폐 이식의 중개 통찰력을 위한 Ex vivo Lung Perfusion Rat Model 구축

요약

여기에서는 쥐 EVLP 모델을 확립하는 데 필요한 단계를 설명하고 관류된 폐와 관련된 염증 프로파일을 보여줍니다. 목표는 쥐 EVLP 모델에 대한 지식과 경험을 전파하여 이 혁신적인 기술과 관련된 생물학적 반응을 통합적으로 이해할 수 있도록 하는 것입니다.

초록

진행성 폐 질환에 대한 치료 전략으로 폐 이식이 확립된 이래, 과학계는 기증 과정에 사용할 수 있는 것으로 간주되는 폐의 수가 적은 문제에 직면해 있습니다. 그러나 최근 수십 년 동안 변연 폐를 평가하고 재조정하기 위한 전략으로 생체 외 폐 관류(EVLP)가 개발됨에 따라 이 시나리오는 긍정적으로 바뀌었습니다. 대규모 이식 센터에 EVLP를 설립하면 폐 기능의 진단 정확도를 높이고 폐 이식 재조정을 위한 효과적인 플랫폼을 구성함으로써 폐 이식 횟수를 늘릴 수 있습니다. 이러한 맥락에서 폐 이식과 관련된 면역학적 요인에 대한 연구뿐만 아니라 윤리적 및 물류 문제에 직면하여 신뢰성, 유전자 조작 가능성 및 비용 절감을 고려할 때 설치류 EVLP 모델의 개발이 중요해졌습니다. 이 논문은 쥐 EVLP 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 설명하고 관류된 폐와 관련된 염증 프로파일을 보여줍니다. 이것은 쥐 EVLP 모델에 대한 지식을 전파하는 데 도움이 될 것이며, 그 혁신적인 기술과 관련된 생물학적 반응에 대한 우리의 이해를 촉진할 것입니다.

서문

폐 이식은 지난 수십 년 동안 수술 방법과 면역 억제의 개선과 함께 말기 질환에 대한 치료 전략으로 인식되어 왔습니다. 높은 수요에도 불구하고, 수용 가능한 사망 폐 기증자의 수는 다른 고형 장기보다 적으며, 이는 ^{1,2,3 시행된} 폐 이식 건수가 더 적은 것으로 수렴됩니다. 기증자 부족 문제를 해결하기 위해 의료계는 폐 기증 기준을 확대하여 이전에는 생존 불가능하다고 여겨졌던 장기를 이식을 위한 잠재적 장기로 전환했습니다. 그러나 확장된 기준은 기증된 장기에서 비롯될 수 있는 전신적 결과를 고려하여 더 나은 이해와 개입을 위해 다른 노력을 필요로 합니다. 생체 외 폐 관류(Ex vivo lung perfusion, EVLP)는 이전에는 기증 과정에서 실현 불가능한 것으로 여겨졌던 정상 저온 폐 보존, 폐 기능 평가 및 폐 재조정을 제공하는 기술로 부상했습니다 ^4,5,6.

대규모 이식 센터에서 EVLP가 설립된 이후 폐 이식 건수가 증가함에 따라 폐 보존 및 복구 전략에 대한 조사가 점점 더 많이 이루어지고 있습니다. 이러한 의미에서 폐 이식과 관련된 면역학적 요인에 대한 연구뿐만 아니라 윤리적 및 물류 문제에 직면하여 설치류 EVLP 모델의 개발은 신뢰성, 유전자 조작 가능성 및 비용 절감을 감안할 때 중요해졌습니다 ^7,8,9. 여기에서는 쥐 EVLP 모델을 확립하고 관류된 폐와 관련된 염증 프로파일을 보여주는 데 필요한 단계를 설명합니다.

프로토콜

동물 실험은 University Health Network의 동물 관리 위원회에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 수컷 루이스 쥐(255-330g)에게는 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 기회가 주어졌습니다. 그런 다음 18-22 ° C에서 12 시간의 주야간 주기로 유지 관리되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 솔루션 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 체외 폐 관류 시스템의 초기화

1. 모든 트랜스듀서가 격리된 관류 기관 장비와 데이터 수집 시스템에 연결되어 있는지 확인합니다(그림 1). 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다.
2. 관류 전에 EVLP 회로를 1,000 USP 단위의 헤파린나트륨, 50mg의 세파졸린 및 50mg의 메틸프레드니솔론이 보충된 150mL의 Steen 용액으로 채웁니다.
3. 따뜻한 물 수조를 20°C로 설정합니다. 전체 EVLP 시스템을 예열하기 위해 따뜻한 물을 순환시키기 시작합니다.

2. 기증자 폐 조달 절차

1. 케타민(50mg/kg)과 자일라진(5mg/kg)의 복강 내 주사로 또는 현지 관행에 따라 쥐를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.
2. 구강 기관 삽관(14G 정맥 카테터)을 수행합니다. 삽관 후 기관 튜브를 소형 동물 환기 시스템에 연결합니다. 10mL/kg의 일회 호흡량, 60 breaths/min의 속도, 0.5의 흡기 산소 분율(FiO₂), 2cmH₂O의 양단 호기압(PEEP)으로 쥐를 환기시킵니다.
3. 쥐를 누운 자세로 놓습니다.
4. 적절한 가위와 집게를 사용하여 복막강에 들어가 절개 부위를 두개골로 운반하여 정중 개복술을 시행하고 헤파린나트륨(400USP 단위)을 문맥에 주입합니다.
5. 그 후, xyphoid process를 통해 흉강으로 들어갑니다. 폐가 손상되지 않도록 흉골의 두개골 절제술과 횡격막의 조심스럽게 방사형 개구부로 흉골 절개술을 시행하십시오.
6. 심장과 폐 차단을 회수하려면 하대정맥(IVC)과 왼쪽 심장의 정점을 따라 절개합니다.
7. 마이크로 가위를 사용하여 우심실 유출로에서 전방 절개를 수행합니다. 그런 다음 18G 정맥 주사 카테터를 폐간에 삽입하고 10μg/mL의 프로스타글란딘 E1이 함유된 20mL의 저칼륨 덱스트란(LPD) 용액으로 폐를 세척합니다.
8. 플러싱 직후, 흡입 끝에 있는 기관의 아래쪽 1/3을 고정하여 폐를 팽창된 상태로 보존합니다.
9. 심장과 폐 블록을 수확하여 LPD 용액에 넣어 보관합니다.
   참고: 폐 이식편은 연구 목적에 따라 온도와 다양한 시간 간격으로 보관할 수 있습니다. 여기에서는 얼음 위에서 다양한 길이의 저온 허혈 시간(CIT)을 거친 폐의 대표적인 결과를 보여줍니다.

3. 생체 외 폐 관류 절차

1. 주폐동맥(PA) 아래와 심실 주위에 0 실크 결찰을 놓고 캐뉼레이션을 용이하게 하기 위해 미리 묶습니다.
2. EVLP 시스템의 유입 라인에 PA 캐뉼러를 연결하고 유지 보수 흐름의 10%로 연동 펌프를 시작하여 PA 캐뉼라의 공기를 제거할 수 있습니다.
3. 유입 캐뉼라를 메인 PA(OD: 2.0mm/헤드 직경: 2.5mm)에 배치하고 고정한 다음 심장 정점에서 좌심방(LA-헤드 직경: 4.0mm)으로 배액 캐뉼라를 후속 관류를 위해 승모판을 통해 좌심방(LA-헤드 직경: 4.0mm)으로 이동합니다. 집게를 사용하여 승모판막을 확장하여 캐뉼레이션을 용이하게 합니다.
4. 기관에 작은 구멍을 뚫고 기관 캐뉼라(OD: 2.0mm/L: 14mm)를 삽입합니다. 그런 다음 시스템의 환기 라인에 연결하십시오.
5. LA 캐뉼러를 시스템의 유출 라인에 연결합니다.
6. 참고: 유지 보수 흐름의 10%를 관류 시작으로 설정합니다. 폐에 기포가 삽입되는 것을 방지하려면 기포 트랩이 채워져 있는지 확인하십시오.
7. 심박출량(CO)의 20%에 도달하도록 유속 관류를 점차적으로 증가시킵니다.
   참고 : 양쪽 폐를 관류하기 위해 250g 쥐에 대해 75mL / 분의 예상 CO를 사용했습니다^10,11. 관류의 유속은 임상 EVLP 프로토콜¹²에 따라 목표 유속에 도달하기 위해 1시간으로 점진적으로 증가되었습니다. 관류 매개변수는 표 1¹³에 요약되어 있습니다.
8. 관류 시작 후 20분 후에 기관 클램프를 제거하고 폐 환기를 시작한 다음 EVLP 가스(8% CO₂, 6% O₂, 86% N₂)의 흐름을 시작하여 35에서 45mmHg 사이의 유입 관류액 PCO₂ 를 유지합니다.
   알림: 환기 매개변수는 표 1¹³에 요약되어 있습니다.

4. 매개 변수 및 샘플 관리

1. EVLP 기간 동안 매시간 동적 폐 순응도 및 폐혈관 저항(PVR)을 실시간으로 기록합니다.
   참고: 생리학적 평가 5분 전에 폐를 팽창 압력으로 확장해야 합니다.
2. 매시간 샘플 포트에서 샘플을 관류하고 추가 분석을 위해 액체 질소에서 급속 동결합니다.
   참고: 또한 평가 5분 전에 모집 기동(최대 20cmH₂O)을 수행한 후 pH, PCO₂, PO₂, 전해질, 포도당 및 젖산을 측정하기 위해 혈액 가스 분석을 위해 관류물을 측정합니다.
3. 관류를 중지하고 기관을 고정하여 폐를 팽창된 상태로 유지합니다. 그런 다음 폐 샘플을 분리하고 액체 질소로 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣습니다.
   참고: 여기에서 폐는 4시간 동안 관류되었습니다.

결과

20분에서 18시간 사이의 CIT가 있는 모든 폐는 4시간 동안 관류될 수 있습니다(그림 2)¹³. 순응도는 18시간 CIT를 제외하고 대부분의 그룹에서 안정적이었으며, 이는 4시간 관류 기간에 걸쳐 점차적으로 감소했습니다(그림 2A). 그럼에도 불구하고, 그룹에서 혈관 저항, 폐 이식편 산소화 및 포도당 수치에서 유의한 ?...

토론

이 연구는 쥐 EVLP 프로토콜을 수립하는 데 필요한 단계를 설명했습니다. 여기에서는 4°C에서 최대 18시간의 냉간 정전기 보존 후 기증자 폐를 4시간 동안 관류할 수 있음을 보여줍니다. 이는 폐 순응도, 폐혈관 저항, 관류산 포도당/젖산 농도 및 P/F 비율을 평가하여 입증되었습니다.

EVLP 플랫폼이 폐 기능 평가 및 이식편 재조정에서 중요한 도구로 부상...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G intravenous catheter	BD	381167	Orotracheal intubation
16 G intravenous catheter	BD	381157	Catheter to flush the lung
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Tracheal tube fixation
3-0 Suture Sofsilk	Covidien	S303	Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for Rat	Harvard Apparatus	734276	Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula	Harvard Apparatus	73-0711
Left Atrial Cannula	Harvard Apparatus	73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)	XVIVO	19811	Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)	Harvard Apparatus	55-0000
Sodium heparin	Leo Pharma	453811
Steen Solution	XVIVO	19004	Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curv	Mizuho	07-940-86	Tracheal clamp
Tracheal Cannula	Harvard Apparatus	73-3384
Xylazine (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedation/anesthesia