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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Zusammenfassung

Solute Carrier (SLCs) sind Membrantransporter, die eine Reihe von endogenen und exogenen Substraten importieren und exportieren, darunter Ionen, Nährstoffe, Metaboliten, Neurotransmitter und Pharmazeutika. Obwohl sich diese Gruppe von Proteinen als attraktive therapeutische Ziele und Marker für Krankheiten erwiesen hat, wird sie von den derzeitigen Pharmazeutika immer noch relativ wenig unter Drogen gesetzt. Wirkstoffforschungsprojekte für diese Transporter werden durch begrenztes strukturelles, funktionelles und physiologisches Wissen behindert, was letztendlich auf die Schwierigkeiten bei der Expression und Reinigung dieser Klasse von membraneingebetteten Proteinen zurückzuführen ist. Hier demonstrieren wir Methoden, um hochreine Milligramm-Mengen von humanen SLC-Transporterproteinen unter Verwendung von Codon-optimierten Gensequenzen zu erhalten. In Verbindung mit einer systematischen Untersuchung des Konstruktdesigns und der Hochdurchsatzexpression stellen diese Protokolle die Erhaltung der strukturellen Integrität und biochemischen Aktivität der Zielproteine sicher. Wir beleuchten auch kritische Schritte in der eukaryotischen Zellexpression, der Affinitätsreinigung und der Größenausschlusschromatographie dieser Proteine. Letztendlich führt dieser Arbeitsablauf zu reinen, funktionell aktiven und stabilen Proteinpräparaten, die sich für hochauflösende Strukturbestimmungen, Transportstudien, niedermolekulare Engagement-Assays und In-vitro-Screenings mit hohem Durchsatz eignen.

Einleitung

Membranproteine sind seit langem Ziele für Forscher und Pharmaindustrie gleichermaßen. Bei den Solute Carriers (SLCs) handelt es sich um eine Familie von über 400 sekundären Transportergenen, die im menschlichen Genom kodiert sind1. Diese Transporter sind am Import und Export zahlreicher Moleküle beteiligt, darunter Ionen2, Neurotransmitter3, Lipide 4,5,6,7, Aminosäuren8, Nährstoffe9,10,11 und Pharmazeutika 12. Mit einer solchen Breite von Substraten sind diese Proteine auch an einer Reihe von Pathophysiologien durch den Transport von Toxinen13, den Transport und die Hemmung durch Missbrauchsdrogen 14,15 oder schädliche Mutationen16 beteiligt. Bakterielle Homologe dienten als Prototypen für den grundlegenden Transportmechanismus mehrerer SLC-Familien 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Im Gegensatz zu humanen Proteinen werden prokaryotische Orthologe oft besser im gut verstandenen Escherichia coli-Expressionssystemexprimiert 26,27 und sind stabiler in den kleineren Detergenzien, die wohlgeordnete Kristalle für die Röntgenkristallographie liefern 28. Sequenzelle und funktionelle Unterschiede erschweren jedoch die Verwendung dieser entfernt verwandten Proteine für die Wirkstoffforschung29,30. Folglich ist oft eine direkte Untersuchung des menschlichen Proteins erforderlich, um den Wirkmechanismus von Medikamenten zu entschlüsseln, die auf SLCs abzielen 31,32,33,34,35. Während die jüngsten Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) die strukturelle Charakterisierung von SLCs unter nativeren Bedingungen ermöglicht haben36,37, bleibt die Schwierigkeit bei der Expression und Reinigung dieser Proteine eine Herausforderung für die Entwicklung zielgerichteter Therapeutika und Diagnostika.

Um diese Herausforderung zu bewältigen, hat das RESOLUTE-Konsortium (re-solute.eu) Ressourcen und Protokolle für die großflächige Expression und Reinigung von humanen Proteinen der SLC-Familie entwickelt38. Ausgehend von Codon-optimierten Genen haben wir Methoden für das Hochdurchsatz-Klonen und Screening von SLC-Konstrukten entwickelt. Diese Methoden wurden systematisch auf die gesamte Familie der SLCs angewendet, die Gene wurden in das virale Expressionssystem BacMam kloniert und die Proteinexpression wurde in humanen Zelllinien39 getestet, basierend auf zuvor beschriebenen Methoden für Hochdurchsatz-Klonierung und Expressionstests40. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das SLC-Gen aus dem pDONR221-Plasmid in einen pHTBV1.1-Vektor kloniert wird. Dieses Konstrukt wird anschließend verwendet, um das interessierende Gen in einen Bacmid-Vektor für die Transfektion von Insektenzellen zu transponieren, der einen Cytomegalievirus-Promotor und Enhancer-Elemente für die Expression in Säugetierzellen enthält. Das resultierende Baculovirus kann verwendet werden, um Säugetierzellen für die Expression des Ziel-SLC-Proteins zu transduzieren.

Wir haben standardisierte Methoden für die großtechnische Expression und stabile Aufreinigung ausgewählter SLCs weiterentwickelt (Abbildung 1). Dieses Protokoll enthält mehrere Prüfpunkte, um eine effektive Fehlerbehebung zu erleichtern und die Variabilität zwischen den Experimenten zu minimieren. Insbesondere die routinemäßige Überwachung der Proteinexpression und -lokalisierung sowie die Optimierung der Reinigungsbedingungen für einzelne Ziele in kleinem Maßstab wurden durch Streptokokken- und grün fluoreszierende Proteine (GFP)-Tags unterstützt41,42.

Letztendlich können diese chemisch reinen und strukturell homogenen Proteinproben für die Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), biochemische Target-Engagement-Assays, Immunisierung zur Bindergenerierung und zellfreie funktionelle Studien durch Rekonstitution in chemisch definierte Liposomen verwendet werden.

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Protokoll

ANMERKUNG: Alle Codon-optimierten RESOLUTE SLC-Gene wurden in AddGene43 deponiert, dessen Links auf der Liste der öffentlichen RESOLUTE-Reagenzien44 verfügbar sind. Diese Gene wurden in das pDONR221-Plasmid kloniert und ermöglichen die direkte Klonierung der Gene in den Zielvektor mittels Rekombinationsklonierung45. Um die Parallelität zu maximieren, werden Bakterien-, Insekten- und Säugetierzellen im Blockformat für die Bacmid-Produktion (Abschnitt 3), die Baculovirus-Amplifikation (Abschnitt 5) und die Expressionstests (Abschnitt 6) gezüchtet. Für diese Schritte ist ein Mikroexpressionsschüttler erforderlich, um eine ausreichende Durchmischung und Belüftung zu gewährleisten.

1. (Hochdurchsatz-)Klonierung von SLCs in pHTBV1.1 bacmid

ANMERKUNG: Der Klonierungsschritt verwendet ein Rekombinationsklonprotokoll für effizientes Klonen und die Umwandlung in Escherichia coli (E. coli) unter Verwendung der Hitzeschockmethode46. Das Protokoll ist für das parallele Klonen mehrerer Ziele oder Konstrukte mit hohem Durchsatz ausgelegt, kann aber problemlos an kleinere Maßstäbe angepasst werden.

  1. In einer 96-Well-Platte werden 150 ng des pDONR221 SLC-Klons und 100 ng des pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW-Vektors zugegeben. Das Reaktionsvolumen wird mit 10 mM Tris pH 8,0 auf 8 μl gebracht und dann 2 μl der Rekombinationsenzymmischung zugegeben.
  2. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, 1 μl Proteinase K zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Verwenden Sie 4 μl der Reaktionsmischung, um 50 μl chemisch kompetente E. coli MACH-1-Zellen unter Verwendung der Hitzeschockmethode46 und SOC-Medium zur Rückgewinnung umzuwandeln. Platte auf LB-Agar mit 5% Saccharose oder SOC-Agar, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
  4. Identifizierung von Kolonien, die den pHTBV1.1-Vektor mit dem SLC-Geninsert beherbergen, unter Verwendung geeigneter Primer (siehe Tabelle 1) und Standardprotokollen für die Kolonie-PCR 47.
  5. Reinigen Sie das rekombinante Plasmid aus einzelnen Kolonien mit dem interessierenden Gen unter Verwendung eines Plasmid-Miniprep-Kits.

2. Umsetzung

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden verwendet, um die SLC-Gene aus dem pHTBV1.1-Vektor in ein Bacmid für die BacMam-Baculovirus-Generierung in Sf9-Zellen zu transponieren. Unter Verwendung des Hitzeschockverfahrens46 wird der pHTBV1.1-Vektor in DH10Bac-kompetente E. coli-Zellen transformiert, die ein Eltern-Bacmid mit einer lacZ-mini-attTn7-Fusion enthalten. Die Transposition erfolgt zwischen den Elementen des pHTBV1.1-Vektors und dem Mutter-Bacmid in Gegenwart der Transpositionsproteine, die von einem Helferplasmid48 bereitgestellt werden. Siehe Tabelle 2 für die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen.

  1. Unter Verwendung von 3 μl 100-200 ng/μl gereinigter pHTBV1.1-Vektor-DNA wird DH10Bac mit der Hitzeschockmethode in einer 96-Well-PCR-Platte transformiert. Die Zellen werden zurückgewonnen, indem sie 4-5 Stunden lang bei 37 °C in einem Rückgewinnungsmedium inkubiert werden, während sie bei 700 U/min in einem Mikroexpressionsschüttler geschüttelt werden.
  2. Verteilen Sie 50 μl transformierte Zellen auf DH10Bac-Auswahlplatten. Die Platten bei 37 °C 48 h mit Folie abgedeckt inkubieren.
  3. Wählen Sie eine einzelne weiße Kolonie (die die rekombinante DNA enthält) und streifen Sie sie bis zur Verdünnung. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.

3. Hochdurchsatz-Bacmid-Produktion

HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Extraktion von Bacmiden mit einem 96-Well-Bacmid-Reinigungskit.

  1. Einzelne weiße Kolonien (isoliert von den gestreiften bis verdünnten Platten) werden in Vertiefungen eines 96-Deep-Well-Blocks geimpft, der 1 ml 2x LB-Medium enthält (Tabelle 2).
  2. Mit einer porösen Dichtung abdecken und bei 37 °C über Nacht bei 700 U/min in einem Mikroexpressionsschüttler inkubieren.
  3. Bereiten Sie einen Glycerinvorrat der Zellen vor, indem Sie 120 μl der Kultur mit 30 μl 60%igem Glycerin in einer Mikrotiterplatte mischen und bei -80 °C lagern.
  4. Zentrifugieren Sie den Deep-Well-Block bei 2.600 × g für 30 min. Dekantieren Sie den Überstand in einen geeigneten Behälter zur Dekontamination. Drehen Sie den Block um und klopfen Sie vorsichtig auf ein Papiertuch. Geben Sie 250 μl Lösung 1 mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung des Blocks.
  5. Resuspendieren Sie die Pellets; Verwenden Sie bei Bedarf eine Mehrkanalpipette.
  6. Geben Sie 250 μl Lösung 2 in jede Vertiefung und verschließen Sie sie mit einer Silikonmatte. 5x vorsichtig umdrehen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Ganz kurz drehen.
  7. Geben Sie 300 μl Lösung 3 hinzu und versiegeln Sie sie mit einer Silikonmatte. Vorsichtig aber gründlich mischen, indem man 5x umdreht.
  8. Die Probe wird 20 min lang auf Eis gelegt und dann bei 2.600 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
  9. Übertragen Sie den klaren Überstand in einen frischen 96-Well-Block. Bei 2.600 × g erneut 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  10. Geben Sie in einem frischen 96-Deep-Well-Block 0,8 ml 100%iges Isopropanol pro Well. Fügen Sie 0,8 ml Überstände aus den entsprechenden Vertiefungen hinzu.
  11. Mit einer Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren und dann 30 Minuten oder über Nacht bei 4 °C auf Eis inkubieren, um mehr Bacmid zu erhalten.
  12. Bei 2.600 × g 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  13. Besprühen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank die Außenseite des Blocks mit 70%igem Ethanol, öffnen Sie den Block und entsorgen Sie den Überstand.
  14. Geben Sie 500 μl 70%iges Ethanol (v/v) in jede Vertiefung und klopfen Sie vorsichtig auf den Block, um das Pellet zu waschen. Mit einer selbstklebenden Kunststoffdichtung abdecken und bei 2.600 × g 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  15. Öffnen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank den Block und entsorgen Sie den Überstand. Klopfen Sie den Block sehr vorsichtig auf ein Papiertuch, um das Ethanol zu entfernen. Lassen Sie den Block entweder in der Dunstabzugshaube oder bei 50 °C trocknen.
  16. Fügen Sie 50 μl sterilen TE-Puffer hinzu, um die Bacmid-DNA zu resuspendieren, und versiegeln Sie sie mit einer selbstklebenden Kunststoffdichtung. Übertragen Sie den Inhalt auf eine Mikrotiterplatte mit V-Boden. Lagern Sie die Bacmid-DNA bei 4 °C, bis die Testreinigung abgeschlossen ist, und lagern Sie sie dann bei -20 °C.
    HINWEIS: Obwohl nicht routinemäßig gemessen, kann im Allgemeinen eine Ausbeute von 500 bis 2.000 ng/μl Bacmid-DNA erwartet werden.
  17. Verwenden Sie die Standard-Kolonie-PCR-Methoden47 und die folgenden Vektorprimer, um nach Bacmiden zu suchen, die das Zielgen erfolgreich integrieren:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    HINWEIS: Das Amplikon wird etwa 700 bp größer sein als das Zielgen.

4. Transfektion

HINWEIS: Diese Schritte werden verwendet, um Sf9-Insektenzellen mit dem produzierten Bacmid zu transfizieren, was dazu führt, dass die Insektenzellen Baculoviruspartikel (P0) erzeugen.

  1. Züchten Sie Sf9-Zellen in serumfreiem Insektenmedium auf eine Dichte von 2,0-2,4 × 106 Zellen/ml. Verdünnen Sie die Zellen auf 2 × 105 Zellen/ml in serumfreiem Insektenmedium und geben Sie 1 ml der verdünnten Zellen in eine 24-Well-Gewebekulturplatte. Fügen Sie eine reine Transfektionsreagenz - als auch eine reine Zellkontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 27 °C für 1 h, um die Zellanhaftung zu ermöglichen.
  2. Mischen Sie 38 μl serumfreies Insektenmedium pro Vertiefung mit 2 μl pro Vertiefung des Transfektionsreagenzes. Geben Sie 40 μl der Mischung in eine sterile 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden. Fügen Sie 2 μl rekombinante Bacmid-DNA mit 0,5-2,0 μg/μl hinzu, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang in der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank.
  3. Geben Sie 160 μl serumfreies Insektenmedium in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, die die DNA-Transfektionsreagenzmischung enthält.
  4. Saugen Sie das Medium in Schritt 4.1 aus den Zellen ab. Geben Sie vorsichtig die 200 μl Bacmid-Transfektions-Reagenz-Medium-Mischung auf die Zellen, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie 4 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 27 °C.
  5. Geben Sie 400 μl serumfreies Insektenmedium, ergänzt mit 2 % FBS, in jede Vertiefung. Um die Verdunstung zu reduzieren, geben Sie die Platte in einen sauberen Plastikbeutel, aber versiegeln Sie sie nicht. Die Platte wird bei 27 °C für 72 h in einem befeuchteten Inkubator inkubiert.
  6. Nach 3 Tagen wird das Medium von der Platte in einen sterilen 96-Deep-Well-Block überführt und bei 1.500 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Den geklärten Überstand, der das P0-Baculovirus enthält, in einen sterilen 96-Deep-Well-Block überführen und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

5. BacMam-Baculovirus-Amplifikation

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden verwendet, um das anfängliche P0-Baculovirus auf Virusbestände mit höherem Titer zu amplifizieren. nämlich P1, P2 und P3. Der endgültige P3-Titer ist für die Transduktion und Proteinexpression geeignet. Aus Gründen der Effizienz und Parallelität verwendet dieses Protokoll feste volumetrische Verhältnisse für die virale Amplifikation, die empirisch optimiert wurden. Wenn die anschließend transduzierten Zellen jedoch keine GFP-Fluoreszenz und keinen vergrößerten Zelldurchmesser durch Mikroskopie aufweisen oder wenn die Proteinexpression versagt (siehe Abschnitte 6 und 8), sollte die Baculovirus-Amplifikation bei jedem Schritt nach der Quantifizierung des Baculovirus-Titers 49,50,51,52 und der durch GFP-Fluoreszenzmikroskopie überwachten Infektion und erhöhtem Zelldurchmesser 53 neu optimiert werden.

  1. Bereiten Sie den P1-Virusvorrat vor, indem Sie Sf9-Zellen in serumfreiem Insektenmedium auf eine Dichte von 2 × 106 Zellen/ml züchten, 2 % FBS hinzufügen und die Zellen in einem 24-Deep-Well-Block in einem Endvolumen von 3 ml pro Well aussäen. Geben Sie 120 μl P0-Virusbrühe in die Zellen.
  2. Der Block wird bei 27 °C inkubiert, während er bei 450 U/min in einem Mikroexpressionsschüttler 66-72 h lang geschüttelt wird. Zentrifugieren Sie den Block bei 1.500 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur und ernten Sie den Überstand in 96-Tiefbrunnen-Blöcke. Als P1-Virusbrühe bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
  3. Bereiten Sie den P2-Virusbestand vor, indem Sie 50 ml Sf9-Zellen (2 × 106 Zellen/ml Zelldichte), die in serumfreiem Insektenmedium gezüchtet wurden, das mit 2 % FBS angereichert ist, mit 250 μl P1-Virusmaterial infizieren. Die Zellen werden bei 27 °C unter Schütteln bei 110 U/min inkubiert.
  4. P2-Virusvorrat nach 66-72 h durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 20 min ernten und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
  5. Bereiten Sie den P3-Virusvorrat vor, indem Sie das gewünschte Volumen an Sf9-Zellen (2 × 106 Zellen/ml Zelldichte) mit einem P2-Virusstamm von 1:200 (v/v) infizieren. Die Zellen werden bei 27 °C unter Schütteln bei 110 U/min inkubiert.
  6. Nach 66-72 h bei 1.500 × g für 20 min zentrifugieren und das P3-Virus durch Auffangen des Überstandes ernten und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

6. Transduktion für Expressionstests

HINWEIS: Der folgende Abschnitt beschreibt Expressionstests in kleinem Maßstab und kann für parallele Tests mehrerer Konstrukte mit Deep-Well-Blöcken modifiziert werden.

  1. Bereiten Sie eine 20%ige (w/v) Polyethylenglykollösung vor, indem Sie 200 g PEG 10.000 und 12 g NaCl in 600 ml doppelt destilliertemH2Oauflösen. Autoklavieren Sie die Lösung.
  2. Geben Sie 300 μl geerntetes P1-Virus in die Vertiefungen eines 24-Tiefen-Well-Blocks und 75 μl der PEG-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie den Block in einem Mikroexpressionsschüttler bei 18 °C und schütteln Sie ihn 5 Minuten lang bei 300 U/min und lagern Sie den Block über Nacht bei 4 °C.
  3. Schütteln Sie den Block erneut bei 300 U/min für 30 min bei 18 °C und zentrifugieren Sie den Block bei 3.000 × g für 45 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank.
  4. Bereiten Sie suspensionsangepasste HEK293-Zellen in HEK293-Medium auf eine Dichte von 2 × 106 Zellen/ml vor und säen Sie 3 ml in jede Vertiefung, die das Viruspellet enthält, und ergänzen Sie sie mit 5 mM Natriumbutyrat.
  5. Inkubieren Sie den Block bei 30 °C mit 8 % CO2 und schütteln Sie ihn 72 h lang bei 200-250 U/min.
    HINWEIS: Die vom Hersteller empfohlenen CO2 -Konzentrationen während der Zellkultur sind für suspensionsangepasste und angestammte HEK293-Zelllinien mit 8 % bzw. 5 % unterschiedlich.
  6. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 20 Minuten und waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml PBS.
    HINWEIS: Saugen Sie 10 μl resuspendierte Zellen ab und betrachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-kompatiblen Filterwürfel, um die Proteinexpression und -lokalisierung zu beurteilen. Aspirieren Sie 10-15 μl resuspendierte Zellen und verwenden Sie ein Ganzzell-SDS-PAGE-Gel für die In-Gel-GFP-Fluoreszenzdetektion54.
  7. Nochmals bei 900 × g für 20 min zentrifugieren. Die Pellets bei -80 °C einfrieren.

7. Testreinigung im kleinen Maßstab mit hohem Durchsatz

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben einen Schnelltest-Aufreinigungs-Workflow in einem 24-Well-Blockformat für das Screening der Expressionsniveaus einzelner SLCs. Siehe Tabelle 2 für die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen.

  1. Geben Sie 1 ml HT-Lysepuffer in jede Vertiefung der geernteten Zellen und fahren Sie mit der Beschallung auf Eis für eine Gesamtlänge von 4 Minuten (Zyklus bei 3 s ein/15 s aus) in 24-Well-Blöcken mit einer 24-Kopf-Sonde fort.
  2. Den Inhalt in einen 96-tiefen Well-Block überführen, 125 μl Reinigungsmittelbrühe hinzufügen und mit einer Silikondichtung versiegeln. Drehen Sie den Block vorsichtig bei 4 °C für 1 Stunde. Alternativ können Sie Dodecylmaltosid (DDM) und Cholesterinhemisuccinat (CHS) direkt zu den 24-Well-Blöcken geben und bei 4 °C auf einen Rocker-Shaker stellen.
  3. Zentrifugieren Sie den Block bei 2600 × g für 20 min bei 4 °C und überführen Sie den Überstand in einen neuen 96-Deep-Well-Block.
  4. Bereiten Sie einen 50%igen Vorrat an Streptokokken-Taktinharz mit hoher Kapazität vor, das mit Lysepuffer voräquilibriert ist.
  5. Geben Sie 100 μl resuspendiertes Harz in jede Vertiefung.
  6. Den Block mit einer Silikondichtung abdecken und 2 h bei 4 °C drehen und dann sehr kurz zentrifugieren (bis zu 200 × g), um die am Deckel haftende Flüssigkeit zu entfernen.
  7. Platzieren Sie eine 96-Well-Filterplatte auf einem leeren Block und geben Sie das Harz/Überstands-Gemisch in die Filterplatte. Spülen Sie die Vertiefungen des Deep-Well-Blocks mit 800 μl HT-Waschpuffer und geben Sie sie in den Filterblock, um die maximale Menge an Harz aufzufangen.
  8. Den Puffer durchtropfen lassen oder kurz bei 200 × g zentrifugieren und den Durchfluss auffangen. Legen Sie die Filterplatte auf einen neuen Waschblock und waschen Sie das Harz mit 800 μl HT-Waschpuffer, so dass der Puffer durchtropfen (oder kurz zentrifugieren) kann. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal und zentrifugieren Sie den Block bei 500 × g für 3 Minuten, um den restlichen HT-Waschpuffer zu entfernen.
  9. Platzieren Sie die Filterplatte auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte. 50 μl HT-Elutionspuffer zugeben und 10 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Eluieren Sie die Proben durch Zentrifugieren bei 500 × g für 3 Minuten.
  10. 15 μl der eluierten Probe auf ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel geben, um die Proteinexpression zu überprüfen. Laden Sie die restlichen Eluentenproben auf ein Größenausschlusschromatographie- (SEC) oder Fluoreszenzdetektions-Größenausschlusschromatographie-System (FSEC), um die Proteinmonodispersität in DDM/CHS zu bewerten.

