Investigación Aplicación de la onda de choque inducida por láser para el estudio de la lesión coclear inducida por explosión

Resumen

Aquí, describimos los protocolos experimentales para crear un modelo animal de lesión coclear inducida por blastos utilizando ondas de choque inducidas por láser (LISW). La exposición del hueso temporal a LISW permite la reproducción de la fisiopatología coclear inducida por blastos. Este modelo animal podría ser una plataforma para dilucidar la patología coclear y explorar posibles tratamientos para las lesiones por blastos.

Resumen

El oído es el órgano más susceptible a la sobrepresión de la explosión, y las lesiones cocleares ocurren con frecuencia después de la exposición a la explosión. La exposición a explosiones puede provocar pérdida auditiva neurosensorial (SNHL), que es una pérdida auditiva irreversible que afecta negativamente a la calidad de vida. Se han documentado previamente patologías cocleares detalladas inducidas por blastos, como la pérdida de células ciliadas, neuronas ganglionares espirales, sinapsis cocleares y alteración de los estereocilios. Sin embargo, determinar el deterioro neurosensorial de la cóclea después de una lesión por explosión es un desafío porque los animales expuestos a la sobrepresión por explosión generalmente experimentan perforación de la membrana timpánica (TMP), que causa pérdida auditiva conductiva concurrente. Para evaluar la disfunción coclear neurosensorial pura, desarrollamos un modelo animal experimental de lesión coclear inducida por blastos utilizando una onda de choque inducida por láser. Este método evita la TMP y las lesiones sistémicas concomitantes y reproduce la disminución funcional del componente SNHL de una manera dependiente de la energía después de la exposición a LISW. Este modelo animal podría ser una plataforma para dilucidar los mecanismos patológicos y explorar posibles tratamientos para la disfunción coclear inducida por blastos.

Introducción

La pérdida de audición y el tinnitus se encuentran entre las discapacidades más prevalentes, reportadas en hasta el 62% de los veteranos^. Se han notificado varias complicaciones auditivas inducidas por blastos, como la pérdida auditiva neurosensorial (SNHL) y la perforación de la membrana timpánica (TMP), en individuos expuestos a la sobrepresión blástica². Además, la investigación en individuos expuestos a blastos sugiere que la exposición a blastos con frecuencia resulta en defectos en la resolución temporal auditiva, incluso cuando los umbrales de audición están dentro del rango normal, lo que se conoce como "pérdida auditiva oculta (HHL)"³. Está bien establecido que hay una pérdida sustancial de sinapsis cocleares entre las células ciliadas internas (IHC) y las neuronas auditivas (AN) en la patología coclear relacionada con blastos⁴. La degeneración sináptica da lugar a un deterioro del procesamiento auditivo y es un factor importante que contribuye al desarrollo de HHL⁵. Por lo tanto, los órganos auditivos son componentes frágiles que contienen estructuras complejas y altamente organizadas. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cual las ondas expansivas afectan al oído interno a nivel celular sigue sin estar claro. Esto se debe a los desafíos para replicar las complejidades clínicas y mecánicas precisas de las lesiones por blastos en entornos de laboratorio y la complejidad de las patologías cocleares inducidas por blastos.

El componente principal de una lesión por explosión es la onda de choque (SW), caracterizada por un aumento rápido y alto de la presión máxima⁶. La complejidad de las lesiones por explosiones ha sido ampliamente investigada en numerosos estudios retrospectivos ^7,8,9. Existen varios dispositivos para la generación de voladuras, como el gas comprimido¹⁰, los tubos de choque¹¹ y los explosivos de pequeña magnitud¹², a diferentes niveles de presión. La forma de onda de presión del SW generada por los dispositivos recientemente desarrollados se parecía mucho a la de una explosión real. Un concepto importante en el establecimiento de un modelo animal de pérdida auditiva neurosensorial inducida por blastos es minimizar las lesiones concomitantes, aparte del daño auditivo, para reducir la muerte de los animales. Por lo tanto, se han desarrollado estudios de lesiones por explosión en los que se han miniaturizado los tubos de choque y la salida se puede controlar con precisión para que los animales expuestos rara vez mueran. Sin embargo, aunque estos modelos animales suelen desarrollar complicaciones, como la TMP, la evaluación de la función coclear es difícil debido a la hipoacusia conductiva concurrente². Anteriormente realizamos un estudio en animales con protección auditiva sobre lesiones por explosiones utilizando tapones para los oídos y no encontramos incidencia de TMP¹³. Los tapones para los oídos podrían atenuar parcialmente el daño coclear severo, pero no la neurodegeneración auditiva central o el desarrollo de tinnitus. Por lo tanto, los tapones para los oídos protegen la cóclea y la membrana timpánica. Sin embargo, se requiere un modelo animal de daño coclear puro inducido por blastos sin TMP para estudiar la fisiopatología coclear causada por lesiones por blastos.

Previamente desarrollamos un modelo de lesión por explosión tópica del oído interno en ratas y ratones utilizando una onda de choque inducida por láser (LISW)^14,15. Este método puede realizarse de forma segura y sencilla a nivel de laboratorio estándar y se ha utilizado para generar modelos de lesiones pulmonares y craneales por blastos^16,17. La energía del LISW se puede ajustar cambiando el tipo y la potencia del láser, lo que permite controlar el grado de daño coclear. El modelo de lesión coclear inducida por LISW es valioso para estudiar los mecanismos de la SNHL causada por lesiones por blastos e investigar posibles tratamientos. En este estudio, describimos protocolos experimentales detallados para crear un modelo de ratón de daño coclear inducido por blastos utilizando LISW y demostramos la degeneración coclear, incluida la pérdida de células ciliadas (HC), sinapsis cocleares y neuronas ganglionares espirales (SGN), de una manera dependiente de la energía en ratones después de la exposición a LISW.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Defensa Nacional (aprobación # 18050) y se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Se hizo todo lo posible para minimizar el número de animales y su sufrimiento.

1. Animales

1. Utilice ratones machos CBA/J de 8 semanas de edad para seguir este protocolo. Antes del experimento, someta a los ratones a una prueba de función auditiva y a una observación endoscópica de la membrana timpánica para garantizar la normalidad.
2. Divida 27 ratones CBA/J en tres grupos: (1) grupo expuesto a 2,0 J/^cm2 (n = 9 ratones); (2) grupo expuesto a 2,25 J/^cm2 (n = 9 ratones); y (3) grupo expuesto de 2,5 J/^cm2 (n = 9 ratones). Retire todas las orejas para su evaluación 1 mes después de la exposición a LISW.

2. Entornos experimentales de exposición a LISW

1. El objetivo láser es un disco de caucho natural negro, de 10 mm de diámetro y 0,5 mm de grosor. Para aumentar el impulso de LISW, utilice un adhesivo de soldadura de resina acrílica para unir una lámina de tereftalato de polietileno (PET) transparente de 1,0 mm de espesor en la parte superior del área objetivo. Irradie un láser Nd:YAG Q-switched de 532 nm para generar el LISW detrás del objetivo (Figura 1A).
2. Enfoque el pulso láser con una lente plano-convexa a un punto de 3,0 mm de diámetro en el objetivo láser.
3. Utilice la irradiación LISW para generar plasma en la superficie de unión de los dos materiales y vaporizar el caucho (ablación mediada por plasma), dejando el caucho vaporizado en la cavidad.
4. Utilice un hidrófono para medir la onda de presión de LISW a 1,0 mm bajo el agua, no en tejido vivo. Coloque un hidrófono de fibra óptica de 0,25 mm de diámetro debajo de la goma negra a 1,0 mm por debajo de la superficie del agua para registrar las formas de onda de presión LISW y medirlas con un osciloscopio digital.
   NOTA: Las formas de onda de presión mostraron características estables con presión e impulso máximos similares a los que se muestran en la Figura 1B.
5. Realizar todos los procedimientos con animales bajo anestesia general utilizando inyecciones intraperitoneales de 1 mg/kg de clorhidrato de medetomidina y 75 mg/kg de ketamina. Aplique una pomada oftálmica en ambos ojos del ratón para evitar que se seque y proporcionar soporte de calor.
6. Afeita con cuidado las regiones postauriculares para evitar retener el aire atrapado en el pelaje. Fije los ratones en una placa y coloque las regiones postauriculares en el área focal del LISW en una dirección vertical hacia arriba.
7. Coloque un objetivo de goma negra percutáneamente en la región postauricular de la oreja del ratón. Para garantizar la adaptación de la impedancia acústica, utilice un gel conductor de ultrasonidos entre el objetivo láser y la superficie de la piel.
8. Aplique un solo pulso de LISW a la cóclea a través del hueso temporal. Ajuste las salidas de los pulsos láser a tres densidades de energía: 2,0 J/^cm2 , 2,25 J/^cm2 y 2,5 J/^cm2.

3. Prueba de función coclear

NOTA: Las pruebas de respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) se realizaron como se informó anteriormente^14,15.

