肺移植におけるトランスレーショナルインサイトのための ex vivo 肺灌流ラットモデルの確立

要約

ここでは、ラットEVLPモデルを確立するために必要な手順を説明し、灌流された肺に関連する炎症プロファイルを示します。その目的は、ラットEVLPモデルに関する知識と経験を広め、その革新的な技術に関連する生物学的応答の統合的な理解を可能にすることです。

要約

進行性肺疾患の治療戦略として肺移植が確立されて以来、科学界は、提供プロセスで実行可能と考えられる肺の数が少ないという問題に直面しています。しかし、ここ数十年で、辺縁肺の評価と再調整の戦略として ex vivo 肺灌流(EVLP)が開発されたため、このシナリオは前向きに変化しています。大規模な移植センターでのEVLPの設立は、肺機能の診断精度を向上させるとともに、肺移植片のリコンディショニングのための効果的なプラットフォームを構成することにより、肺移植の数の増加を支持しています。このような状況では、倫理的および物流上の問題に直面しているだけでなく、肺移植に関連する免疫学的要因の研究においても、その信頼性、遺伝子操作の可能性、および低コストを考えると、げっ歯類のEVLPモデルの開発が重要になっています。この論文では、ラットEVLPモデルを確立するためのプロトコルについて説明し、灌流された肺に関連する炎症プロファイルを示します。これにより、ラットEVLPモデルに関する知識が広まり、その革新的な技術に関連する生物学的応答の理解が促進されます。

概要

肺移植は、過去数十年の間に外科的方法と免疫抑制の改善により、末期疾患の治療戦略として認識されてきました。高い需要にもかかわらず、許容される死亡した肺ドナーの数は他の固形臓器よりも少なく、実施された肺移植の数が少ないことに収束しています ^1,2,3。ドナープールの不足に対処するために、医学界は肺提供の基準を拡大し、以前は生存不可能と考えられていた臓器を移植の可能性のある臓器に変えました。ただし、拡張された基準では、提供された臓器から発生する可能性のある全身への影響を考慮して、理解を深め、介入するためにさまざまな努力が必要です。ex vivo 肺灌流(EVLP)は、これまで提供プロセスで実現不可能と考えられていた肺の常温保存、肺機能の評価、および肺の再調整を提供する技術として登場しました^4,5,6。

大規模な移植センターにEVLPが設立されて以来、肺移植の数が増加していることから、肺の保存と修復の戦略がますます研究されてきました。この意味で、倫理的および物流上の問題に直面し、肺移植に関連する免疫学的要因の研究においても、げっ歯類のEVLPモデルの開発は、その信頼性、遺伝子操作の可能性、および低コストを考えると重要になっています^7,8,9。ここでは、ラットEVLPモデルを確立し、灌流された肺に関連する炎症プロファイルを示すために必要な手順について説明します。

プロトコル

動物実験は、University Health NetworkのAnimal Care Committeeによって承認された動物使用プロトコルに準拠して実施されました。雄のルイスラット(255-330g)に、餌と水 を自由に摂取させ ました。その後、制御された環境(18-22°C)で12時間の昼夜サイクルで維持されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、溶液、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. ex vivo 肺灌流システムの初期化

1. すべてのトランスデューサーが分離された灌流臓器装置とデータ収集システムに接続されていることを確認します(図1)。次に、データ集録ソフトウェアを開きます。
2. 灌流の前に、1,000 USPユニットのヘパリンナトリウム、50 mgのセファゾリン、および50 mgのメチルプレドニゾロンを補充した150 mLのSteen溶液をEVLP回路に充填します。.
3. 温水浴を20°Cに設定します。 温水の循環を開始して、EVLPシステム全体をウォームアップします。

2. ドナー肺調達手続き

1. ケタミン(50 mg / kg)とキシラジン(5 mg / kg)の腹腔内注射でラットを麻酔するか、地元の慣行に従って麻酔します。.つま先のつま先つまみ反射をチェックして、適切な麻酔の深さを確認します。
2. 口腔気管挿管(14 G静脈カテーテル)を行います。挿管後、気管チューブを小動物換気システムに接続します。一回換気量 10 mL/kg、呼吸回数 60 回/分、吸気酸素分画 (FiO₂) 0.5、呼気終末陽圧 (PEEP) 2 cmH₂O でラットを換気します。
3. ラットを仰臥位に置きます。
4. 適切なはさみと鉗子の助けを借りて、腹腔に入り、切開部を頭蓋骨に運び、中央開腹術を行い、門脈にヘパリンナトリウム(400 USP単位)を注入します。
5. その後、キシポイド突起を通じて胸腔に入ります。肺を損傷しないように、胸骨の頭蓋切除術と横隔膜の慎重な放射状開口部で胸骨切開術を行います。
6. 心臓と肺のブロックを回収するには、下大静脈(IVC)と左心臓の頂点に沿って切開します。
7. マイクロハサミを使用して、右心室流出路の前方切開を行います。次に、18 Gの静脈内カテーテルを肺幹に挿入し、10 μg / mLのプロスタグランジンE1を含む20 mLの低カリウムデキストラン(LPD)溶液で肺を洗い流します。.
8. フラッシングの直後に、気管の下3分の1を吸気の最後にクランプして、肺を膨らませた状態に保ちます。
9. 心臓と肺のブロックを採取し、LPD溶液に入れて保管します。
   注:肺移植片は、研究目的に応じて温度と異なる時間間隔で保存することができます。ここでは、氷上でさまざまな長さの低温虚血時間(CIT)を受けた肺の代表的な結果を示します。

3. Ex vivo 肺灌流法

1. 0シルク結紮糸を主肺動脈(PA)の下と心室の周りに置き、カニューレ挿入を容易にするためにプリタイドします。
2. EVLPシステムの流入ラインにPAカニューレを接続し、メンテナンスフローの10%でペリスタルティックポンプを始動し、PAカニューレ内の任意の空気を除去できるようにします。
3. 流入カニューレをメインPAに配置して固定します(外径:2.0 mm/ヘッド径:2.5 mm)、続いて心臓の頂点からドレナージカニューレを僧帽弁を介して左心房(LA-ヘッド径:4.0 mm)に送り込み、その後の灌流を行います。.鉗子を使用して僧帽弁を拡張し、カニューレ挿入を促進します。
4. 気管に小さな穴を開け、気管カニューレ(外径:2.0mm/L:14mm)を挿入します。次に、システムの換気ラインに接続します。
5. LAカニューレをシステムの流出ラインに接続します。
6. 注:メンテナンスフローの10%を灌流の開始として設定しました。肺に気泡が挿入されるのを防ぐために、バブルトラップが満たされていることを確認してください。
7. 流量灌流を徐々に増やして、心拍出量(CO)の20%に達します。
   注:両方の肺を灌流するために、250gラット^10,11に対して推定75mL /分のCOを使用しました。灌流の流速は、私たちの臨床EVLPプロトコル¹²に従って目標流量に到達するために、徐々に1時間まで増加しました。灌流パラメータを表1¹³にまとめます。
8. 灌流の開始から20分後に気管クランプを取り外し、肺換気を開始し、続いてEVLPガス(8%CO₂、6%O₂、86%N₂)の流れを開始して、流入灌流物PCO₂ を35〜45mmHgに維持します。
   注意: 換気パラメータは、 表1¹³にまとめられています。

4. パラメータとサンプル管理

1. EVLP期間中は、1時間ごとに、動的な肺コンプライアンスと肺血管抵抗(PVR)をリアルタイムで記録します。
   注:生理学的評価の5分前に、肺を膨張圧力まで拡張する必要があります。
2. サンプルポートから灌流液サンプルを1時間ごとに採取し、液体窒素で急速凍結してさらに分析します。
   注:さらに、評価の5分前にリクルートマニューバ(最大20 cmH₂O)を行い、その後、血液ガス分析用の灌流剤を採取して、pH、PCO₂、PO₂、電解質、グルコース、および乳酸を測定します。
3. 灌流を停止し、気管をクランプして、肺を膨らませた状態に保ちます。その後、肺サンプルを分離し、液体窒素で瞬間凍結するか、さらなる研究のために固定溶液に入れます。
   注:ここでは、肺を4時間灌流しました。

結果

CITが20分から18時間の範囲であるすべての肺は、4時間灌流することができました(図2)¹³。コンプライアンスは、18時間CITを除いてほとんどのグループで安定しており、4時間灌流期間中に徐々に減少しました(図2A)。それにもかかわらず、血管抵抗、肺移植片の酸素化、およびグルコースレベルに有意差は観?...

ディスカッション

この研究では、ラットEVLPプロトコルを確立するために必要な手順について説明しました。ここでは、ドナーの肺を4°Cで最大18時間の低温静的保存後、4時間灌流できることを示しています。 これは、肺のコンプライアンス、肺血管抵抗、灌流液のグルコース/乳酸濃度、およびP / F比を評価することによって実証されました。

EVLPプラットフォーム...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G intravenous catheter	BD	381167	Orotracheal intubation
16 G intravenous catheter	BD	381157	Catheter to flush the lung
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Tracheal tube fixation
3-0 Suture Sofsilk	Covidien	S303	Fixation of arterial and atrial cannulas
IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System for Rat	Harvard Apparatus	734276	Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) system
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedation/anesthesia
Large Pulmonary Artery Cannula	Harvard Apparatus	73-0711
Left Atrial Cannula	Harvard Apparatus	73-0712
Low potassium dextran glucose solution (Perfadex)	XVIVO	19811	Preservation solution
Methylprednisolone sodium succinate (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Anti-inflammatory
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Small Animal Ventilator (Model 683)	Harvard Apparatus	55-0000
Sodium heparin	Leo Pharma	453811
Steen Solution	XVIVO	19004	Buffered extracellular solution to perfuse lungs during EVLP
Sugita Aneur clip curv	Mizuho	07-940-86	Tracheal clamp
Tracheal Cannula	Harvard Apparatus	73-3384
Xylazine (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedation/anesthesia