Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques

Résumé

Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.

Résumé

Les transporteurs de solutés (SLC) sont des transporteurs membranaires qui importent et exportent une gamme de substrats endogènes et exogènes, notamment des ions, des nutriments, des métabolites, des neurotransmetteurs et des produits pharmaceutiques. Bien qu’il soit apparu comme des cibles thérapeutiques et des marqueurs de maladie attrayants, ce groupe de protéines est encore relativement sous-médicamenté par les produits pharmaceutiques actuels. Les projets de découverte de médicaments pour ces transporteurs sont entravés par des connaissances structurelles, fonctionnelles et physiologiques limitées, en raison des difficultés d’expression et de purification de cette classe de protéines membranaires. Ici, nous démontrons des méthodes permettant d’obtenir des quantités de l’ordre du milligramme de protéines transporteuses SLC humaines de haute pureté à l’aide de séquences de gènes optimisées pour les codons. En conjonction avec une exploration systématique de la conception de la construction et de l’expression à haut débit, ces protocoles assurent la préservation de l’intégrité structurelle et de l’activité biochimique des protéines cibles. Nous mettons également en évidence les étapes critiques de l’expression des cellules eucaryotes, de la purification par affinité et de la chromatographie d’exclusion de taille de ces protéines. En fin de compte, ce flux de travail produit des préparations protéiques pures, fonctionnellement actives et stables, adaptées à la détermination de la structure à haute résolution, aux études de transport, aux tests d’engagement de petites molécules et au criblage in vitro à haut débit.

Introduction

Les protéines membranaires sont depuis longtemps des cibles pour les chercheurs et les industries pharmaceutiques. Parmi ceux-ci, les porteurs de solutés (SLC) sont une famille de plus de 400 gènes transporteurs secondaires codés dans le génome humain¹. Ces transporteurs sont impliqués dans l’importation et l’exportation de nombreuses molécules, notamment les ions², les neurotransmetteurs³, les lipides 4,5,6,7, les acides aminés⁸, les nutriments 9,10,11 et les produits pharmaceu....

Protocole

REMARQUE : Tous les gènes RESOLUTE SLC optimisés pour les codons ont été déposés dans AddGene⁴³, dont les liens sont disponibles dans la liste des réactifs publics RESOLUTE⁴⁴. Ces gènes ont été clonés dans le plasmide pDONR221 et permettent le clonage direct des gènes dans le vecteur de destination par clonage par recombinaison⁴⁵. Pour maximiser le parallélisme, des cellules bactériennes, d’insectes et de mammifères sont cultivées sous forme de blocs pour la production de bacmides (section 3), l’amplification du baculovirus (section 5) et les tests d’expression (section 6), respectivement. Pour ce....

Discussion

Le développement de thérapies ciblant les SLC est resté entravé en raison de l’absence de caractérisation systématique de la fonction des transporteurs. Cela a conduit à une diminution disproportionnée des médicaments ciblant cette classe de protéines par rapport aux RCPG et aux canaux ioniques⁶³, malgré leurs nombreux rôles dans les processus normaux et physiopathologiques. RESOLUTE est un consortium international qui vise à mettre au point des techniques et des outils de recherche.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent