Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Özet

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Özet

Çözünen taşıyıcılar (SLC'ler), iyonlar, besinler, metabolitler, nörotransmiterler ve farmasötikler dahil olmak üzere bir dizi endojen ve eksojen substratı ithal ve ihraç eden membran taşıyıcılardır. Çekici terapötik hedefler ve hastalık belirteçleri olarak ortaya çıkmasına rağmen, bu protein grubu hala mevcut farmasötikler tarafından nispeten yetersiz ilaçlanmaktadır. Bu taşıyıcılar için ilaç keşif projeleri, nihayetinde bu zara gömülü protein sınıfının ekspresyonu ve saflaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlı yapısal, işlevsel ve fizyolojik bilgi tarafından engellenmektedir. Burada, kodon için optimize edilmiş gen dizilerini kullanarak yüksek saflıkta, miligram miktarlarda insan SLC taşıyıcı proteinleri elde etme yöntemlerini gösteriyoruz. Yapı tasarımının ve yüksek verimli ekspresyonun sistematik bir şekilde araştırılması ile bağlantılı olarak, bu protokoller hedef proteinlerin yapısal bütünlüğünün ve biyokimyasal aktivitesinin korunmasını sağlar. Ayrıca, bu proteinlerin ökaryotik hücre ekspresyonu, afinite saflaştırması ve boyut dışlama kromatografisindeki kritik adımları da vurguluyoruz. Sonuç olarak, bu iş akışı, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme, taşıma çalışmaları, küçük moleküllü etkileşim testleri ve yüksek verimli in vitro tarama için uygun saf, işlevsel olarak aktif ve stabil protein preparatları sağlar.

Giriş

Membran proteinleri uzun zamandır hem araştırmacılar hem de ilaç endüstrileri için hedef olmuştur. Bunlardan çözünen taşıyıcılar (SLC'ler), insan genomu¹ içinde kodlanmış 400'den fazla ikincil taşıyıcı genden oluşan bir ailedir. Bu taşıyıcılar, iyonlar², nörotransmiterler³, lipitler 4,5,6,7, amino asitler ⁸, besinler^9,10,11 ve farmasötikler ¹² dahil olma....

Protokol

NOT: Tüm kodon için optimize edilmiş RESOLUTE SLC genleri, bağlantıları RESOLUTE genel reaktifleri⁴⁴ listesinde bulunan AddGene^43'e yatırılmıştır. Bu genler pDONR221 plazmidine klonlanmıştır ve rekombinasyon klonlaması⁴⁵ kullanılarak genlerin hedef vektöre doğrudan klonlanmasına izin verir. Paralelliği en üst düzeye çıkarmak için, bakteriyel, böcek ve memeli hücreleri, sırasıyla bakmid üretimi (bölüm 3), bakulovirüs amplifikasyonu (bölüm 5) ve ekspresyon testi (bölüm 6) için blok formatında büyütülür. Bu adımlar için, yeterli karıştırma ve havalandırmayı sağlamak için bir mikro ekspresyon çalkalay....

Tartışmalar

SLC hedefli tedavilerin geliştirilmesi, taşıyıcı fonksiyonun sistematik karakterizasyonunun olmaması nedeniyle engellenmiştir. Bu, normal ve patofizyolojik süreçlerdeki sayısız rollerine rağmen, GPCR'lere ve iyon kanallarına⁶³ göre bu protein sınıfını hedef alan orantısız olarak daha az ilaca yol açmıştır. RESOLUTE, mevcut SLC araştırmalarını hızlandırmak ve geliştirmek için en son araştırma tekniklerini ve araçlarını geliştirmeyi amaçlayan uluslararası bir .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent