Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Resumen

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Resumen

Los transportadores de solutos (SLC) son transportadores de membrana que importan y exportan una variedad de sustratos endógenos y exógenos, incluidos iones, nutrientes, metabolitos, neurotransmisores y productos farmacéuticos. A pesar de haber surgido como dianas terapéuticas atractivas y marcadores de enfermedades, este grupo de proteínas sigue estando relativamente infradrogado por los productos farmacéuticos actuales. Los proyectos de descubrimiento de fármacos para estos transportadores se ven obstaculizados por el limitado conocimiento estructural, funcional y fisiológico, debido en última instancia a las dificultades en la expresión y purificación de esta clase de proteínas incrustadas en la membrana. Aquí, demostramos métodos para obtener cantidades de miligramos de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas utilizando secuencias de genes optimizadas para codones. Junto con una exploración sistemática del diseño de constructos y la expresión de alto rendimiento, estos protocolos garantizan la preservación de la integridad estructural y la actividad bioquímica de las proteínas diana. También destacamos los pasos críticos en la expresión de las células eucariotas, la purificación de la afinidad y la cromatografía de exclusión por tamaño de estas proteínas. En última instancia, este flujo de trabajo produce preparaciones de proteínas puras, funcionalmente activas y estables adecuadas para la determinación de estructuras de alta resolución, estudios de transporte, ensayos de compromiso de moléculas pequeñas y cribado in vitro de alto rendimiento.

Introducción

Las proteínas de membrana han sido durante mucho tiempo objetivos tanto para los investigadores como para las industrias farmacéuticas. De estos, los portadores de solutos (SLC) son una familia de más de 400 genes transportadores secundarios codificados dentro del genoma^humano. Estos transportadores están involucrados en la importación y exportación de numerosas moléculas, incluidos iones², neurotransmisores³, lípidos 4,5,6,7, aminoácidos⁸, nutrientes 9,10,11 y product....

Protocolo

NOTA: Todos los genes RESOLUTE SLC optimizados para codones se han depositado en AddGene⁴³, cuyos enlaces están disponibles en la lista de reactivos públicos RESOLUTE⁴⁴. Estos genes se han clonado en el plásmido pDONR221 y permiten la clonación directa de los genes en el vector de destino mediante clonación por recombinación⁴⁵. Para maximizar el paralelismo, las células bacterianas, de insectos y de mamíferos se cultivan en formato de bloque para la producción de bacimida (sección 3), la amplificación de baculovirus (sección 5) y las pruebas de expresión (sección 6), respectivamente. Para estos pa....

Discusión

El desarrollo de terapias dirigidas al SLC se ha visto obstaculizado debido a la ausencia de una caracterización sistemática de la función transportadora. Esto ha llevado a un número desproporcionadamente menor de fármacos dirigidos a esta clase de proteínas en relación con los GPCR y los canales iónicos⁶³, a pesar de sus numerosas funciones en los procesos normales y fisiopatológicos. RESOLUTE es un consorcio internacional destinado a desarrollar técnicas y herramientas de investigació.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent