Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Resumo

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Resumo

Transportadores de solutos (SLCs) são transportadores de membrana que importam e exportam uma gama de substratos endógenos e exógenos, incluindo íons, nutrientes, metabólitos, neurotransmissores e produtos farmacêuticos. Apesar de ter emergido como alvos terapêuticos atraentes e marcadores de doença, esse grupo de proteínas ainda é relativamente subdrogado pelos fármacos atuais. Projetos de descoberta de fármacos para esses transportadores são impedidos por limitados conhecimentos estruturais, funcionais e fisiológicos, em última análise, devido às dificuldades na expressão e purificação dessa classe de proteínas embutidas em membrana. Aqui, demonstramos métodos para obter quantidades de miligramas de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas usando sequências gênicas otimizadas para códons. Em conjunto com uma exploração sistemática do projeto de construção e expressão de alto rendimento, esses protocolos garantem a preservação da integridade estrutural e da atividade bioquímica das proteínas-alvo. Também destacamos etapas críticas na expressão de células eucarióticas, purificação de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho dessas proteínas. Em última análise, esse fluxo de trabalho produz preparações proteicas puras, funcionalmente ativas e estáveis adequadas para determinação de estrutura de alta resolução, estudos de transporte, ensaios de engajamento de moléculas pequenas e triagem in vitro de alto rendimento.

Introdução

As proteínas de membrana têm sido alvos de pesquisadores e indústrias farmacêuticas. Destes, os portadores de solutos (SLCs) são uma família de mais de 400 genes transportadores secundários codificados dentro do genoma humano¹. Esses transportadores estão envolvidos na importação e exportação de inúmeras moléculas, incluindo íons², neurotransmissores³, lipídios 4,5,6,7,^{aminoácidos8}, nutrientes

Protocolo

NOTA: Todos os genes RESOLUTE SLC otimizados para códons foram depositados no AddGene⁴³, cujos links estão disponíveis na lista de reagentes públicos RESOLUTE⁴⁴. Esses genes foram clonados no plasmídeo pDONR221 e permitem a clonagem direta dos genes no vetor de destino usando clonagem de recombinação⁴⁵. Para maximizar o paralelismo, células bacterianas, de insetos e de mamíferos são cultivadas em formato de bloco para produção de bacmid (seção 3), amplificação de baculovírus (seção 5) e teste de expressão (seção 6), respectivamente. Para estas etapas, é necessário um agitador de microexpressão par....

Discussão

O desenvolvimento de terapias direcionadas para SLC tem permanecido dificultado devido à ausência de caracterização sistemática da função do transportador. Isso levou a um número desproporcionalmente menor de drogas direcionadas a essa classe de proteínas em relação aos GPCRs e canais iônicos⁶³, apesar de seus inúmeros papéis em processos normais e fisiopatológicos. RESOLUTE é um consórcio internacional que visa desenvolver técnicas e ferramentas de pesquisa de ponta para acelera.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent