Estabelecimento de um modelo de rato de perfusão pulmonar ex vivo para insights translacionais em transplante de pulmão

Resumo

Aqui, descrevemos as etapas necessárias para estabelecer um modelo de EVLP em ratos e mostramos o perfil inflamatório associado aos pulmões perfundidos. O objetivo é propagar conhecimentos e experiências sobre o modelo de PPEV de ratos, possibilitando a compreensão integral das respostas biológicas associadas a essa técnica revolucionária.

Resumo

Desde o estabelecimento do transplante pulmonar como estratégia terapêutica para doenças pulmonares avançadas, a comunidade científica se depara com o problema de um baixo número de pulmões considerados viáveis para o processo de doação. Nas últimas décadas, no entanto, esse cenário foi alterado positivamente, dado o desenvolvimento da perfusão pulmonar ex vivo (PPEV) como estratégia de avaliação e recondicionamento de pulmões marginais. O estabelecimento da PPEV em grandes centros transplantadores favoreceu o aumento do número de transplantes pulmonares, tanto por aumentar a acurácia diagnóstica da função pulmonar quanto por constituir uma plataforma eficaz para o recondicionamento de enxertos pulmonares. Nesse contexto, diante de questões éticas e logísticas, bem como no estudo de fatores imunológicos associados ao transplante pulmonar, o desenvolvimento de modelos de PPEV em roedores tornou-se importante, dada a sua confiabilidade, possibilidade de manipulação genética e menores custos. Este artigo descreve um protocolo para estabelecer um modelo de PPEV em ratos e mostra o perfil inflamatório associado aos pulmões perfundidos. Isso ajudará a propagar o conhecimento sobre o modelo EVLP de rato, promovendo nossa compreensão das respostas biológicas associadas a essa técnica revolucionária.

Introdução

O transplante pulmonar tem sido reconhecido como uma estratégia terapêutica para doenças em estágio terminal, com melhorias nos métodos cirúrgicos e imunossupressão nas últimas décadas. Apesar da alta demanda, o número de doadores de pulmão falecidos aceitáveis é menor do que para outros órgãos sólidos, convergindo para o menor número de transplantes pulmonares realizados ^1,2,3. Para lidar com a escassez de doadores, a comunidade médica expandiu os critérios para doação de pulmão, transformando órgãos anteriormente considerados inviáveis em órgãos potenciais para transplante. No entanto, os critérios ampliados requerem esforços diferenciados para melhor compreensão e intervenção, tendo em vista as possíveis consequências sistêmicas decorrentes do órgão doado. A perfusão pulmonar ex vivo (PPEV) surgiu como uma técnica que proporciona preservação pulmonar normotérmica, avaliação das funções pulmonares e recondicionamento de pulmões antes considerados inviáveis para o processo de doação ^4,5,6.

Dado o crescente número de transplantes pulmonares desde o estabelecimento da PPEV em grandes centros de transplante, as estratégias de preservação e reparo pulmonar têm sido cada vez mais investigadas. Nesse sentido, diante de questões éticas e logísticas, bem como no estudo dos fatores imunológicos associados ao transplante pulmonar, o desenvolvimento de modelos de PPEV em roedores tornou-se importante, dada a sua confiabilidade, possibilidade de manipulação genética e menores custos ^7,8,9. Aqui, descrevemos as etapas necessárias para estabelecer um modelo de PPEV em ratos e mostrar o perfil inflamatório associado aos pulmões perfundidos.

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Protocolo

Os experimentos em animais foram realizados em conformidade com o Protocolo de Uso de Animais aprovado pelo Comitê de Cuidados com os Animais da Rede Universitária de Saúde. Ratos Lewis machos (255-330 g) receberam acesso ad libitum a comida e água. Em seguida, foram mantidos em ambiente controlado (18-22 °C) com ciclo dia-noite de 12 h. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, soluções e instrumentos usados neste protocolo.

1. Inicialização do sistema de perfusão pulmonar ex vivo

1. Certifique-se de que todos os transdutores estejam conectados ao equipamento do órgão de perfusão isolado e ao sistema de aquisição de dados (Figura 1). Em seguida, abra o software de aquisição de dados.
2. Antes da perfusão, preencha o circuito de PPEV com 150 mL de solução de Steen suplementada com 1.000 unidades USP de heparina sódica, 50 mg de cefazolina e 50 mg de metilprednisolona.
3. Defina o banho-maria morno para 20 °C. Comece a circular água morna para aquecer todo o sistema EVLP.

2. Procedimento de colheita de pulmão do dador

1. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) ou de acordo com a prática local. Confirme a profundidade adequada da anestesia verificando o reflexo de pinça do dedo do pé.
2. Realize a intubação orotraqueal (cateter intravenoso 14 G). Após a intubação, conecte o tubo traqueal ao sistema de ventilação de pequenos animais. Ventile o rato com volume corrente de 10 mL / kg, frequência de 60 respirações / min, fração inspirada de oxigênio (FiO₂) de 0,5 e pressão expiratória final positiva (PEEP) de 2 cmH₂O.
3. Coloque o rato em decúbito dorsal.
4. Com o auxílio de tesouras e pinças apropriadas, entrar na cavidade peritoneal e realizar a incisão cranialmente, realizando uma laparotomia mediana e injetando heparina sódica (400 unidades USP) na veia porta.
5. Posteriormente, entre na cavidade torácica através do processo xifóide. Realize a esternotomia com a ressecção cranial do esterno e abertura radial cautelosa do diafragma, para não danificar o pulmão.
6. Para recuperar o bloqueio cardíaco e pulmonar, faça uma incisão na veia cava inferior (VCI) e ao longo do ápice do coração esquerdo.
7. Usando uma microtesoura, faça uma incisão anterior na via de saída do ventrículo direito. Em seguida, insira um cateter intravenoso 18 G no tronco pulmonar e lave os pulmões com 20 mL de solução de dextrana com baixo teor de potássio (LPD) contendo 10 μg / mL de prostaglandina E1.
8. Imediatamente após a lavagem, aperte o terço inferior da traqueia no final da inspiração para preservar os pulmões em um estado inflado.
9. Colha o bloco cardíaco e pulmonar e coloque-o em solução LPD para armazenamento.
   NOTA: O enxerto pulmonar pode ser armazenado em temperaturas e diferentes intervalos de tempo de acordo com o objetivo da pesquisa. Aqui, mostramos resultados representativos de pulmões que sofreram durações variadas de tempo isquêmico frio (CIT) no gelo.

3. Procedimento de perfusão pulmonar ex vivo

1. Coloque uma ligadura de seda 0 abaixo da artéria pulmonar principal (AP) e ao redor dos ventrículos, e pretie para facilitar a canulação.
2. Conecte a cânula PA na linha de entrada do sistema EVLP e inicie a bomba peristáltica com 10% do fluxo de manutenção, permitindo a remoção de qualquer ar na cânula PA.
3. Coloque e prenda a cânula de entrada no PA principal (OD: 2.0 mm/Diâmetro da cabeça: 2.5 mm), seguida pela cânula de drenagem do ápice do coração para o átrio esquerdo (Diâmetro da cabeça do AE: 4.0 mm) através da válvula mitral para perfusão subsequente. Use fórceps para dilatar a válvula mitral, facilitando a canulação.
4. Faça um pequeno orifício na traqueia e insira a cânula traqueal (OD: 2,0 mm/L: 14 mm). Em seguida, conecte-o à linha de ventilação do sistema.
5. Conecte a cânula LA à linha de saída do sistema.
6. NOTA: Definimos 10% do fluxo de manutenção como o início da perfusão. Para evitar a inserção de bolhas de ar nos pulmões, certifique-se de que o coletor de bolhas esteja cheio.
7. Aumente gradualmente a taxa de fluxo de perfusão para atingir 20% do débito cardíaco (DC).
   NOTA: Para perfundir ambos os pulmões, usamos um CO estimado de 75 mL/min para ratos de 250 g^10,11. A taxa de fluxo de perfusão foi gradualmente aumentada para 1 h para atingir a taxa de fluxo alvo de acordo com nosso protocolo clínico de EVLP¹². Os parâmetros de perfusão estão resumidos na Tabela 1¹³.
8. Remova a pinça traqueal 20 min após o início da perfusão e inicie a ventilação pulmonar seguida pelo início do fluxo de gás EVLP (8% CO₂, 6% O₂, 86% N₂) para manter o perfusato de entrada PCO₂ entre 35 e 45 mmHg.
   NOTA: Os parâmetros de ventilação estão resumidos na Tabela 1¹³.

4. Parâmetros e gerenciamento de amostras

1. A cada hora durante a PPEV, registre em tempo real a complacência pulmonar dinâmica e a resistência vascular pulmonar (RVP).
   NOTA: Aos 5 minutos antes das avaliações fisiológicas, os pulmões devem ser expandidos para uma pressão de insuflação.
2. Colher amostras de perfusato da porta de recolha de amostras a cada hora e congelar rapidamente em azoto líquido para análises posteriores.
   NOTA: Além disso, realizamos uma manobra de recrutamento (até 20 cmH₂O) 5 min antes da avaliação, após a qual tomamos perfusato para gasometria para medir pH, PCO₂, PO₂, eletrólitos, glicose e lactato.
3. Pare a perfusão e aperte a traqueia para manter os pulmões em um estado inflado. Em seguida, isole as amostras de pulmão e congele-as rapidamente em nitrogênio líquido ou coloque-as em soluções de fixação para estudos posteriores.
   NOTA: Aqui, os pulmões foram perfundidos por 4 h.

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Resultados

Todos os pulmões com TCI variando de 20 min a 18 h podem ser perfundidos por 4 h (Figura 2)¹³. A adesão foi estável na maioria dos grupos, com exceção da TCI de 18 h, que diminuiu gradualmente ao longo do período de perfusão de 4 h (Figura 2A). Apesar disso, não foram observadas diferenças significativas na resistência vascular, oxigenação do enxerto pulmonar e níveis de glicose para os grupo...

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Discussão

Este estudo descreveu as etapas necessárias para o estabelecimento de um protocolo de PPEV em ratos. Aqui, mostramos que os pulmões do doador podem ser perfundidos por 4 h após preservação estática a frio de até 18 h a 4 ° C. Isso foi demonstrado pela avaliação da complacência pulmonar, resistência vascular pulmonar, concentração de glicose/lactato de perfusato e relação P/F.

O surgimento da plataforma EVLP como uma ferramenta importante na av...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G intravenous catheter	BD	381167	Orotracheal intubation
16 G intravenous catheter	BD	381157	Catheter to flush the lung
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Tracheal tube fixation
3-0 Suture Sofsilk	Covidien	S303	Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for Rat	Harvard Apparatus	734276	Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula	Harvard Apparatus	73-0711
Left Atrial Cannula	Harvard Apparatus	73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)	XVIVO	19811	Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)	Harvard Apparatus	55-0000
Sodium heparin	Leo Pharma	453811
Steen Solution	XVIVO	19004	Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curv	Mizuho	07-940-86	Tracheal clamp
Tracheal Cannula	Harvard Apparatus	73-3384
Xylazine (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedation/anesthesia