構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

要約

ヒト膜トランスポーターの構造的および生化学的研究には、安定で無傷の均質なタンパク質がミリグラム単位で必要です。ここでは、コドン最適化遺伝子を用いてヒト溶質キャリアトランスポーターをスクリーニング、発現、精製するためのスケーラブルな方法について説明します。

要約

溶質担体(SLC)は、イオン、栄養素、代謝物、神経伝達物質、医薬品など、さまざまな内因性および外因性の基質を輸出入する膜トランスポーターです。このタンパク質群は、魅力的な治療標的および疾患マーカーとして浮上しているにもかかわらず、現在の医薬品では比較的薬漬けにされていません。これらのトランスポーターの創薬プロジェクトは、構造的、機能的、生理学的知識が限られているために妨げられており、最終的にはこのクラスの膜包埋タンパク質の発現と精製が困難であるためです。ここでは、コドン最適化遺伝子配列を用いて、高純度のミリグラム量のヒトSLCトランスポータータンパク質を得る方法を紹介します。これらのプロトコルは、コンストラクトデザインとハイスループット発現の体系的な探索と併せて、標的タンパク質の構造的完全性と生化学的活性の維持を保証します。また、これらのタンパク質の真核細胞発現、アフィニティー精製、およびサイズ排除クロマトグラフィーにおける重要なステップについても強調しています。最終的に、このワークフローにより、高分解能構造決定、輸送研究、低分子結合アッセイ、およびハイスループットin vitro スクリーニングに適した、純粋で機能活性かつ安定したタンパク質調製が得られます。

概要

膜タンパク質は、長い間、研究者や製薬業界の標的となってきました。これらのうち、溶質キャリア(SLC)は、ヒトゲノム1内にコードされている400を超える二次トランスポーター遺伝子のファミリー^です。これらのトランスポーターは、イオン²、神経伝達物質³、脂質4,5,6,7、アミノ酸⁸、栄養素9,10,11、医薬品¹²など、多数の分子の輸出入に関与しています。このような幅広い基質により、これらのタンパク質は、毒素の輸送13、乱用薬物の輸送と阻害^14,15、または有害な突然変異¹⁶を通じて、さまざまな病態生理学にも関与しています。

プロトコル

注:すべてのコドン最適化 RESOLUTE SLC 遺伝子は AddGene⁴³ に寄託されており、そのリンクは RESOLUTE 公開試薬⁴⁴ のリストに掲載されています。これらの遺伝子はpDONR221プラスミドにクローニングされており、組換えクローニングを用いて目的ベクターへの遺伝子の直接クローニングを可能にする⁴⁵。並行性を最大化するために、細菌、昆虫、および哺乳類細胞を、それぞれバクミド産生(セクション3)、バキュロウイルス増幅(セクション5)、および発現試験(セクション6)のためにブロックフォーマットで増殖させます。これらのステップでは、十分な混合と曝気を確保するために、微量発現シェーカーが必要です。

1. pHTBV1.1バクミドへのSLCの(ハイスループット)クローニング

注:クローニングステップは、熱ショック法⁴⁶を用いて、効率的なクローニングおよび大腸菌(大腸菌)への形質転換のための組換えクローニングプロトコルを使用する。このプロトコルは、複数のターゲットまたはコンストラクトのハイスループットおよび並列クローニング用に設計されていますが、より小さな....

ディスカッション

SLCを標的とする治療法の開発は、トランスポーター機能の体系的な特徴付けが欠如しているため、依然として妨げられてきました。これにより、正常および病態生理学的プロセスにおける多くの役割にもかかわらず、GPCRおよびイオンチャネル⁶³と比較して、このタンパク質クラスを標的とする薬剤が不釣り合いに少なくなっています。RESOLUTE は、現在の SLC 研究を加速し、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent