Istituzione di un modello di ratto di perfusione polmonare ex vivo per approfondimenti traslazionali nel trapianto di polmone

Riepilogo

Qui, descriviamo i passaggi necessari per stabilire un modello EVLP di ratto e mostriamo il profilo infiammatorio associato ai polmoni perfusi. L'obiettivo è quello di diffondere la conoscenza e le esperienze sul modello EVLP del ratto, consentendo la comprensione integrale delle risposte biologiche associate a questa tecnica rivoluzionaria.

Abstract

Da quando si è affermata la trapianto di polmone come strategia terapeutica per le malattie polmonari avanzate, la comunità scientifica si è trovata di fronte al problema di un basso numero di polmoni considerati vitali per il processo di donazione. Negli ultimi decenni, tuttavia, questo scenario è stato positivamente modificato, dato lo sviluppo della perfusione polmonare ex vivo (EVLP) come strategia per la valutazione e il ricondizionamento dei polmoni marginali. L'affermazione dell'EVLP nei grandi centri trapianti ha favorito un aumento del numero di trapianti di polmone, sia aumentando l'accuratezza diagnostica della funzione polmonare, sia costituendo un'efficace piattaforma per il ricondizionamento degli innesti polmonari. In questo contesto, di fronte a questioni etiche e logistiche, nonché allo studio dei fattori immunologici associati al trapianto di polmone, lo sviluppo di modelli EVLP di roditori è diventato importante, data la loro affidabilità, la possibilità di manipolazione genetica e i costi inferiori. Questo articolo descrive un protocollo per stabilire un modello EVLP di ratto e mostra il profilo infiammatorio associato ai polmoni perfusi. Ciò contribuirà a diffondere la conoscenza del modello EVLP del ratto, promuovendo la nostra comprensione delle risposte biologiche associate a questa tecnica rivoluzionaria.

Introduzione

Il trapianto di polmone è stato riconosciuto come una strategia terapeutica per le malattie allo stadio terminale, con miglioramenti nei metodi chirurgici e nell'immunosoppressione negli ultimi decenni. Nonostante l'elevata domanda, il numero di donatori di polmone deceduti accettabili è inferiore a quello di altri organi solidi, convergendo verso il minor numero di trapianti di polmone eseguiti ^1,2,3. Per affrontare la carenza di donatori, la comunità medica ha ampliato i criteri per la donazione di polmoni, trasformando organi precedentemente considerati non vitali in potenziali organi per il trapianto. Tuttavia, i criteri estesi richiedono sforzi diversi per una migliore comprensione e intervento in vista delle possibili conseguenze sistemiche originate dall'organo donato. La perfusione polmonare ex vivo (EVLP) è emersa come una tecnica che fornisce la conservazione normotermica del polmone, la valutazione delle funzioni polmonari e il ricondizionamento dei polmoni precedentemente considerati non fattibili per il processo di donazione ^4,5,6.

Dato il numero crescente di trapianti di polmone dall'istituzione dell'EVLP nei grandi centri di trapianto, le strategie di conservazione e riparazione del polmone sono state sempre più studiate. In questo senso, di fronte a questioni etiche e logistiche, nonché allo studio dei fattori immunologici associati al trapianto di polmone, lo sviluppo di modelli EVLP di roditori è diventato importante, data la loro affidabilità, la possibilità di manipolazione genetica e i costi inferiori ^7,8,9. Qui, descriviamo i passaggi necessari per stabilire un modello EVLP di ratto e mostriamo il profilo infiammatorio associato ai polmoni perfusi.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Protocollo di Utilizzo degli Animali approvato dal Comitato per la Cura degli Animali presso la Rete Sanitaria di Ateneo. Ai ratti maschi di Lewis (255-330 g) è stato dato accesso ad libitum a cibo e acqua. Successivamente, sono stati mantenuti in un ambiente controllato (18-22 °C) con un ciclo giorno-notte di 12 ore. Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le soluzioni e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Inizializzazione del sistema di perfusione polmonare ex vivo

1. Assicurarsi che tutti i trasduttori siano collegati all'apparecchiatura dell'organo di perfusione isolato e al sistema di acquisizione dati (Figura 1). Quindi, aprire il software di acquisizione dati.
2. Prima della perfusione, riempire il circuito EVLP con 150 ml di soluzione di Steen integrata con 1.000 unità USP di eparina sodica, 50 mg di cefazolina e 50 mg di metilprednisolone.
3. Impostare il bagnomaria caldo a 20 °C. Inizia a far circolare l'acqua calda per riscaldare l'intero sistema EVLP.

2. Procedura di approvvigionamento del polmone del donatore

1. Anestetizzare il ratto con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) o secondo la pratica locale. Confermare la corretta profondità dell'anestesia controllando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
2. Eseguire l'intubazione orotracheale (catetere endovenoso da 14 G). Dopo l'intubazione, collegare il tubo tracheale al sistema di ventilazione per piccoli animali. Ventilare il ratto con un volume corrente di 10 ml/kg, una velocità di 60 respiri/min, una frazione di ossigeno inspirata (FiO₂) di 0,5 e una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 2 cmH₂O.
3. Metti il topo in posizione supina.
4. Con l'aiuto di forbici e pinze appropriate, entrare nella cavità peritoneale e portare l'incisione cranialmente, eseguendo una laparotomia mediana e iniettando eparina sodica (400 unità USP) nella vena porta.
5. Successivamente, entrare nella cavità toracica attraverso il processo xifoideo. Eseguire la sternotomia con la resezione cranica dello sterno e una cauta apertura radiale del diaframma, in modo da non danneggiare il polmone.
6. Per recuperare il cuore e il blocco polmonare, praticare un'incisione nella vena cava inferiore (IVC) e lungo l'apice del cuore sinistro.
7. Utilizzando le micro forbici, eseguire un'incisione anteriore nel tratto di efflusso ventricolare destro. Quindi, inserire un catetere endovenoso da 18 G nel tronco polmonare e lavare i polmoni con 20 mL di soluzione di destrano a basso contenuto di potassio (LPD) contenente 10 μg/mL di prostaglandina E1.
8. Immediatamente dopo il lavaggio, bloccare il terzo inferiore della trachea alla fine dell'inspirazione per mantenere i polmoni in uno stato di gonfiaggio.
9. Raccogliere il blocco cardiaco e polmonare e metterlo nella soluzione LPD per la conservazione.
   NOTA: L'innesto polmonare può essere conservato a temperature e intervalli di tempo diversi a seconda dello scopo della ricerca. Qui, mostriamo risultati rappresentativi di polmoni che hanno subito periodi variabili di tempo ischemico freddo (CIT) sul ghiaccio.

3. Procedura di perfusione polmonare ex vivo

1. Posizionare una legatura di seta 0 sotto l'arteria polmonare principale (PA) e intorno ai ventricoli e prelegata per facilitare l'incannulamento.
2. Collegare la cannula PA alla linea di afflusso del sistema EVLP e avviare la pompa peristaltica con il 10% del flusso di mantenimento, consentendo la rimozione dell'aria nella cannula PA.
3. Posizionare e fissare la cannula di afflusso nel PA principale (OD: 2,0 mm/diametro della testa: 2,5 mm), seguita dalla cannula di drenaggio dall'apice del cuore nell'atrio sinistro (diametro della testa LA: 4,0 mm) attraverso la valvola mitrale per la successiva perfusione. Utilizzare una pinza per dilatare la valvola mitrale, facilitando l'incannulamento.
4. Praticare un piccolo foro nella trachea e inserire la cannula tracheale (OD: 2,0 mm/L: 14 mm). Quindi, collegarlo alla linea di ventilazione del sistema.
5. Collegare la cannula LA alla linea di deflusso del sistema.
6. NOTA: Impostiamo il 10% del flusso di mantenimento come inizio della perfusione. Per evitare l'inserimento di bolle d'aria nei polmoni, assicurarsi che la trappola per bolle sia piena.
7. Aumentare gradualmente la velocità di flusso perfusionale fino a raggiungere il 20% della gittata cardiaca (CO).
   NOTA: Per perfondere entrambi i polmoni, abbiamo utilizzato un CO stimato di 75 ml/min per ratti da 250 g^10,11. La velocità di flusso di perfusione è stata gradualmente aumentata a 1 ora per raggiungere la portata target secondo il nostro protocollo clinico EVLP¹². I parametri di perfusione sono riassunti nella Tabella 1¹³.
8. Rimuovere il morsetto tracheale 20 minuti dopo l'inizio della perfusione e avviare la ventilazione polmonare seguita dall'avvio del flusso di gas EVLP (8% CO₂, 6% O₂, 86% N₂) per mantenere l'afflusso di PCO₂ perfusato compreso tra 35 e 45 mmHg.
   NOTA: I parametri di ventilazione sono riassunti nella Tabella 1¹³.

4. Parametri e gestione dei campioni

1. Ogni ora durante l'EVLP, registra in tempo reale la compliance polmonare dinamica e la resistenza vascolare polmonare (PVR).
   NOTA: A 5 minuti prima delle valutazioni fisiologiche, i polmoni devono essere espansi a una pressione di gonfiaggio.
2. Prelevare campioni di perfusato dalla porta del campione ogni ora e congelarli in azoto liquido per ulteriori analisi.
   NOTA: Inoltre, eseguiamo una manovra di reclutamento (fino a 20 cmH₂O) 5 minuti prima della valutazione, dopodiché assumiamo perfusati per le analisi dei gas ematici per misurare pH, PCO₂, PO₂, elettroliti, glucosio e lattato.
3. Fermare la perfusione e bloccare la trachea per mantenere i polmoni in uno stato gonfio. Successivamente, isolare i campioni polmonari e congelarli in azoto liquido o metterli in soluzioni di fissaggio per ulteriori studi.
   NOTA: Qui, i polmoni sono stati perfusi per 4 ore.

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Risultati

Tutti i polmoni con CIT compresa tra 20 minuti e 18 ore possono essere perfusi per 4 ore (Figura 2)¹³. La compliance è risultata stabile nella maggior parte dei gruppi, ad eccezione della CIT a 18 ore, che è diminuita gradualmente nel periodo di perfusione di 4 ore (Figura 2A). Nonostante ciò, per i gruppi non sono state osservate differenze significative nella resistenza vascolare, nell'ossigenazione ...

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Discussione

Questo studio ha descritto i passaggi necessari per stabilire un protocollo EVLP per ratti. Qui, dimostriamo che i polmoni del donatore possono essere perfusi per 4 ore dopo la conservazione statica a freddo fino a 18 ore a 4 °C. Ciò è stato dimostrato valutando la compliance polmonare, la resistenza vascolare polmonare, la concentrazione di glucosio/lattato nel perfusato e il rapporto P/F.

L'ascesa della piattaforma EVLP come strumento importante nella va...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G intravenous catheter	BD	381167	Orotracheal intubation
16 G intravenous catheter	BD	381157	Catheter to flush the lung
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Tracheal tube fixation
3-0 Suture Sofsilk	Covidien	S303	Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for Rat	Harvard Apparatus	734276	Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula	Harvard Apparatus	73-0711
Left Atrial Cannula	Harvard Apparatus	73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)	XVIVO	19811	Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)	Harvard Apparatus	55-0000
Sodium heparin	Leo Pharma	453811
Steen Solution	XVIVO	19004	Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curv	Mizuho	07-940-86	Tracheal clamp
Tracheal Cannula	Harvard Apparatus	73-3384
Xylazine (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedation/anesthesia