Establecimiento de un modelo de rata de perfusión pulmonar ex vivo para obtener información traslacional en el trasplante de pulmón

Resumen

Aquí, describimos los pasos necesarios para establecer un modelo de EVLP en ratas y mostramos el perfil inflamatorio asociado con los pulmones perfundidos. El objetivo es propagar el conocimiento y las experiencias sobre el modelo EVLP de ratas, permitiendo la comprensión integral de las respuestas biológicas asociadas a esta revolucionaria técnica.

Resumen

Desde el establecimiento del trasplante pulmonar como estrategia terapéutica para las enfermedades pulmonares avanzadas, la comunidad científica se enfrenta al problema de un bajo número de pulmones considerados viables para el proceso de donación. En las últimas décadas, sin embargo, este escenario ha cambiado positivamente, dado el desarrollo de la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) como estrategia para evaluar y reacondicionar los pulmones marginales. El establecimiento de la EVLP en los grandes centros de trasplante ha favorecido el aumento del número de trasplantes pulmonares, tanto por el aumento de la precisión diagnóstica de la función pulmonar como por constituir una plataforma eficaz para el reacondicionamiento de los injertos pulmonares. En este contexto, frente a cuestiones éticas y logísticas, así como en el estudio de los factores inmunológicos asociados al trasplante pulmonar, el desarrollo de modelos de EVLP en roedores ha cobrado importancia, dada su fiabilidad, la posibilidad de manipulación genética y la reducción de costes. En este artículo se describe un protocolo para establecer un modelo de EVLP en ratas y se muestra el perfil inflamatorio asociado a los pulmones perfundidos. Esto ayudará a propagar el conocimiento sobre el modelo EVLP de rata, promoviendo nuestra comprensión de las respuestas biológicas asociadas con esa técnica revolucionaria.

Introducción

El trasplante pulmonar ha sido reconocido como una estrategia terapéutica para las enfermedades terminales con mejoras en los métodos quirúrgicos y la inmunosupresión durante las últimas décadas. A pesar de la alta demanda, el número de donantes de pulmón fallecidos aceptables es menor que el de otros órganos sólidos, convergiendo al menor número de trasplantes pulmonares realizados ^1,2,3. Para hacer frente a la escasez de donantes, la comunidad médica ha ampliado los criterios para la donación de pulmón, convirtiendo órganos que antes se consideraban inviables en órganos potenciales para trasplante. Sin embargo, los criterios ampliados requieren diferentes esfuerzos para una mejor comprensión e intervención en vista de las posibles consecuencias sistémicas derivadas del órgano donado. La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) surgió como una técnica que proporciona preservación pulmonar normotérmica, evaluación de las funciones pulmonares y reacondicionamiento de pulmones previamente considerados inviables para el proceso de donación ^4,5,6.

Dado el creciente número de trasplantes de pulmón desde el establecimiento de la EVLP en grandes centros de trasplantes, se han investigado cada vez más las estrategias de preservación y reparación pulmonar. En este sentido, frente a cuestiones éticas y logísticas, así como en el estudio de los factores inmunológicos asociados al trasplante pulmonar, el desarrollo de modelos de EVLP en roedores ha cobrado importancia, dada su fiabilidad, la posibilidad de manipulación genética y sus menores costos ^7,8,9. Aquí, describimos los pasos necesarios para establecer un modelo de EVLP en ratas y mostramos el perfil inflamatorio asociado con los pulmones perfundidos.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron cumpliendo con el Protocolo de Uso Animal aprobado por el Comité de Cuidado Animal de la Red Universitaria de Salud. A las ratas Lewis macho (255-330 g) se les dio acceso ad libitum a comida y agua. Luego, se mantuvieron en un ambiente controlado (18-22 °C) con un ciclo día-noche de 12 h. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, soluciones e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Inicialización del sistema de perfusión pulmonar ex vivo

1. Asegúrese de que todos los transductores estén conectados al equipo de órganos de perfusión aislados y al sistema de adquisición de datos (Figura 1). A continuación, abra el software de adquisición de datos.
2. Antes de la perfusión, llene el circuito EVLP con 150 mL de solución Steen suplementada con 1,000 unidades USP de heparina sódica, 50 mg de cefazolina y 50 mg de metilprednisolona.
3. Ajuste el baño de agua tibia a 20 °C. Comience a hacer circular agua tibia para calentar todo el sistema EVLP.

2. Procedimiento de obtención de pulmón del donante

1. Anestesiar a la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) o según la práctica local. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia revisando el reflejo de pellizco de los dedos del pie.
2. Realizar intubación orotraqueal (catéter intravenoso de 14 G). Después de la intubación, conecte el tubo traqueal al sistema de ventilación para animales pequeños. Ventilar la rata con un volumen corriente de 10 mL/kg, una tasa de 60 respiraciones/min, una fracción de oxígeno inspirado (_FiO2) de 0,5 y una presión positiva al final de la espiración (PEEP) de 2_cmH2O.
3. Coloca a la rata en posición supina.
4. Con la ayuda de tijeras y fórceps adecuados, introduzca la cavidad peritoneal y realice la incisión cranealmente, realizando una laparotomía mediana e inyectando heparina sódica (400 unidades USP) en la vena porta.
5. Posteriormente, ingresa a la cavidad torácica a través de la apófisis xifoidea. Realizar la esternotomía con la resección craneal del esternón y apertura radial prudente del diafragma, para no dañar el pulmón.
6. Para recuperar el bloqueo cardíaco y pulmonar, haga una incisión en la vena cava inferior (IVC) y a lo largo del vértice del corazón izquierdo.
7. Con microtijeras, realice una incisión anterior en el tracto de salida del ventrículo derecho. A continuación, inserte un catéter intravenoso de 18 g en el tronco pulmonar y enjuague los pulmones con 20 ml de solución de dextrano (LPD) con bajo contenido de potasio que contenga 10 μg/ml de prostaglandina E1.
8. Inmediatamente después del lavado, pinza el tercio inferior de la tráquea al final de la inspiración para preservar los pulmones en un estado inflado.
9. Recoja el bloque cardíaco y pulmonar y colóquelo en una solución LPD para su almacenamiento.
   NOTA: El injerto pulmonar puede almacenarse a temperaturas y diferentes intervalos de tiempo según el propósito de la investigación. Aquí, mostramos resultados representativos de pulmones que se sometieron a diferentes duraciones de tiempo de isquemia fría (CIT) en hielo.

3. Procedimiento de perfusión pulmonar ex vivo

1. Coloque una ligadura de seda 0 debajo de la arteria pulmonar principal (AP) y alrededor de los ventrículos, y preátela para facilitar la canulación.
2. Conecte la cánula de PA en la línea de entrada del sistema EVLP y arranque la bomba peristáltica con un 10% de flujo de mantenimiento, lo que permite la eliminación de cualquier aire en la cánula de PA.
3. Coloque y asegure la cánula de entrada en la PA principal (OD: 2,0 mm/Diámetro de la cabeza: 2,5 mm), seguida de la cánula de drenaje desde el ápice del corazón hasta la aurícula izquierda (diámetro de la cabeza LA: 4,0 mm) a través de la válvula mitral para su posterior perfusión. Utilizar pinzas para dilatar la válvula mitral, facilitando la canulación.
4. Haga un pequeño orificio en la tráquea e inserte la cánula traqueal (OD: 2,0 mm/L: 14 mm). Luego, conéctelo a la línea de ventilación del sistema.
5. Conecte la cánula LA a la línea de salida del sistema.
6. NOTA: Establecemos el 10% del flujo de mantenimiento como inicio de la perfusión. Para evitar la inserción de burbujas de aire en los pulmones, asegúrese de que la trampa de burbujas esté llena.
7. Aumentar gradualmente el caudal de perfusión hasta alcanzar el 20% del gasto cardíaco (CO).
   NOTA: Para perfundir ambos pulmones, se utilizó un CO estimado de 75 mL/min para ratas de 250 g^10,11. El caudal de perfusión se incrementó gradualmente hasta 1 h hasta alcanzar el caudal objetivo según nuestro protocolo clínico EVLP¹². Los parámetros de perfusión se resumen en la Tabla 1¹³.
8. Retirar la pinza traqueal 20 min después del inicio de la perfusión e iniciar la ventilación pulmonar seguida de iniciar el flujo de gas EVLP (8% CO₂, 6% O₂, 86% N₂) para mantener el flujo de entrada de perfusión PCO₂ entre 35 y 45 mmHg.
   NOTA: Los parámetros de ventilación se resumen en la Tabla 1¹³.

4. Gestión de parámetros y muestras

1. Cada hora durante la EVLP, registre en tiempo real la distensibilidad pulmonar dinámica y la resistencia vascular pulmonar (RVP).
   NOTA: A los 5 minutos antes de las evaluaciones fisiológicas, los pulmones deben expandirse a una presión de inflado.
2. Tome muestras de perfusión del puerto de muestra cada hora y congele rápidamente en nitrógeno líquido para análisis posteriores.
   NOTA: Además, realizamos una maniobra de reclutamiento (hasta 20 cmH₂O) 5 min antes de la evaluación, después de la cual tomamos perfusionados para análisis de gases en sangre para medir pH, PCO₂, PO₂, electrolitos, glucosa y lactato.
3. Detenga la perfusión y pinza la tráquea para mantener los pulmones en un estado inflado. Posteriormente, aísle las muestras de pulmón y congélelas rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelas en soluciones de fijación para estudios posteriores.
   NOTA: Aquí, los pulmones se perfundieron durante 4 h.

Resultados

Todos los pulmones con CIT entre 20 min y 18 h podrían ser perfundidos durante 4 h (Figura 2)¹³. La distensibilidad fue estable en la mayoría de los grupos, a excepción de la CIT de 18 h, que disminuyó gradualmente durante el período de perfusión de 4 h (Figura 2A). A pesar de ello, no se observaron diferencias significativas en la resistencia vascular, la oxigenación del injerto pulmonar y los niv...

Discusión

En este estudio se describen los pasos necesarios para establecer un protocolo de EVLP en ratas. Aquí, demostramos que los pulmones del donante se pueden perfundir durante 4 h después de una conservación estática en frío de hasta 18 h a 4 °C. Esto se demostró mediante la evaluación de la distensibilidad pulmonar, la resistencia vascular pulmonar, la concentración de glucosa perfusiva/lactato y la relación P/F.

El auge de la plataforma EVLP como una ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G intravenous catheter	BD	381167	Orotracheal intubation
16 G intravenous catheter	BD	381157	Catheter to flush the lung
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Tracheal tube fixation
3-0 Suture Sofsilk	Covidien	S303	Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for Rat	Harvard Apparatus	734276	Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula	Harvard Apparatus	73-0711
Left Atrial Cannula	Harvard Apparatus	73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)	XVIVO	19811	Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)	Harvard Apparatus	55-0000
Sodium heparin	Leo Pharma	453811
Steen Solution	XVIVO	19004	Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curv	Mizuho	07-940-86	Tracheal clamp
Tracheal Cannula	Harvard Apparatus	73-3384
Xylazine (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedation/anesthesia