8. Transduktion für die großflächige Expression

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind das Standardprotokoll RESOLUTE für die SLC-Expression. Einzelne Ziele erfordern weitere Optimierungen hinsichtlich der Expressionszeit, der Inkubationstemperatur und der Konzentration von Natriumbutyrat. Darüber hinaus optimieren wir routinemäßig die Baculovirus-Infektionsvielfalt, indem wir verschiedene volumetrische Verhältnisse des P3-Virus testen, mit dem die suspensionsangepassten HEK293-Zellen in kleinen Experimenten infiziert werden. Dies ist zeiteffizient, nutzt bereits vorhandene Techniken und Geräte und wertet den gewünschten experimentellen Output direkt aus. Diese empirische Methode muss jedoch mit jeder Amplifikation des P3-Virus neu optimiert werden, und es stehen andere Methoden zur Verfügung, um die Baculovirus-Partikel zu quantifizieren 49,50,51,52.

  1. Skalieren Sie das erforderliche Volumen von suspensionsangepassten HEK293-Zellen in HEK293-Medium.
  2. An die Suspension angepasste HEK293-Zellen auf 1 × 106 Zellen/ml verdünnen und 24 Stunden lang wachsen lassen (bei 170 U/min für 2-Liter-Rollerflaschen und 105 U/min für 3-L-Rollerflaschen).
  3. Fügen Sie 30 ml P3-Virus pro Liter Zellen hinzu und fügen Sie 5 mM Natriumbutyrat hinzu. Die Zellen werden 48 h lang bei 37 °C oder 72 h bei 30 °C inkubiert.
  4. Während und nach der Inkubationszeit besteht ein wichtiger Schritt darin, die Zellen mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie auf mikrobielle Kontamination und Zelllebensfähigkeit zu untersuchen. Beurteilung der Proteinexpression und -lokalisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem GFP-kompatiblen Filterwürfel.
  5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 20 min.
  6. Waschen Sie das Zellpellet, indem Sie es in 10-15 ml PBS pro Liter Zellkultur resuspendieren und erneut 20 Minuten lang bei 900 × g pelletieren.
  7. Die Zellpellets werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

9. Reinigung von Proteinen

HINWEIS: Im Folgenden finden Sie die Standardmethode RESOLUTE für die SLC-Aufreinigung für 5 l Zellkultur. Für jedes SLC-Target muss das optimale Waschmittel empirisch ermittelt werden. Bereiten Sie Basispuffer, Waschmittellösung, Wasch-, Elutions- und SEC-Puffer im Voraus vor (Tabelle 2). Eine Liste der getesteten Standardwaschmittel finden Sie in Tabelle 3. ATP und MgCl2im Waschpuffer reduzieren die Kontamination durch Hitzeschockproteine.

  1. Tag 1
    1. Tauen Sie das gefrorene Zellpellet in einem auf Raumtemperatur eingestellten Wasserbad auf.
    2. Bereiten Sie den Solubilisierungspuffer mit 135 ml Basenpuffer und drei Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten vor. Lassen Sie die Tabletten sich auflösen.
    3. Resuspendieren Sie das aufgetaute Pellet mit Solubilisierungspuffer. Verwenden Sie 27 ml Solubilisierungspuffer pro 10-15 g Zellpellet, fügen Sie DNase hinzu und gießen Sie sie in einen eiskalten Dounce-Homogenisator. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie den Kolben etwa 20x auf und ab bewegen, wobei der Homogenisator auf Eis bleibt.
      HINWEIS: Das Resuspensionsvolumen muss auf der Grundlage des Zielproteins und der Zellpelletmasse optimiert werden, die aufgrund der Zelldichte bei der Ernte variiert. Handelsübliche DNase kann gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt werden. DNase kann auch intern unter Verwendung etablierter Protokolle55 exprimiert und gereinigt werden.
    4. Waschmittelstammlösung auf 1 %ige Endkonzentration geben.
      HINWEIS: Ein wichtiger Schritt zur Optimierung der Proteinaufreinigung ist die Identifizierung des optimalen Detergens für die SLC-Solubilisierung und -Aufreinigung, das empirisch identifiziert werden muss. Wir haben regelmäßig verschiedene Reinigungsmittel verwendet; jeweils allein und in Kombination mit Cholesterylhemisuccinat, wobei das Verhältnis von Detergens zu CHS-Masse bei 10:1 gehalten wird.
    5. Die Solubilisierungsmischung wird in konische 50-ml-Röhrchen überführt. 1 h bei 4 °C langsam drehen.
    6. Die Lösung wird bei 50.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammle den Überstand ein.
    7. 4-6 ml Bettvolumen Streptokokken-Taktharz mit dem Basispuffer ausgleichen.
    8. Äquilibriertes Harz in den gelösten Überstand geben und 2 h bei 4 °C drehen.
    9. Gießen Sie die Lösung in eine Schwerkraft-Durchflusssäule und lassen Sie die Lösung durchfließen.
    10. Waschen Sie das Harz mit dem 30-fachen Bettvolumen des Streptokokken-Waschpuffers in 3 Schritten mit gleichem Volumen.
    11. Fügen Sie 3-5 ml Elutionspuffer hinzu, inkubieren Sie 15 Minuten lang und sammeln Sie das Eluat. Wiederholen Sie diesen Schritt vier weitere Male und sammeln Sie jede Elutionsfraktion separat.
      HINWEIS: Ein wichtiger Schritt ist die Proteinelution aus dem Streptokokken-Taktinharz, bei der es wichtig ist, nach jeder Zugabe des Elutionspuffers 15 Minuten lang zu inkubieren. Typischerweise enthält die erste Eluatfraktion aufgrund der Verdünnung des Elutionspuffers durch den Restwaschpuffer eine geringere Proteinkonzentration. Daher kann die erste Eluatfraktion verworfen werden, wenn eine höhere Endproteinkonzentration gewünscht wird. Alternativ kann die Proteinkonzentration in allen seriellen Elutionen auch mit SDS-PAGE analysiert werden, um das Protokoll zu optimieren.
    12. Messen Sie die Proteinkonzentration mittels UV-Absorptionsspektroskopie, kombinieren Sie die gewünschten Elutionsfraktionen und fügen Sie 3C-Protease im Verhältnis 1:5 (w/w) bis 1:10 (w/w) hinzu.
    13. Über Nacht bei 4 °C langsam drehen.
      HINWEIS: Die Schritte 9.1.12 und 9.1.13 sind nur erforderlich, wenn das GFP-Tag entfernt werden muss. Wenn das Entfernen des Tags nicht erforderlich ist, fahren Sie direkt mit Schritt 9.2.4 fort. Alternativ kann das Protein über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden, um am nächsten Tag fortzufahren. Darüber hinaus müssen bei SLCs mit verminderter Stabilität die Proteasekonzentration, die Inkubationszeit und die Temperatur möglicherweise optimiert werden. Die 3C-Protease ist über einen weiten Temperaturbereich aktiv und ermöglicht eine Optimierung, die am besten für verschiedene SLCs geeignet ist.
  2. Tag 2
    1. 2-4 ml Bettvolumen des Kobaltmetallaffinitätsharzes mit SEC-Puffer ausgleichen.
    2. Äquilibriertes Kobaltmetall-Affinitätsharz in die 3C-Reaktionsmischung über Nacht geben und 1 h bei 4 °C drehen.
    3. Gießen Sie die Lösung in eine Schwerkraft-Durchflusssäule und fangen Sie den Durchfluss auf.
    4. Konzentrieren Sie den Durchfluss in einem 100-kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter durch Schleudern bei 3.000 × g bei 4 °C und mischen Sie die Probe vorsichtig alle 5 Minuten, bis das gewünschte SEC-Injektionsvolumen erreicht ist.
    5. Äquilibrieren Sie eine Dextran-Agarose-basierte Größenausschlusschromatographiesäule mit SEC-Puffer. Das SEC-Verfahren sollte bei 4 °C (Kühlkammer oder Kühlraum) durchgeführt werden.
      HINWEIS: Wichtiger Schritt: Abhängig vom oligomeren Zustand des SLC kann eine andere Säule, wie z. B. eine Größenausschlusschromatographiesäule auf Agarosebasis, zur Durchführung der SEC verwendet werden.
    6. Injizieren Sie die Probe in die Probenschleife und führen Sie das SEC-Programm mit einer Durchflussrate aus, bei der der Säulendruck unter den Spezifikationen des Säulenherstellers liegt. Sammeln Sie mit einem Fraktionssammler automatisch 0,3-ml-Fraktionen über den gesamten SEC-Lauf.
    7. Poolen Sie Peak-Fraktionen, messen Sie die UV-Absorption und konzentrieren Sie sie in einem 100-kDa-Cut-off-Zentrifugalkonzentrator auf das erforderliche Volumen/die erforderliche Konzentration durch Schleudern bei 3.000 × g bei 4 °C.

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Ergebnisse

SLC-Gene können aus RESOLUTE pDONR-Plasmiden in BacMam-Vektoren für die Säugetierexpression kloniert werden
Die beschriebenen Protokolle für Klonierung, Expression und Aufreinigung haben sich für viele SLC-Transporter über mehrere Proteinfaltungen hinweg bewährt. Nichtsdestotrotz enthalten die Verfahren mehrere Kontrollpunkte zur Überwachung des Fortschritts, die eine Optimierung ermöglichen, um Unterschiede in der Expression, der Proteinfaltung, der lipid- und detergenzienabhängigen Stabili...

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Diskussion

Die Entwicklung von SLC-gerichteten Therapien wurde durch das Fehlen einer systematischen Charakterisierung der Transporterfunktion behindert. Dies hat dazu geführt, dass im Vergleich zu GPCRs und Ionenkanälen63 unverhältnismäßig weniger Medikamente auf diese Proteinklasse abzielen, obwohl sie zahlreiche Rollen in normalen und pathophysiologischen Prozessen spielen. RESOLUTE ist ein internationales Konsortium, das sich zum Ziel gesetzt hat, modernste Forschungstechniken und -werkzeuge zu entw...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde im Rahmen des RESOLUTE-Projekts durchgeführt. RESOLUTE wurde vom Gemeinsamen Unternehmen Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777372 gefördert. Dieses gemeinsame Unternehmen wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union und EFPIA unterstützt. Dieser Artikel gibt nur die Ansichten der Autoren wieder, und weder das IMI noch die Europäische Union und die EFPIA sind für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen verantwortlich. Das pHTBV-Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. Frederick Boyce (Harvard) zur Verfügung gestellt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3C proteaseProduced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentratorsSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96-well bacmid purification kitMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)Greiner Bio-One780271
Adhesive plastic sealsQiagen19570Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography columnCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAseProduced in-house
BisTrisSigma AldrichB9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris saltAnatraceCH210CHS
Cobalt metal affinity resinTakara Bio635653TALON Metal Affinity Resin
D(+)-BiotinSigma Aldrich851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography columnCytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)DWK Life Sciences357546
EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma Aldrich4693132001cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycerolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgeninAnatraceGDN101GDN
Gravity flow columnsCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 mediumThermo Fisher12338018FreeStyle 293 medium
HEPESApollo ScientificBI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC columnSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4.6 x 150
ImidazoleSigma Aldrich56750
Insect transfection reagentSigma Aldrich71259Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Magnesium Chloride HexahydrateSigma AldrichM2670
Micro-expression shakerGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-β-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17-β-D-GlucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl EtherAnatraceAP1210C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl EtherAnatraceAPO129C12E9
Porous seal for tissue culture platesVWR60941-084Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Recombination enzyme mixThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Serum-free insect mediaGibco10902088Sf-900 II serum-free media
Sodium ButyrateSigma Aldrich303410
Sonicator 24-head probeSonics630-0579
Sonicator power unitSonicsVCX 750
Strep-Tactin resinIBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
SucroseSigma AldrichS7903
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350DDS
Suspension-adapted HEK293 cellsThermo FisherA14527Expi293F
Transfection reagentSigma Aldrich70967GeneJuice Transfection Reagent

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