Их обеспечивали нормальной пищей и чистой водой и подвергали воздействию искусственного света в течение 12 часов ежедневно. В помещениях поддерживался контролируемый температурный режим 20-26 °C и относительная влажность 40%-70%.

1. Создание мышиной модели хронической гипоксии (рис. 1)

1. Перед началом эксперимента подготовьте клетки для животных при нормальном атмосферном давлении и клетки с непрерывной средой с низким содержанием кислорода. Создайте непрерывную среду с низким содержанием кислорода, используя автоматизированную систему подачи газа для промывки камеры смесью чистого кислорода и азота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система запрограммирована на управление электромагнитным переключателем клапана, тем самым обеспечивая точную подачу газа как по времени, так и по концентрации.
2. Случайным образом разделите мышей на три группы: контрольную группу (Con), модельную группу (CH) и группу электроакупунктуры (EA + CH). Поместите контрольных и модельных/электроакупунктурных мышей отдельно в две клетки, по 10 мышей в каждой клетке. Поддерживайте световой цикл на уровне 12 ч/12 ч (светлый/темный).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В контрольной группе лечение или гипоксия не индуцированы. Модельную группу (СГ) составляют мыши с хронической гипоксией. В группу электроакупунктуры (ЭА + СН) входят мыши, индуцированные гипоксией, получавшие электроакупунктуру.
3. При развитии хронической гипоксии установите параметры камеры с низким содержанием кислорода с помощью цифрового кислородомера для регулирования расхода газа и поддержания концентрации кислорода на уровне 10%. Помещайте животных в камеру с низким содержанием кислорода в 9:00 утра и удаляйте их в 17:00, что приводит к непрерывному воздействию кислорода в общей сложности 8 часов непрерывного воздействия низкого содержания кислорода в день в течение 3 месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке подачи газообразного азота для снижения концентрации кислорода рекомендуется действовать медленно, чтобы предотвратить чрезмерное введение газообразного азота сразу, так как это приведет к гибели животных.
4. Оцените модель когнитивной дисфункции, вызванной хронической гипоксией, с помощью гистологического исследования и поведенческих тестов: теста^{открытого поля 15} и теста^{водного лабиринта 16}.

2. Анестезия (рисунок 2)

1. Подготовьте наркозный аппарат для мелких животных (см. Таблицу материалов) и грелку с постоянной температурой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анестезии животные восприимчивы к гипотермии, что подчеркивает необходимость использования грелки постоянной температуры для изоляции.
2. Поместите мышь в индукционный бокс для анестезии и быстро индуцируйте 2%-2,5% изофлурана в кислороде (см. Таблицу материалов) примерно на 1 минуту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта краткосрочная предварительная обработка является важным шагом для обеспечения того, чтобы мыши могли процветать при низкой дозировке в течение длительного периода времени.
3. Как только возбудимость мыши снизится, зажмите мышь за палец, чтобы проверить ее рефлекс. Затем перенесите мышь на грелку с постоянной температурой (37 °C).
4. Отрегулируйте скорость потока анестезии примерно до 0,5% концентрации. Подключите наркозный аппарат ко рту и носу мыши. Приступайте к лечению электроакупунктурой, обеспечивая при этом поддержание анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффект анестезии был подтвержден, когда мыши перестали моргать. Эффект от анестезии может длиться не менее 30 минут.

3. Лечение электроакупунктурой

1. Чтобы эффективно улучшить когнитивную дисфункцию, выберите определенные акупунктурные точки, такие как Байхуэй (GV20), Шэньтин (GV24) и двусторонний Цзусанли (ST36), основываясь на теории традиционной китайской медицины и клиническом опыте (Рисунок 3). Проводите лечение электроакупунктурой за 2 недели до завершения процесса моделирования.
   1. Расположите акупунктурную точку GV20 на средней линии лба, в средней точке линии, соединяющей кончики ушей⁷. Глубина введения акупунктурной иглы должна быть 2 мм.
   2. Расположите акупунктурную точку GV24 на расстоянии 1,3 мм непосредственно над средней точкой глаз мыши на средней линии лба¹⁷. Глубина введения акупунктурной иглы должна быть 2 мм.
   3. Найдите акупунктурную точку ST36 на внешней стороне коленного сустава, примерно на 2 мм ниже головки малоберцовой кости^18,19. Глубина введения акупунктурной иглы должна составлять 3-4 мм.
2. Подготовьте одноразовые акупунктурные иглы (см. Таблицу материалов) и устройство для электроакупунктуры (см. Таблицу материалов) для процедуры (Рисунок 4).
3. Поместите мышь в положение лежа на животе под легкой анестезией с 0,5% изофлураном, убедившись, что ее головы и конечности обездвижены. Держите иглу из нержавеющей стали (диаметр: 0,18 мм; длина: 7 мм) правой рукой, используя большой, указательный и средний пальцы.
4. Выполняйте иглоукалывание в акупунктурных точках GV20 и GV24 поперечно на глубину 2 мм, приподнимая кожу на голове мыши левой рукой. Проколите акупунктурную точку ST36 вертикально на глубину 3-4 мм, прикоснувшись к головке малоберцовой кости на боковой стороне коленного сустава мыши и надавливая на кожу большим пальцем левой руки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для акупунктурных точек, расположенных на голове, рекомендуется вводить иглы в последовательности GV24, а затем GV20. Такой порядок способствует удобству эксплуатации. Акупунктурные точки представляют собой дискретные анатомические точки, а не стационарные точки. Следовательно, незначительные отклонения в угле введения иглы не влияют на терапевтическую эффективность, как это наблюдается у пациентов, получающих лечение электроакупунктурой в клинических условиях.
5. Подключите электронное устройство для акупунктуры к иглам, подключив GV20 и левый ST36 к одному набору электродов, а GV24 и правый ST36 — к другому (рис. 4). Выберите режим непрерывной волны, с силой электрического тока 2 мА и частотой 2 Гц^20,21. Подтвердите идеальное лечение, наблюдая за локальным легким тремором в акупунктурных точках и спокойной переносимостью мышью.
   1. При подключении электрического акупунктурного инструмента подсоедините проксимальный конец иглы. Это помогает свести к минимуму удары, вызванные весом соединительной линии, и, следовательно, улучшает предотвращение отсоединения иглы. При необходимости используйте клейкую ленту, чтобы закрепить горизонтально вставленную иглу и соединительную линию.
6. Проводите ежедневную процедуру по 30 минут каждый день в течение 6 дней подряд, с одним днем отдыха между циклами лечения.

4. Испытание в открытом поле (Рисунок 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Тест в открытом поле является традиционным методом, используемым для оценки автономного поведения, исследовательского поведения, когнитивных способностей и тревожного поведения экспериментальных животных в новых и незнакомых условиях²². Он состоит из реакционного бокса открытого поля и регистрирующего устройства.

1. Для проведения теста подготовьте белостенный куб размером 50 см × 50 см × 30 см, с разделением дна на 25 равных квадратов размером 10 см × 10 см.
2. Поместите мышь в реакционную коробку открытого поля для акклиматизации. Позвольте мышке исследовать испытательную комнату и ознакомиться с новой обстановкой в период акклиматизации. Тест в открытом поле проводят после акклиматизации мыши к экспериментальной среде в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует минимизацию беспокойства или стресса, вызванных изменениями в окружающей среде, что позволяет получить более точные результаты при последующих поведенческих оценках.
3. Поместите мышь в центр коробки и наблюдайте за ней в течение 10 минут, после чего дайте мыши адаптироваться к окружающей среде в течение 2 минут.
   1. Используйте систему видеослежения (см. Таблицу материалов) для записи траектории движения мыши, общего пройденного расстояния, времени, проведенного в центральной зоне, скорости пересечения центральной области и количества входов в центральную область во время теста.
   2. Выполните соответствующие операции, как указано в руководстве по эксплуатации системы видеонаблюдения. Каждая мышь проходит один тест и начинает исследование с одного и того же места в коробке.
   3. После каждого теста очищайте коробку с открытым полем 75% этанолом, чтобы предотвратить ложные результаты, вызванные помехами запаха при использовании мыши.

5. Водный лабиринт (Рисунок 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на водный лабиринт часто используется в качестве инструмента оценки поведения в экспериментах с участием мышей для оценки их возможностей к пространственному обучению и памяти²³.

1. Подготовьте круглую емкость для воды диаметром 120 см и глубиной 30 см. Разделите аквариум на четыре равных квадранта: I, II, III и IV. Если в эксперименте используются черные мыши, используйте резервуар с белой водой; Для белых мышей используйте черный резервуар для воды.
2. Разместите шторы вокруг круглого резервуара для воды, чтобы мышь не видела исследователей во время теста.
3. Расположите различные маркеры на верхней поверхности резервуара для воды в качестве визуальных подсказок для пространственной ориентации. Убедитесь, что эти маркеры остаются неподвижными на протяжении всего эксперимента, чтобы поддерживать согласованность.
4. Установите круглую платформу диаметром 10 см в квадранте III резервуара для воды в качестве обозначенной целевой зоны. Убедитесь, что платформа может быть легко перемещена и закреплена в любом желаемом месте.
5. На протяжении всего эксперимента вводите воду в резервуар, поддерживая температурный режим 22-24 °C.
   1. Следите за тем, чтобы уровень воды оставался на 1 см выше целевой платформы. Добавьте в воду 20%-ную концентрацию нетоксичного диоксида титана, чтобы добиться четкого контраста между черными мышами и белым фоном. Этот контраст облегчает запись камерой движений мыши и соответствующих параметров.
6. Проведите 5-дневный тест непрерывного пространственного исследования, последовательно поместив каждую мышь в квадранты I, II, III и IV.
   1. Расположите мышь лицом к стене. Отойдите от лабиринта, чтобы мышь не использовала положение экспериментатора в качестве ориентира. Запишите время, которое требуется мыши, чтобы найти платформу.
   2. Если мышь не может найти подводную платформу в течение 90 секунд, направьте мышь к платформе и обеспечьте 30-секундный период обучения. Кроме того, запишите период задержки равным 90 с.
   3. Если мышь найдет подводную платформу в течение 90 с, дайте ей оставаться на платформе в течение 10 секунд для обучения, прежде чем вынимать ее из резервуара для воды.
   4. Высушите мышь полотенцем и верните ее в клетку.
   5. Меняйте положение каждой мыши в каждом квадранте каждые 20 минут. Запишите расстояние, скорость и время, затраченное каждой мышью на поиск платформы (период задержки), с помощью системы видеослежения (см. Таблицу материалов), выполняя соответствующие операции в соответствии с инструкциями в руководстве по продукту.
   6. Установите платформу на 1 см выше поверхности воды в 1-й день. Размещайте платформу на глубине 1 см ниже поверхности воды на 2-5 день.
7. На 6-й день удалите платформу из целевого квадранта и проведите тест на пространственное исследование.
   1. Поместите мышь в квадрант I, чтобы свободно исследовать ее в течение 90 секунд. Компьютер записывает траекторию плавания мыши, время, проведенное в целевом квадранте, и количество раз, когда она пересекает платформу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму ошибки эксперимента, вызванные человеческим фактором, важно сохранить положение опорной точки фиксированным в эксперименте с водным лабиринтом. Кроме того, экспериментатор должен немедленно отступить после помещения мыши в воду. После завершения эксперимента мышей следует высушить полотенцем и поместить обратно в клетки для сохранения тепла.

6. Окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ) (рис. 6)

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое исследование области гиппокампа помогает оценить установление модели гипоксии и определить эффективность лечения иглоукалыванием.

1. После поведенческого эксперимента обезболивайте мышь внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия в дозе 20 мг/кг и перфузии 10% раствором параформальдегида (см. таблицу материалов) для обеспечения полной перфузии организма. Изолируют ткань мозга и погружают ее в 10% раствор параформальдегида при комнатной температуре (RT) на 3 дня для достижения фиксации.
2. Поместите образцы мозга в коробку для встраивания. В последующем обработанные образцы мозга промывают проточной водой в течение 6 ч.
3. Используйте автоматизированный тканевый процессор для обезвоживания образцов с помощью серии спиртовых растворов с возрастающими концентрациями, а именно: 60% этанола в течение 1 ч, 70% этанола в течение 1 ч, 90% этанола в течение 1 ч, 95% этанола в течение 2 ч и, наконец, 100% этанола в течение 2 ч.
4. Образцы тканей погружают в ксилол на 2 ч до достижения прозрачности. Впоследствии, после завершения процесса обезвоживания, переносят пермеабилизированные образцы в парафин, нагретый до 60 °С, в течение 3 ч. Наконец, встройте их в автоматический процессор.
5. Используйте ротационный слайсер для получения секций размером 4 мкм. Затем срезы подвергают окрашиванию гематоксилином в течение 3-8 мин с последующим окрашиванием эозином в течение 1-3 мин.
6. Последовательно переложите окрашенные участки в отдельные емкости с чистым спиртом и ксилолом. Затем запечатайте и закрепите окрашенные участки нейтральной десной при подготовке к патологоанатомическому исследованию под оптическим микроскопом.
7. Используйте сканер слайдов (см. Таблицу материалов) для сканирования срезов. Затем используйте программное обеспечение для просмотра для получения результатов окрашивания HE для области гиппокампа. Сравните расположение нейронов и конденсацию ядер нейронов.

Результаты

Характеристика траекторий передвижения мышей в эксперименте в открытом поле
Карта траектории показывает, что мыши в нормальной группе демонстрируют глубокую склонность к исследованиям в незнакомой среде. Траектории их активности в основном сосредоточены в углах, охватыва...

Обсуждение

Иглоукалывание, нефармакологическая медицинская практика, возникшая в Китае более 2000 лет назад, включает в себя введение тонких игл в определенные точки на теле, известные как акупунктурные точки. Считается, что эти точки соединены каналами или меридианами, по^{которым течет}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106