구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

요약

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

초록

용질 담체(SLC)는 이온, 영양소, 대사 산물, 신경 전달 물질 및 의약품을 포함한 다양한 내인성 및 외인성 기질을 수입 및 수출하는 막 수송체입니다. 매력적인 치료 표적 및 질병 표지자로 부상했음에도 불구하고 이 단백질 그룹은 여전히 현재 의약품에 비해 상대적으로 약이 부족합니다. 이러한 수송체에 대한 약물 발견 프로젝트는 제한된 구조적, 기능적, 생리학적 지식으로 인해 방해를 받으며, 궁극적으로 이러한 종류의 막에 내장된 단백질의 발현 및 정제의 어려움으로 인해 방해를 받습니다. 여기서는 코돈에 최적화된 유전자 염기서열을 사용하여 고순도 밀리그램 양의 인간 SLC 수송체 단백질을 얻는 방법을 보여줍니다. 구조 설계 및 고처리량 발현에 대한 체계적인 탐색과 함께 이러한 프로토콜은 표적 단백질의 구조적 무결성 및 생화학적 활성의 보존을 보장합니다. 또한 진핵생물 세포 발현, 친화성 정제 및 이러한 단백질의 크기 배제 크로마토그래피에서 중요한 단계를 강조합니다. 궁극적으로 이 워크플로우는 고분해능 구조 측정, 수송 연구, 저분자 관여 분석 및 고처리량 in vitro 스크리닝에 적합한 순수하고 기능적으로 활성화되며 안정적인 단백질 제제를 제공합니다.

서문

막 단백질은 오랫동안 연구자와 제약 산업 모두의 표적이 되어 왔습니다. 이 중 용질 운반체(SLC)는 인간 게놈¹ 내에 암호화된 400개 이상의 2차 수송체 유전자 계열입니다. 이러한 수송체는 이온², 신경 전달 물질³, 지질 4,5,6,7, 아미노산⁸, 영양소 9,10,11 및 의약품 ¹²을 포함한 수많은 분자의 수입 및 수출에 관여합니다. 이러한 광범위한 기질로 인해, 이들 단백질은 독소의 수송(13), 남용 약물(^14,15)에 의한 운반 및 억제, 또는 해로운 돌연변이⁽

프로토콜

참고: 모든 코돈에 최적화된 RESOLUTE SLC 유전자는 AddGene⁴³에 증착되었으며, 이 링크는 RESOLUTE 공공 시약⁴⁴ 목록에서 확인할 수 있습니다. 이들 유전자는 pDONR221 플라스미드로 클로닝되어 재조합 클로닝(⁴⁵)을 이용하여 유전자를 목적 벡터로 직접 클로닝할 수 있다. 병렬성을 극대화하기 위해 박테리아, 곤충 및 포유류 세포는 각각 bacmid 생산(섹션 3), baculovirus 증폭(섹션 5) 및 발현 테스트(섹션 6)를 위해 블록 형식으로 성장합니다. 이러한 단계에서는 충분한 혼합 및 폭기를 보장하기 위해 마이크로 발현 쉐이커가 필요합니다.

1. SLC를 pHTBV1.1 bacmid로 (고처리량) 클로닝

참고: 클로닝 단계는 효율적인 클로닝을 위해 재조합 클로닝 프로토콜을 사용하고 열충격 방법(⁴⁶)을 사용하여 대장균(E. coli)으로 형질전환시킨다. 이 프로토콜은 여러 표적 또는 구조의 높은 처리량 및 병렬 클로닝을 위해 설계되....

토론

SLC 표적 치료제의 개발은 수송체 기능의 체계적인 특성 분석의 부재로 인해 방해를 받고 있습니다. 이로 인해 정상 및 병태생리학적 과정에서의 수많은 역할에도 불구하고 GPCR 및 이온 채널⁶³에 비해 이 단백질 클래스를 표적으로 하는 약물이 불균형적으로 적어졌습니다. RESOLUTE는 현재 SLC 연구를 가속화하고 개선하기 위한 최첨단 연구 기법과 도구를 개발하는 것을 목표로 하는 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent