Forschungsanwendung der laserinduzierten Stoßwelle zur Untersuchung von blast-induzierten Cochlea-Verletzungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zur Erstellung eines Tiermodells für blasteninduzierte Cochlea-Verletzungen mittels laserinduzierter Stoßwelle (LISW). Die Exposition des Schläfenbeins gegenüber LISW ermöglicht die Reproduktion der Blast-induzierten Cochlea-Pathophysiologie. Dieses Tiermodell könnte eine Plattform für die Aufklärung der Cochlea-Pathologie und die Erforschung möglicher Behandlungen für Explosionsverletzungen sein.

Zusammenfassung

Das Ohr ist das Organ, das am anfälligsten für Explosionsüberdruck ist, und Cochlea-Verletzungen treten häufig nach Explosionsbelastung auf. Eine Explosionsbelastung kann zu Schallempfindungsschwerhörigkeit (SNHL) führen, einem irreversiblen Hörverlust, der sich negativ auf die Lebensqualität auswirkt. Detaillierte Blasten-induzierte Cochlea-Pathologien, wie z. B. der Verlust von Haarzellen, Spiralganglienneuronen, Cochlea-Synapsen und Störungen der Stereozilien, wurden bereits dokumentiert. Die Bestimmung der sensorineuralen Verschlechterung der Cochlea-Cochlea nach einer Explosionsverletzung ist jedoch eine Herausforderung, da Tiere, die einem Explosionsüberdruck ausgesetzt sind, in der Regel eine Trommelfellperforation (TMP) erleiden, die gleichzeitig zu Schallleitungsschwerhörigkeit führt. Um die reine sensorineurale Cochlea-Dysfunktion zu bewerten, haben wir ein experimentelles Tiermodell der blasteninduzierten Cochlea-Schädigung unter Verwendung einer laserinduzierten Stoßwelle entwickelt. Diese Methode vermeidet TMP und begleitende systemische Verletzungen und reproduziert den Funktionsabfall der SNHL-Komponente energieabhängig nach LISW-Exposition. Dieses Tiermodell könnte eine Plattform sein, um die pathologischen Mechanismen aufzuklären und mögliche Behandlungen für die blasteninduzierte Cochlea-Dysfunktion zu erforschen.

Einleitung

Hörverlust und Tinnitus gehören zu den häufigsten Behinderungen, die bei bis zu 62 % der Veteranen gemeldet^{werden 1}. Mehrere durch Explosionen induzierte auditive Komplikationen, einschließlich Schallempfindungsschwerhörigkeit (SNHL) und Trommelfellperforation (TMP), wurden bei Personen berichtet, die einem Explosionsüberdruck ausgesetzt waren². Darüber hinaus deuten Untersuchungen an Personen, die Explosionen ausgesetzt waren, darauf hin, dass die Exposition gegenüber Explosionen häufig zu Defekten in der auditiven zeitlichen Auflösung führt, selbst wenn die Hörschwellen im normalen Bereich liegen, was als "versteckter Hörverlust (HHL)" bezeichnet ^wird3. Es ist allgemein bekannt, dass es bei der blastenbedingten Cochlea-Pathologie zu einem erheblichen Verlust von Cochlea-Synapsen zwischen inneren Haarzellen (IHCs) und auditorischen Neuronen (ANs) kommt⁴. Die synaptische Degeneration führt zu einer Beeinträchtigung der auditiven Verarbeitung und ist ein wichtiger Faktor für die Entwicklung von HHL⁵. Auditorische Organe sind also fragile Komponenten, die komplexe und hochorganisierte Strukturen enthalten. Der genaue Mechanismus, durch den Druckwellen auf zellulärer Ebene auf das Innenohr einwirken, bleibt jedoch unklar. Dies ist auf die Herausforderungen bei der Replikation der präzisen klinischen und mechanischen Feinheiten von Blastenverletzungen in Laborumgebungen und die Komplexität von blasteninduzierten Cochlea-Pathologien zurückzuführen.

Die Hauptkomponente einer Explosionsverletzung ist die Stoßwelle (SW), die durch einen schnellen und hohen Anstieg des Spitzendrucks^{gekennzeichnet ist 6}. Die Komplexität von Explosionsverletzungen wurde in zahlreichen retrospektiven Studien ausführlich untersucht ^7,8,9. Es gibt verschiedene Vorrichtungen zur Explosionserzeugung, wie z. B. Druckgas¹⁰, Stoßrohre¹¹ und Sprengstoffe kleiner Stärke¹², bei unterschiedlichen Druckniveaus. Die von neu entwickelten Geräten erzeugte Druckwellenform der SW ähnelte stark der einer tatsächlichen Explosion. Ein wichtiges Konzept bei der Etablierung eines Tiermodells für explosionsinduzierten Schallempfindungsschwerhörigkeit besteht darin, Begleitverletzungen, abgesehen von Hörschäden, zu minimieren, um den Tod von Tieren zu reduzieren. So wurden Studien zu Explosionsverletzungen entwickelt, bei denen Schockrohre miniaturisiert wurden und die Leistung präzise gesteuert werden kann, so dass exponierte Tiere selten sterben. Obwohl diese Tiermodelle in der Regel Komplikationen wie TMP entwickeln, ist die Beurteilung der Cochlea-Funktion aufgrund des gleichzeitigen Schallleitungsschwerhörverlusts schwierig². Wir haben zuvor eine gehörgeschützte Tierstudie zu Explosionsverletzungen mit Ohrstöpseln durchgeführt und keine Inzidenz von TMP¹³ festgestellt. Die Ohrstöpsel konnten schwere Cochlea-Schäden teilweise abschwächen, nicht aber die zentrale auditorische Neurodegeneration oder die Entwicklung von Tinnitus. So schützen Ohrstöpsel sowohl die Hörschnecken als auch das Trommelfell. Ein Tiermodell für blasteninduzierte reine Cochlea-Schädigung ohne TMP ist jedoch erforderlich, um die Cochlea-Pathophysiologie zu untersuchen, die durch Blastenverletzungen verursacht wird.

Zuvor haben wir ein topisches Blastenverletzungsmodell des Innenohrs bei Ratten und Mäusen mit Hilfe einer laserinduzierten Stoßwelle (LISW) ^{entwickelt14,15}. Diese Methode kann sicher und einfach auf Standardlaborniveau durchgeführt werden und wurde zur Erstellung von Modellen von Lungen- und Kopfexplosionsverletzungen verwendet^16,17. Die Energie des LISW kann durch Ändern des Lasertyps und der Laserleistung angepasst werden, wodurch der Grad der Cochlea-Schädigung kontrolliert werden kann. Das LISW-induzierte Cochlea-Verletzungsmodell ist wertvoll für die Untersuchung der Mechanismen von SNHL, die durch Blastenverletzungen verursacht werden, und für die Untersuchung möglicher Behandlungen. In dieser Studie beschreiben wir detaillierte experimentelle Protokolle zur Erstellung eines Mausmodells für blasteninduzierte Cochlea-Schäden mit LISW und zeigen die Cochlea-Degeneration, einschließlich des Verlusts von Haarzellen (HCs), Cochlea-Synapsen und Spiralganglien-Neuronen (SGNs), in einer energieabhängigen Weise bei Mäusen nach LISW-Exposition.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Defense Medical College (Genehmigung #18050) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie durchgeführt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der Tiere und ihr Leid zu minimieren.

1. Tiere

1. Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche CBA/J-Mäuse, um dieses Protokoll zu befolgen. Vor dem Experiment werden die Mäuse einem Hörfunktionstest und einer endoskopischen Beobachtung des Trommelfells unterzogen, um die Normalität sicherzustellen.
2. 27 CBA/J-Mäuse werden in drei Gruppen eingeteilt: (1) 2,0 J/^{cm 2} exponierte Gruppe (n = 9 Mäuse); (2) 2,25 J/cm² exponierte Gruppe (n = 9 Mäuse); und (3) 2,5 J/cm² exponierte Gruppe (n = 9 Mäuse). Entfernen Sie alle Ohren zur Beurteilung 1 Monat nach der LISW-Exposition.

2. Experimentelle Einstellungen der LISW-Exposition

1. Das Lasertarget ist eine schwarze Scheibe aus Naturkautschuk mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Dicke von 0,5 mm. Um den LISW-Impuls zu erhöhen, wird mit einem Acrylharz-Schweißkleber eine 1,0 mm dicke, transparente Polyethylenterephthalat-Platte (PET) mit der Oberseite des Zielbereichs verklebt. Bestrahlen Sie einen 532 nm gütegeschalteten Nd:YAG-Laser, um das LISW hinter dem Target zu erzeugen (Abbildung 1A).
2. Fokussieren Sie den Laserpuls mit einer plankonvexen Linse auf einen Punkt mit einem Durchmesser von 3,0 mm auf dem Lasertarget.
3. Verwenden Sie die LISW-Bestrahlung, um Plasma an der Bindungsfläche der beiden Materialien zu erzeugen und den Gummi zu verdampfen (plasmavermittelte Ablation), wobei der verdampfte Gummi im Hohlraum verbleibt.
4. Verwenden Sie ein Hydrophon, um die Druckwelle von LISW bei 1,0 mm unter Wasser zu messen, nicht in lebendem Gewebe. Platzieren Sie ein faseroptisches Hydrophon mit einem Durchmesser von 0,25 mm unter dem schwarzen Gummi 1,0 mm unter der Wasseroberfläche, um die LISW-Druckwellenformen aufzuzeichnen und mit einem digitalen Oszilloskop zu messen.
   HINWEIS: Die Druckwellenformen zeigten stabile Eigenschaften mit ähnlichem maximalen Druck und Impuls wie in Abbildung 1B gezeigt.
5. Führen Sie alle tierischen Eingriffe unter Vollnarkose mit intraperitonealen Injektionen von 1 mg/kg Medetomidinhydrochlorid und 75 mg/kg Ketamin durch. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen der Maus auf, um ein Austrocknen zu verhindern und die Wärme zu unterstützen.
6. Rasieren Sie vorsichtig die postaurikulären Regionen, um zu vermeiden, dass die eingeschlossene Luft im Fell zurückbleibt. Fixieren Sie die Mäuse auf einer Platte und positionieren Sie die postaurikulären Regionen im Fokusbereich des LISW vertikal nach oben.
7. Befestigen Sie ein schwarzes Gummitarget perkutan an der postaurikulären Region des Mausohrs. Um eine Anpassung der akustischen Impedanz zu gewährleisten, verwenden Sie ein leitfähiges Ultraschallgel zwischen dem Laserziel und der Hautoberfläche.
8. Wenden Sie einen einzelnen LISW-Impuls über das Schläfenbein an die Cochlea an. Stellen Sie die Ausgänge der Laserpulse auf drei Energiedichten ein: 2,0 J/cm² , 2,25 J/cm² und 2,5 J/cm².

3. Cochlea-Funktionstest

HINWEIS: Die Tests zur auditiven Hirnstammreaktion (ABR) wurden wie zuvor berichtet durchgeführt^14,15.

1. Führen Sie die ABR-Messung 1 Tag vor und 1 Tag und 1 Monat nach der LISW-Exposition durch.
2. ABR ist ein auditiv evoziertes Potential als Reaktion auf auditive Reize und wird häufig zur Beurteilung von Hörschwellen bei vier Frequenzen (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz und 24,0 kHz) verwendet.
3. Präsentieren Sie den Stimulationsklang über einen kleinen Kopfhörer und messen Sie den Schalldruckpegel in der Nähe des Trommelfells der Maus mit einem kleinen Mikrofon, das in der Nähe des Kopfhörers platziert ist. Geben Sie Burst-Stimuli von einem Schallgenerator mit 37 Zyklen/s aus und verstärken Sie den Schalldruck von einem Schalldruckpegel (SPL) von 20 dB auf 80 dB SPL in 5 dB SPL-Schritten.
4. Führen Sie eine Nadelelektrode aus Edelstahl für die Aufzeichnung von Elektroenzephalogrammen unter den Gehörgang und den Frontalbereich des Ohrs ein und führen Sie eine Masseelektrode unter dem kaudalen Bereich des Schwanzes ein.
5. Bewerten Sie die Cochlea-Funktionen, indem Sie die Amplitude des ABR-Peaks I (P1) messen. Analysieren Sie die ABR-Wellenformen automatisch in Bezug auf die Hörschwellen und die ABR P1-Amplitude mit der ABR-Peak-Analysesoftware, wie bereits berichtet¹⁸.
6. Berechnen Sie die ABR-Schwellenwertverschiebungen, indem Sie die vor der Exposition erhaltenen Schwellenwerte subtrahieren. Vergleichen Sie die Verschiebungen der ABR-Schwellenwerte in den drei exponierten Gruppen mit denen der nicht exponierten kontralateralen Ohren (Kontrolle). Messen Sie ABR-Amplituden mit der ABR-Wellenform während einer SPL-Stimulation von 80 dB.

4. Histologische Beurteilung

HINWEIS: Die histologische Beurteilung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt ^14,15.

1. HCs und Cochlea-Synapse
   1. Führen Sie die pathologische Untersuchung der Cochlea 1 Monat nach der LISW-Exposition durch.
   2. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen vor der Perfusion. Nach der Hämoperfusion mit Laktat-Ringer-Lösung ist eine transkardiale Perfusion mit 1 ml/g 4% Paraformaldehyd (PFA) durchzuführen. Nach der Enthauptung die Cochlea entfernen und direkt mit 4 % PFA durchbluten, anschließend über Nacht bei 4 °C fixieren.
   3. Nach der Fixierung entkalken Sie die Cochlea, indem Sie 2 Tage lang 0,5 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung einschütteln.
   4. Teilen Sie die demineralisierte Cochlea in vier Stücke. Nachdem Sie jedes Stück Cochlea 10 Minuten lang auf Trockeneis eingefroren haben, führen Sie eine Blockierung bei Raumtemperatur für 1 h in 5 % normalem Pferdeserum durch, das einfach mit 0,3 % Triton X zur Permeabilisierung konjugiert wurde.
   5. Verwenden Sie Anti-Myosin 7a (Myo7A), Anti-C-terminales Bindungsprotein (CtBP2) und Anti-Neurofilament (NF)-Antikörper als primäre Antikörper und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Verwenden Sie Myo7A-, CtBP2- und NF-Antikörper, um HCs, präsynaptische Bänder bzw. Cochlea-Nervenfasern zu bewerten.
   6. Waschen Sie den ungebundenen Primärantikörper mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 x 3 min ab. Die Proben werden mit den entsprechenden Sekundärantikörpern bei 37 °C für 2 h inkubiert. Waschen Sie die Proben nach dem Färben 3 x 5 min lang mit PBS und verkapseln Sie die Proben auf dem Objektträgerglas mit einem wasserlöslichen Verkapselungsmittel unter Verwendung von Deckglas.
   7. Zur Auswertung nehmen Sie das gesamte Bild der Cochlea (in vier Teile unterteilt) bei 10-facher Vergrößerung auf und berechnen die Cochlea-Frequenzkarte mit dem referenzierten ImageJ-Software-Plug-in, um die spezifischen Cochlea-Regionen bei Frequenzen von 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz und 24,0 kHz präzise zu lokalisieren.
   8. Berechnen Sie die Überlebensraten von HC und die Anzahl der Synapsen bei jeder Frequenz.
      1. Um die Überlebensraten von HC zu berechnen, zählen Sie die Anzahl der überlebenden und fehlenden HCs pro 200 μm Länge bei jeder Frequenz und berechnen Sie die Überlebensrate der HCs mit der unten gezeigten Gleichung (1):
         HC-Überlebensrate (%) = (Anzahl der überlebenden HC / Anzahl der überlebenden und fehlenden HCs) × 100 (1)
      2. Um die Anzahl der Synapsen zu berechnen, erhalten Sie hochauflösende Z-Stapel-Bilder des inneren HC-Bereichs mit einem Öl-Immersionsobjektiv (63×) mit einem 3,1-fachen Digitalzoom und einer Schrittweite von 0,25 μm unter konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Importieren Sie die Bildstapel in ImageJ und zählen Sie automatisch die CtBP2-Puncta pro IHC innerhalb eines Bereichs von 50 μm in jedem Bildstapel. Berechnen Sie die Überlebensrate der synaptischen Bänder mit Hilfe von Gleichung (2):
         Überlebensrate synaptischer Bänder (%) = (Anzahl der synaptischen Bänder in LISW-exponierten Ohren / Anzahl der synaptischen Bänder in Kontrollohren) × 100 (2)
   9. Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) die Cochlea wie zuvor beschrieben entfernen und dann über Nacht mit 2 % PFA und 2,5 % Glutaraldehyd zusammen bei 4 °C fixieren. Nach der Entkalkung der Cochlea durch Schütteln in 0,5 mol/l EDTA-Lösung bei 4 °C für 7 Tage die Cochleae in vier Stücke zerlegen, um sie als Ganzes zu präparieren.
   10. Das Gewebe 30 min lang mit 1 % Osmiumtetroxid bei 4 °C fixieren, 10 min in 50 % Ethanol bei Raumtemperatur dehydrieren, mit 70 %, 80 %, 95 % und dann 100 % Ethanol wiederholen, mit Osmium bestäuben und unter dem Elektronenmikroskop bei 5,0 kV untersuchen, wie bereits berichtet¹⁴.
   11. Führen Sie eine quantitative Analyse der Stereozilienbündelstörung in äußeren Haarzellen (OHCs) durch, indem Sie das Verhältnis der gestörten Stereozilien (Anzahl der gestörten OHC-Stereozilien/Gesamtzahl der OHC-Stereozilien) in jeder Energiegruppe unter Verwendung der REM-Bilder^{berechnen 14}. Zählen Sie die Anzahl der Stereozilien pro 100 μm in der Mitte des 16,0- und 24,0-kHz-Bereichs. Kennzeichnen Sie eine oder mehrere Reihen von OHC-Bündeln, die zur Seitenseite gebogen sind, sich verheddern oder denen ihre Basis fehlt, als unterbrochen.
2. SGNs
   1. Um die Anzahl der SGNs 1 Monat nach LISW-Exposition quantitativ zu bestimmen, führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 4 % PBS durch, enthaupten Sie, entfernen Sie die Cochlea und führen Sie eine posteriore Fixation unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durch. Entkalken Sie die Cochlea 1 Woche lang in 0,5 M EDTA.
   2. Nach der Entkalkung tauchen Sie die Cochleae über Nacht in 30%ige Saccharose, betten sie in die Kryosektionsmasse ein, frieren sie in flüssigem Stickstoff ein, um Schnitte in der Nähe des Rosenthal-Kanals mit einer Dicke von 15 μm herzustellen, färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin und betrachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop¹⁴.
   3. Für die SGN-Dichtemessung zählen Sie die Anzahl der SGNs in der mittleren Windung des Rosenthal-Kanals und berechnen Sie das SGN-Überleben pro Kontrolle.

5. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit der Software Ihrer Wahl durch.
2. Analysieren Sie statistische Unterschiede in der ABR-Schwellenverschiebung, HC, SGN und synaptischen Zählung unter Verwendung von Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen ["Häufigkeit oder Cochlea-Anteile (apikal/Mitte/Basis)" × "Tiergruppen"], Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest.
3. Stellen Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler dar, und legen Sie das statistische Signifikanzniveau auf p < 0,05 fest.

Ergebnisse

LISW-Wellenform
Die Reproduzierbarkeit der LISW-Druckwellenform wurde 5x bei 2,0 J/^cm2 wie folgt gemessen. Die Wellenformen waren im Allgemeinen ähnlich und stabil und zeigten einen starken Anstieg mit Zeitbreite, Spitzendruck und Impuls von 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa und 14,1 ± 1,9 Pa∙s (Median ± SD), was den SW-Eigenschaften entspricht (Abbildung 1B). LISWs zeichnen sich durch eine schnelle Anstiegszeit, einen hohen ...

Diskussion

Ziel dieser Studie war es, ein Mausmodell für blasteninduzierte Cochlea-Schäden mit LISW zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das exponierte Ohr der Maus nach der LISW-Applikation durch das Schläfenbein einen konsistenten pathologischen und physiologischen Rückgang der Cochlea aufwies, der mit einem Anstieg des LISW-Überdrucks einherging. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Mausmodell geeignet ist, verschiedene Cochlea-Pathologien durch Anpassung der LISW-Ausga...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm Q-switched Nd:YAG laser	Quantel	Brilliant b
ABR peak analysis software	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive	Acrysunday Co., Ltd	N/A
confocal fluorescence microscopy	Leica	TCS SP8
cryosectioning compound	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody	BD Transduction	#612044
Dielectric multilayer mirrors	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO4104B
Earphone	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.	FOPH2000
Image J software plug-in	NIH	measurement line	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A antibody	Proteus Biosciences	#25–6790
Neurofilament antibody	Sigma	#AB5539
Plano-convex lens	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prism software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Scanning electron microscope	JEOL Ltd	JSM-6340F
Small digital endoscope	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultrasonic jelly	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variable attenuator	Showa Optronics Co.	N/A	Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant	Dako	#S1964