1. Realice la medición de ABR 1 día antes y 1 día y 1 mes después de la exposición a LISW.
2. ABR es un potencial evocado auditivo en respuesta a estímulos auditivos y se usa comúnmente para evaluar umbrales de audición en cuatro frecuencias (12.0 kHz, 16.0 kHz, 20.0 kHz y 24.0 kHz).
3. Presente el sonido de estimulación a través de un auricular pequeño y mida el nivel de presión sonora cerca de la membrana timpánica del ratón utilizando un pequeño micrófono colocado cerca del auricular. Emita estímulos de ráfaga de un generador de sonido a 37 ciclos/s y amplifique la presión sonora desde un nivel de presión sonora (SPL) de 20 dB hasta 80 dB SPL en pasos de 5 dB SPL.
4. Inserte un electrodo de aguja de acero inoxidable para el registro del electroencefalograma debajo del canal auditivo y la región frontal de la oreja e inserte un electrodo de tierra debajo de la región caudal de la cola.
5. Evalúe las funciones cocleares midiendo la amplitud del pico ABR I (P1). Analice automáticamente las formas de onda ABR con respecto a los umbrales de audición y la amplitud ABR P1 utilizando el software de análisis de picos ABR como se informó anteriormente¹⁸.
6. Calcule los cambios del umbral ABR restando los umbrales obtenidos antes de la exposición. Comparar los cambios del umbral ABR en los tres grupos expuestos con los de los oídos contralaterales no expuestos (control). Mida las amplitudes de ABR utilizando la forma de onda de ABR durante la estimulación de SPL de 80 dB.

4. Valoración histológica

NOTA: La evaluación histológica se realizó como se describió anteriormente^14,15.

1. HC y sinapsis coclear
   1. Realizar el examen anatomopatológico de la cóclea 1 mes después de la exposición a LISW.
   2. Confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies antes de la perfusión. Después de la hemoperfusión con solución de Ringer lactato, realizar perfusión transcardíaca con 1 mL/g de paraformaldehído (PFA) al 4%. Después de la decapitación, extraer la cóclea y perfundirla directamente con PFA al 4%, seguido de la fijación a 4 °C durante la noche.
   3. Después de la fijación, descalcifique la cóclea agitándola en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mol/L durante 2 días.
   4. Divide la cóclea desmineralizada en cuatro trozos. Después de congelar cada pieza de cóclea en hielo seco durante 10 min, realice el bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h en suero de caballo normal al 5% simplemente conjugado con Triton X al 0,3% para la permeabilización.
   5. Utilice anticuerpos anti-miosina 7a (Myo7A), anti-proteína de unión a C-terminal (CtBP2) y anti-neurofilamentos (NF) como anticuerpos primarios e incubados a 37 °C durante la noche. Utilice los anticuerpos Myo7A, CtBP2 y NF para evaluar las HC, las cintas presinápticas y las fibras nerviosas cocleares, respectivamente.
   6. Lave el anticuerpo primario no unido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 x 3 min. Incubar las muestras con los anticuerpos secundarios adecuados a 37 °C durante 2 h. Después de la tinción, lave las muestras durante 3 x 5 minutos con PBS y encapsule las muestras en el vidrio del portaobjetos con un encapsulante soluble en agua con un cubreobjetos.
   7. Para la evaluación, adquiera la imagen completa de la cóclea (dividida en cuatro partes) con un aumento de 10x y calcule el mapa de frecuencia coclear utilizando el complemento de software ImageJ al que se hace referencia para localizar con precisión las regiones cocleares específicas a una frecuencia de 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz y 24,0 kHz.
   8. Calcular las tasas de supervivencia de la HC y el número de sinapsis en cada frecuencia.
      1. Para calcular las tasas de supervivencia de los HC, cuente el número de HC supervivientes y faltantes por cada 200 μm de longitud en cada frecuencia, y calcule la tasa de supervivencia de los HC utilizando la ecuación (1) que se muestra a continuación:
         Tasa de supervivencia de HC (%) = (Número de HC supervivientes / Número de HC supervivientes y faltantes) × 100 (1)
      2. Para calcular el número de sinapsis, obtenga imágenes de alta resolución de la pila z del área HC interna utilizando una lente objetivo de inmersión en aceite (63×) con un zoom digital de 3,1x y un tamaño de paso de 0,25 μm bajo microscopía de fluorescencia confocal. Importe las pilas de imágenes a ImageJ y cuente automáticamente los puntos de CtBP2 por IHC dentro de un rango de 50 μm en cada pila de imágenes. Calcule la tasa de supervivencia de las cintas sinápticas usando la ecuación (2):
         Tasa de supervivencia de las cintas sinápticas (%) = (Número de cintas sinápticas en los oídos expuestos a LISW / Número de cintas sinápticas en los oídos control) × 100 (2)
   9. Para la microscopía electrónica de barrido (SEM), extraiga la cóclea, como se ha descrito anteriormente, y luego fíjela con PFA al 2% y glutaraldehído al 2,5% juntos a 4 °C durante la noche. Después de la descalcificación de la cóclea agitándola en una solución de EDTA 0,5 mol/L a 4 °C durante 7 días, diseccione la cóclea en cuatro piezas para prepararla en todo el montaje.
   10. Fijar los tejidos con tetróxido de osmio al 1% a 4 °C durante 30 min, deshidratar en etanol al 50% a temperatura ambiente durante 10 min, repetir con etanol al 70 %, 80 %, 95 % y luego al 100 %, pulverizar el recubrimiento con osmio y examinar bajo un microscopio electrónico a 5,0 kV, como se informó anteriormente¹⁴.
   11. Realizar un análisis cuantitativo de la disrupción del haz estereociliar en las células ciliadas externas (OHC) calculando la relación de estereocilios alterados (número de estereocilios OHC interrumpidos/número total de estereocilios OHC) en cada grupo de energía utilizando las imágenes SEM¹⁴. Cuente el número de estereocilios por 100 μm en el centro de las regiones de 16,0 y 24,0 kHz. Designe una o más filas de haces de OHC que están doblados hacia el lado lateral, enredados o sin su base como interrumpidos.
2. SGNs
   1. Para evaluar cuantitativamente el número de SGNs 1 mes después de la exposición a LISW, realizar perfusión transcardíaca con PBS al 4%, decapitar, extraer la cóclea y realizar la fijación posterior en las mismas condiciones descritas anteriormente. Descalcificar la cóclea en 0,5 M EDTA durante 1 semana.
   2. Después de la descalcificación, sumergir las cócleas en sacarosa al 30% durante la noche, incrustarlas en el compuesto crioseccionante, congelar en nitrógeno líquido para preparar secciones cerca del canal de Rosenthal con un espesor de 15 μm, teñir con hematoxilina y eosina, y observarlas bajo un microscopio óptico¹⁴.
   3. Para la medición de la densidad de SGN, cuente el número de SGN en la curva central del canal de Rosenthal y calcule la supervivencia de SGN por control.

5. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando el software de su elección.
2. Analice las diferencias estadísticas en el desplazamiento del umbral de ABR, HC, SGN y los recuentos sinápticos utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías ["frecuencia o partes cocleares (apicales/medias/base)" × "grupos de animales"], análisis de varianza de dos vías (ANOVA), seguido de la prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey.
3. Presentar todos los datos como media ± error estándar y establecer el nivel de significación estadística en p < 0,05.

Resultados

Forma de onda LISW
La reproducibilidad de la forma de onda de presión LISW se midió 5x a 2,0 J/^cm2 de la siguiente manera. Las formas de onda fueron generalmente similares y estables y mostraron un fuerte aumento con el ancho de tiempo, la presión máxima y el impulso de 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa y 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediana ± SD), lo que corresponde a las características del SW (Figura 1B). Los LISW se caracterizan ...

Discusión

Este estudio tuvo como objetivo validar un modelo de ratón de daño coclear inducido por blastos utilizando LISW. Nuestros hallazgos demostraron que después de la aplicación de LISW a través del hueso temporal, la oreja de los ratones expuestos exhibió una disminución patológica y fisiológica consistente en la cóclea, que se acompañó de un aumento en la sobrepresión de LISW. Estos resultados indican que este modelo de ratón es apropiado para replicar diversas patologías coc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm Q-switched Nd:YAG laser	Quantel	Brilliant b
ABR peak analysis software	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive	Acrysunday Co., Ltd	N/A
confocal fluorescence microscopy	Leica	TCS SP8
cryosectioning compound	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody	BD Transduction	#612044
Dielectric multilayer mirrors	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO4104B
Earphone	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.	FOPH2000
Image J software plug-in	NIH	measurement line	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A antibody	Proteus Biosciences	#25–6790
Neurofilament antibody	Sigma	#AB5539
Plano-convex lens	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prism software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Scanning electron microscope	JEOL Ltd	JSM-6340F
Small digital endoscope	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultrasonic jelly	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variable attenuator	Showa Optronics Co.	N/A	Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant	Dako	#S1964