JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את השלבים הדרושים להקמת מודל EVLP של חולדות ומראים את הפרופיל הדלקתי הקשור לריאות המועברות. המטרה היא להפיץ ידע וחוויות על מודל EVLP של חולדות, ולאפשר הבנה אינטגרלית של התגובות הביולוגיות הקשורות לטכניקה מהפכנית זו.

Abstract

מאז הקמת השתלת ריאות כאסטרטגיה טיפולית למחלות ריאה מתקדמות, הקהילה המדעית מתמודדת עם הבעיה של מספר נמוך של ריאות הנחשבות כברות קיימא לתהליך התרומה. עם זאת, בעשורים האחרונים, תרחיש זה השתנה לטובה, לאור התפתחות זלוף ריאות ex vivo (EVLP) כאסטרטגיה להערכה ושיקום מחדש של ריאות שוליות. הקמת EVLP במרכזי השתלות גדולים העדיפה עלייה במספר השתלות הריאה, הן על ידי הגדלת דיוק האבחון של תפקוד הריאות והן על ידי יצירת פלטפורמה יעילה לשיקום שתלי ריאה. בהקשר זה, מול סוגיות אתיות ולוגיסטיות, כמו גם בחקר גורמים אימונולוגיים הקשורים להשתלת ריאות, פיתוח מודלים EVLP של מכרסמים הפך לחשוב, לאור אמינותם, האפשרות למניפולציה גנטית ועלויות נמוכות יותר. מאמר זה מתאר פרוטוקול להקמת מודל EVLP של חולדות ומציג את הפרופיל הדלקתי הקשור לריאות המועברות. זה יעזור להפיץ את הידע על מודל EVLP של חולדות, ויקדם את הבנתנו את התגובות הביולוגיות הקשורות לטכניקה מהפכנית זו.

Introduction

השתלת ריאות הוכרה כאסטרטגיה טיפולית למחלות סופניות עם שיפורים בשיטות הניתוח ודיכוי חיסוני במהלך העשורים האחרונים. למרות הביקוש הרב, מספר תורמי הריאות המתים המקובלים נמוך יותר מאשר עבור איברים מוצקים אחרים, ומתכנס למספר הנמוך יותר של השתלות ריאה שבוצעו 1,2,3. כדי להתמודד עם המחסור במאגר התורמים, הקהילה הרפואית הרחיבה את הקריטריונים לתרומת ריאות, והפכה איברים שנחשבו בעבר לא ברי קיימא לאיברים פוטנציאליים להשתלה. עם זאת, הקריטריונים המורחבים דורשים מאמצים שונים להבנה והתערבות טובה יותר לאור ההשלכות המערכתיות האפשריות שמקורן באיבר שנתרם. זלוף ריאות Ex vivo (EVLP) התגלה כטכניקה המספקת שימור ריאות נורמותרמי, הערכה של תפקודי ריאות ושיפוץ ריאות שנחשבו בעבר כבלתי אפשריים לתהליך התרומה 4,5,6.

בהתחשב במספר ההולך וגדל של השתלות ריאה מאז הקמת EVLP במרכזי השתלות גדולים, אסטרטגיות שימור ותיקון ריאות נחקרו יותר ויותר. במובן זה, מול סוגיות אתיות ולוגיסטיות, כמו גם בחקר גורמים אימונולוגיים הקשורים להשתלת ריאות, פיתוח מודלים EVLP של מכרסמים הפך לחשוב, בהתחשב באמינותם, האפשרות למניפולציה גנטית ועלויות נמוכות יותר 7,8,9. כאן, אנו מתארים את השלבים הדרושים להקמת מודל EVLP של חולדות ומראים את הפרופיל הדלקתי הקשור לריאות המועברות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול השימוש בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ברשת הבריאות האוניברסיטאית. חולדות לואיס זכרות (255-330 גרם) קיבלו גישה אד-ליביטום למזון ומים. לאחר מכן, הם נשמרו בסביבה מבוקרת (18-22 מעלות צלזיוס) עם מחזור יום-לילה של 12 שעות. עיין בטבלת החומרים לפרטים הקשורים לכל החומרים, הפתרונות והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. אתחול מערכת זלוף הריאות ex vivo

  1. ודא שכל המתמרים מחוברים לציוד איברי הזלוף המבודדים ולמערכת רכישת הנתונים (איור 1). לאחר מכן, פתח את תוכנת רכישת הנתונים.
  2. לפני הזילוף, מלאו את מעגל ה-EVLP ב-150 מ"ל של תמיסת Steen בתוספת 1,000 יחידות USP של נתרן הפרין, 50 מ"ג צפזולין ו-50 מ"ג מתילפרדניזולון.
  3. הגדר את אמבט המים החמים ל-20 מעלות צלזיוס. התחל להזרים מים חמים כדי לחמם את כל מערכת ה-EVLP.

2. הליך רכש ריאות תורם

  1. יש להרדים את החולדה באמצעות זריקה תוך-צפקית של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג) או על פי הנוהג המקומי. אשר את עומק ההרדמה הנכון על ידי בדיקת רפלקס צביטת הבוהן.
  2. בצע אינטובציה של אורוטרכאל (צנתר תוך ורידי 14 גרם). לאחר האינטובציה, חבר את צינור קנה הנשימה למערכת האוורור של בעלי חיים קטנים. אווררו את החולדה עם נפח גאות של 10 מ"ל/ק"ג, קצב של 60 נשימות לדקה, מקטע חמצן בהשראה (FiO2) של 0.5 ולחץ נשיפה חיובי (PEEP) של 2 סמ"ש2O.
  3. הניחו את החולדה במצב שכיבה.
  4. בעזרת מספריים ומלקחיים מתאימים, היכנסו לחלל הצפק ונשאו את החתך בגולגולת, בצעו לפרוטומיה חציונית והזריקו נתרן הפרין (400 יחידות USP) לווריד הפורטל.
  5. לאחר מכן, היכנסו לחלל בית החזה דרך תהליך הקסיפואיד. בצע את הסטרנוטומיה עם כריתת הגולגולת של עצם החזה ופתיחה רדיאלית זהירה של הסרעפת, כדי לא לפגוע בריאה.
  6. כדי להחזיר את הלב וחסימת הריאות, בצע חתך בווריד הנבוב התחתון (IVC) ולאורך קודקוד הלב השמאלי.
  7. בעזרת מספריים מיקרו, בצע חתך קדמי בדרכי היציאה של החדר הימני. לאחר מכן, הכנס קטטר תוך-ורידי של 18 גרם לתוך תא המטען הריאתי ושטוף את הריאות עם 20 מ"ל של תמיסת דקסטרן דלת אשלגן (LPD) המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל של פרוסטגלנדין E1.
  8. מיד לאחר השטיפה, מהדקים את השליש התחתון של קנה הנשימה בסוף ההשראה כדי לשמר את הריאות במצב מנופח.
  9. קצרו את גוש הלב והריאות והניחו אותו בתמיסת LPD לאחסון.
    הערה: ניתן לאחסן את שתל הריאה בטמפרטורות ובמרווחי זמן שונים בהתאם למטרת המחקר. כאן, אנו מראים תוצאות מייצגות של ריאות שעברו אורכים משתנים של זמן איסכמי קר (CIT) על קרח.

3. הליך זלוף ריאות ex vivo

  1. הנח קשירה משי 0 מתחת לעורק הריאה הראשי (PA) וסביב החדרים, וקשור מראש כדי להקל על קנולציה.
  2. חבר את צינורית ה-PA בקו הזרימה של מערכת EVLP והפעל את המשאבה הפריסטלטית עם 10% מזרימת התחזוקה, מה שמאפשר הסרת כל אוויר בצינורית הרשות הפלסטינית.
  3. הנח ואבטח את צינורית הזרימה לתוך ה-PA הראשי (OD: 2.0 מ"מ/קוטר ראש: 2.5 מ"מ), ואחריו צינורית הניקוז מקודקוד הלב לתוך האטריום השמאלי (קוטר LA-Head: 4.0 מ"מ) דרך המסתם המיטרלי לזלוף לאחר מכן. השתמש במלקחיים כדי להרחיב את המסתם המיטרלי, מה שמקל על הקנולציה.
  4. צור חור קטן בקנה הנשימה והכנס את צינורית קנה הנשימה (OD: 2.0 מ"מ/ליטר: 14 מ"מ). לאחר מכן, חבר אותו לקו האוורור של המערכת.
  5. חבר את צינורית LA לקו הזרימה של המערכת.
  6. הערה: הגדרנו 10% מזרימת התחזוקה כהתחלת הזלוף. כדי למנוע החדרת בועות אוויר לריאות, ודא שמלכודת הבועות מלאה.
  7. הגדל בהדרגה את קצב הזלוף כדי להגיע ל-20% מתפוקת הלב (CO).
    הערה: כדי לחלחל את שתי הריאות, השתמשנו ב-CO משוער של 75 מ"ל/דקה עבור 250 גרם חולדות10,11. קצב הזרימה של הזלוף הוגדל בהדרגה לשעה אחת כדי להגיע לקצב הזרימה היעד על פי פרוטוקול EVLP הקליני שלנו12. פרמטרי הזלוף מסוכמים בטבלה 113.
  8. הסר את קנה הנשימה clamp 20 דקות לאחר תחילת הזלוף והתחל אוורור ריאות ואחריו התחלת זרימת גז EVLP (8% CO2, 6% O2, 86% N2) כדי לשמור על זרימה PCO2 של בין 35 ל-45 מ"מ כספית.
    הערה: פרמטרי האוורור מסוכמים בטבלה 113.

4. פרמטרים וניהול דוגמאות

  1. בכל שעה במהלך EVLP, רשום בזמן אמת את התאימות הדינמית של הריאות ואת ההתנגדות לכלי הדם הריאתיים (PVR).
    הערה: 5 דקות לפני ההערכות הפיזיולוגיות, יש להרחיב את הריאות ללחץ ניפוח.
  2. קח דגימות פרפוזה מיציאת הדגימה כל שעה והקפיא בזק בחנקן נוזלי לניתוחים נוספים.
    הערה: בנוסף, אנו מבצעים תמרון גיוס (עד 20 סמ"ש2O) 5 דקות לפני ההערכה, ולאחר מכן אנו לוקחים פרפוזטים לאנליזות גזי דם למדידת pH, PCO2, PO2, אלקטרוליטים, גלוקוז ולקטט.
  3. עצור את הזלוף והדק את קנה הנשימה כדי לשמור על הריאות במצב מנופח. לאחר מכן, בודד דגימות ריאה והקפיא אותן בחנקן נוזלי או הנח אותן בתמיסות קיבוע למחקרים נוספים.
    הערה: כאן, הריאות היו מעופפות במשך 4 שעות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כל הריאות עם CIT בטווח שבין 20 דקות ל-18 שעות יכולות להיות מוחדרות למשך 4 שעות (איור 2)13. ההיענות הייתה יציבה ברוב הקבוצות למעט 18 שעות CIT, שירדה בהדרגה במהלך תקופת הזלוף של 4 שעות (איור 2A). למרות זאת, לא נצפו הבדלים משמעותיים בהתנגדות כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקר זה תיאר את הצעדים הדרושים להקמת פרוטוקול EVLP של חולדות. כאן, אנו מראים כי ניתן לחלחל ריאות תורם למשך 4 שעות לאחר שימור סטטי קר של עד 18 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. זה הוכח על ידי הערכת היענות הריאות, תנגודת כלי הדם הריאתיים, ריכוז גלוקוז/לקטט פרפוזה ויחס P/F.

עליי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

MC היא בעלת מניות ב-Traferox Technologies Inc ויועצת ל-Lung Bioengineering Inc. MC מקבלת תמיכה במחקר מ-Beyond Air Inc. ו-Synklino. המחברים מצהירים כי לא היו אינטרסים מתחרים שהיו יכולים להשפיע על התוצאה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgements

איור 1 נוצר עם BioRender.com (אישור זכויות פרסום ורישוי [הסכם: BT25KGSKWF]).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 14 G intravenous catheterBD381167 Orotracheal intubation
16 G intravenous catheterBD381157Catheter to flush the lung
2-0 Suture SofsilkCovidienS-305 Tracheal tube fixation
3-0 Suture SofsilkCovidienS303 Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for RatHarvard Apparatus734276Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)Vetoquinol440894Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula Harvard Apparatus73-0711
Left Atrial Cannula Harvard Apparatus73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)XVIVO19811Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)Pfizer14705Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)PfizerRX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)Harvard Apparatus55-0000
Sodium heparinLeo Pharma453811
Steen SolutionXVIVO19004Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curvMizuho07-940-86Tracheal clamp
Tracheal Cannula Harvard Apparatus73-3384
Xylazine (Rompun)Bayer Healthcare 2169592Sedation/anesthesia

References

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
  3. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
  4. Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
  5. Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
  6. Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
  7. Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
  8. Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
  9. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  10. Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
  11. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
  12. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
  13. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
  14. Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
  15. Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
  16. Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ex Vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved