Создание модели перфузии легких ex vivo на крысах для трансляционного анализа трансплантации легких

Резюме

В этой статье мы описываем необходимые шаги для создания модели ЭВЛП крысы и показываем воспалительный профиль, связанный с перфузией легких. Цель состоит в том, чтобы распространить знания и опыт о модели EVLP крысы, что позволит получить целостное представление о биологических реакциях, связанных с этой революционной техникой.

Аннотация

С тех пор, как трансплантация легких стала терапевтической стратегией при прогрессирующих заболеваниях легких, научное сообщество столкнулось с проблемой низкого количества легких, считающихся пригодными для процесса донорства. Однако в последние десятилетия этот сценарий был положительно изменен, учитывая развитие перфузии легких ex vivo (EVLP) в качестве стратегии оценки и восстановления маргинальных легких. Внедрение ЭВЛП в крупных центрах трансплантации способствовало увеличению числа трансплантаций легких, как за счет повышения диагностической точности функции легких, так и за счет создания эффективной платформы для восстановления легочных трансплантатов. В этом контексте, столкнувшись с этическими и логистическими проблемами, а также при изучении иммунологических факторов, связанных с трансплантацией легких, разработка моделей EVLP грызунов приобрела важное значение, учитывая их надежность, возможность генетических манипуляций и более низкие затраты. В данной статье описан протокол создания модели ЭВЛП крысы и показан воспалительный профиль, связанный с перфузией легких. Это поможет распространить знания о модели ЭВЛП у крыс, способствуя нашему пониманию биологических реакций, связанных с этой революционной техникой.

Введение

Трансплантация легких была признана терапевтической стратегией при терминальных стадиях заболеваний с улучшением хирургических методов и иммуносупрессии в течение последних десятилетий. Несмотря на высокий спрос, количество приемлемых умерших доноров легких ниже, чем для других солидных органов, сходясь к меньшему количеству выполненных трансплантаций легких ^1,2,3. Чтобы решить проблему нехватки донорского пула, медицинское сообщество расширило критерии донорства легких, превратив органы, которые ранее считались нежизнеспособными, в потенциальные органы для трансплантации. Тем не менее, расширенные критерии требуют различных усилий для лучшего понимания и вмешательства с учетом возможных системных последствий, связанных с донорским органом. Перфузия легких ex vivo (ЭВЛП) возникла как метод, обеспечивающий нормотермическое сохранение легких, оценку функций легких и восстановление легких, которые ранее считались нецелесообразными для процесса донорства ^4,5,6.

Учитывая растущее число трансплантаций легких с момента создания ЭВЛП в крупных центрах трансплантации, стратегии сохранения и восстановления легких все чаще исследуются. В этом смысле, столкнувшись с этическими и логистическими проблемами, а также при изучении иммунологических факторов, связанных с трансплантацией легких, разработка моделей EVLP грызунов стала важной, учитывая их надежность, возможность генетических манипуляций и более^{низкие затраты.} Здесь мы описываем необходимые шаги для создания модели EVLP крысы и показываем воспалительный профиль, связанный с перфузией легких.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Протоколом использования животных, утвержденным Комитетом по уходу за животными в Университетской сети здравоохранения. Самцы крыс породы Льюис (255-330 г) получали доступ к пище и воде ad libitum . Затем их поддерживали в контролируемой среде (18-22 °C) с 12-часовым циклом день-ночь. Подробные сведения обо всех материалах, решениях и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Инициализация системы перфузии легких ex vivo

1. Убедитесь, что все датчики подключены к оборудованию для изолированного перфузионного органа и системе сбора данных (рис. 1). Затем откройте программное обеспечение для сбора данных.
2. Перед перфузией заполните контур ЭВЛП 150 мл раствора Стина с добавлением 1000 единиц USP гепарина натрия, 50 мг цефазолина и 50 мг метилпреднизолона.
3. Установите теплую водяную баню на 20 °C. Запустите циркуляцию теплой воды, чтобы прогреть всю систему EVLP.

2. Процедура заготовки донорского легкого

1. Обезболивают крысу внутрибрюшинной инъекцией кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) или в соответствии с местной практикой. Подтвердите надлежащую глубину анестезии, проверив рефлекс защемления пальца ноги.
2. Провести оротрахеальную интубацию (внутривенный катетер 14 G). После интубации подключите трахеальную трубку к системе вентиляции для мелких животных. Проветрите крысу с дыхательным объемом 10 мл/кг, скоростью 60 вдохов/мин, фракцией кислорода на вдыхаемом воздухе (_FiO2) 0,5 и положительным давлением на конечном выдохе (PEEP) 2 смЧ₂О.
3. Поместите крысу в положение лежа на спине.
4. С помощью соответствующих ножниц и щипцов ввести в брюшную полость и провести разрез краниально, выполнив срединную лапаротомию и введя в воротную вену гепарин натрия (400 единиц USP).
5. Впоследствии попадают в грудную полость через ксифоидный отросток. Проводят стернотомию с черепной резекцией грудины и осторожным радиальным вскрытием диафрагмы, чтобы не повредить легкое.
6. Чтобы извлечь блокаду сердца и легких, сделайте разрез в нижней полой вене (НПВ) и вдоль верхушки левого отдела сердца.
7. С помощью микроножниц выполните передний разрез в выходном тракте правого желудочка. Затем введите внутривенный катетер 18 г в легочный ствол и промойте легкие 20 мл раствора декстрана калия (LPD), содержащего 10 мкг/мл простагландина E1.
8. Сразу после промывания зажмите нижнюю треть трахеи в конце вдоха, чтобы сохранить легкие в надутом состоянии.
9. Соберите блок сердца и легких и поместите его в раствор LPD для хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Легочный трансплантат может храниться при различных температурах и различных интервалах времени в зависимости от цели исследования. Здесь мы показываем репрезентативные результаты исследований легких, которые подвергались различной продолжительности времени холодной ишемии (CIT) на льду.

3. Процедура перфузии легких ex vivo

1. Поместите шелковую лигатуру 0 под главную легочную артерию (ПА) и вокруг желудочков и предварительно заложите для облегчения канюляции.
2. Подключите канюлю PA к входной линии системы EVLP и запустите перистальтический насос с потоком 10% от потока технического обслуживания, что позволит удалить воздух из канюли PA.
3. Поместите и закрепите входную канюлю в главном ПА (внешний диаметр: 2,0 мм / диаметр головки: 2,5 мм), а затем дренажную канюлю из верхушки сердца в левое предсердие (диаметр головки LA: 4,0 мм) через митральный клапан для последующей перфузии. Используйте щипцы для расширения митрального клапана, облегчая канюляцию.
4. Сделайте небольшое отверстие в трахее и вставьте канюлю трахеи (внешний диаметр: 2,0 мм/л: 14 мм). Затем подключите его к вентиляционной линии системы.
5. Подключите канюлю LA к выходной линии системы.
6. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы устанавливаем 10% поддерживающего потока в качестве начала перфузии. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в легкие, убедитесь, что ловушка для пузырьков заполнена.
7. Постепенно увеличивайте скорость кровотока перфузией до достижения 20% от сердечного выброса (CO).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для перфузии обоих легких мы использовали расчетный CO 75 мл/мин для крыс с массой 250 г^10,11. Скорость перфузии постепенно увеличивалась до 1 ч для достижения целевой скорости потока в соответствии с нашим клиническим протоколом EVLP¹². Параметры перфузии сведены в таблицу 1¹³.
8. Через 20 мин после начала перфузии снимите трахеальный зажим и начните вентиляцию легких, а затем запустите поток газа EVLP (8% CO₂, 6% O₂, 86% N₂) для поддержания притока перфузата PCO₂ в диапазоне от 35 до 45 мм рт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры вентиляции сведены в таблицу 1¹³.

4. Управление параметрами и образцами

1. Каждый час во время ЭВЛП записывайте в режиме реального времени динамическую податливость легких и легочное сосудистое сопротивление (ПВР).
   ПРИМЕЧАНИЕ: За 5 минут до физиологической оценки легкие должны быть расширены до давления надувания.
2. Отбирайте пробы перфузата из порта для отбора проб каждый час и замораживайте в жидком азоте для дальнейших анализов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, за 5 минут до оценки мы выполняем маневр набора персонала (до 20 смЧ₂О), после чего берем перфузаты для анализа газов крови для измерения pH, PCO₂, PO₂, электролитов, глюкозы и лактата.
3. Остановите перфузию и зажмите трахею, чтобы поддерживать легкие в надутом состоянии. Впоследствии изолируют образцы легких и мгновенно замораживают их в жидком азоте или помещают в фиксирующие растворы для дальнейших исследований.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь легкие были перфузированы в течение 4 часов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Все легкие с ЦИТ в период от 20 мин до 18 ч могут быть перфузированы в течение 4 ч (Рисунок 2)¹³. Комплаентность была стабильной в большинстве групп, за исключением 18-часовой CIT, которая постепенно снижалась в течение 4-часового периода перфузии (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании описаны необходимые шаги для создания протокола ЭВЛП крыс. Здесь мы показываем, что донорские легкие могут быть перфузированы в течение 4 ч после сохранения холодного статического электричества до 18 ч при 4 °C. Это было продемонстрировано путем оце...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G intravenous catheter	BD	381167	Orotracheal intubation
16 G intravenous catheter	BD	381157	Catheter to flush the lung
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Tracheal tube fixation
3-0 Suture Sofsilk	Covidien	S303	Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for Rat	Harvard Apparatus	734276	Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula	Harvard Apparatus	73-0711
Left Atrial Cannula	Harvard Apparatus	73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)	XVIVO	19811	Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)	Harvard Apparatus	55-0000
Sodium heparin	Leo Pharma	453811
Steen Solution	XVIVO	19004	Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curv	Mizuho	07-940-86	Tracheal clamp
Tracheal Cannula	Harvard Apparatus	73-3384
Xylazine (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedation/anesthesia