Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Zusammenfassung

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Zusammenfassung

Solute Carrier (SLCs) sind Membrantransporter, die eine Reihe von endogenen und exogenen Substraten importieren und exportieren, darunter Ionen, Nährstoffe, Metaboliten, Neurotransmitter und Pharmazeutika. Obwohl sich diese Gruppe von Proteinen als attraktive therapeutische Ziele und Marker für Krankheiten erwiesen hat, wird sie von den derzeitigen Pharmazeutika immer noch relativ wenig unter Drogen gesetzt. Wirkstoffforschungsprojekte für diese Transporter werden durch begrenztes strukturelles, funktionelles und physiologisches Wissen behindert, was letztendlich auf die Schwierigkeiten bei der Expression und Reinigung dieser Klasse von membraneingebetteten Proteinen zurückzuführen ist. Hier demonstrieren wir Methoden, um hochreine Milligramm-Mengen von humanen SLC-Transporterproteinen unter Verwendung von Codon-optimierten Gensequenzen zu erhalten. In Verbindung mit einer systematischen Untersuchung des Konstruktdesigns und der Hochdurchsatzexpression stellen diese Protokolle die Erhaltung der strukturellen Integrität und biochemischen Aktivität der Zielproteine sicher. Wir beleuchten auch kritische Schritte in der eukaryotischen Zellexpression, der Affinitätsreinigung und der Größenausschlusschromatographie dieser Proteine. Letztendlich führt dieser Arbeitsablauf zu reinen, funktionell aktiven und stabilen Proteinpräparaten, die sich für hochauflösende Strukturbestimmungen, Transportstudien, niedermolekulare Engagement-Assays und In-vitro-Screenings mit hohem Durchsatz eignen.

Einleitung

Membranproteine sind seit langem Ziele für Forscher und Pharmaindustrie gleichermaßen. Bei den Solute Carriers (SLCs) handelt es sich um eine Familie von über 400 sekundären Transportergenen, die im menschlichen Genom kodiert sind¹. Diese Transporter sind am Import und Export zahlreicher Moleküle beteiligt, darunter Ionen², Neurotransmitter³, Lipide ^4,5,6,7, Aminosäuren⁸, Nährstoffe^9,10,11 und Pharmazeutika

Protokoll

ANMERKUNG: Alle Codon-optimierten RESOLUTE SLC-Gene wurden in AddGene⁴³ deponiert, dessen Links auf der Liste der öffentlichen RESOLUTE-Reagenzien⁴⁴ verfügbar sind. Diese Gene wurden in das pDONR221-Plasmid kloniert und ermöglichen die direkte Klonierung der Gene in den Zielvektor mittels Rekombinationsklonierung⁴⁵. Um die Parallelität zu maximieren, werden Bakterien-, Insekten- und Säugetierzellen im Blockformat für die Bacmid-Produktion (Abschnitt 3), die Baculovirus-Amplifikation (Abschnitt 5) und die Expressionstests (Abschnitt 6) gezüchtet. Für diese Schritte ist ein Mikroexpressionsschüttler....

Diskussion

Die Entwicklung von SLC-gerichteten Therapien wurde durch das Fehlen einer systematischen Charakterisierung der Transporterfunktion behindert. Dies hat dazu geführt, dass im Vergleich zu GPCRs und Ionenkanälen⁶³ unverhältnismäßig weniger Medikamente auf diese Proteinklasse abzielen, obwohl sie zahlreiche Rollen in normalen und pathophysiologischen Prozessen spielen. RESOLUTE ist ein internationales Konsortium, das sich zum Ziel gesetzt hat, modernste Forschungstechniken und -werkzeuge zu entw.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent