Pesquisa Aplicação de Onda de Choque Induzida por Laser para Estudo de Lesão Coclear Induzida por Explosão

Resumo

Aqui, descrevemos protocolos experimentais para a criação de um modelo animal de lesão coclear induzida por explosão usando onda de choque induzida por laser (LISW). A exposição do osso temporal ao LISW permite a reprodução da fisiopatologia coclear induzida por blasto. Este modelo animal pode ser uma plataforma para elucidar a patologia coclear e explorar possíveis tratamentos para lesões por explosão.

Resumo

O ouvido é o órgão mais suscetível à sobrepressão de explosão, e as lesões cocleares ocorrem frequentemente após a exposição à explosão. A exposição à explosão pode levar à perda auditiva neurossensorial (PASN), que é uma perda auditiva irreversível que afeta negativamente a qualidade de vida. Patologias cocleares detalhadas induzidas por blastos, como perda de células ciliadas, neurônios ganglionares espirais, sinapses cocleares e ruptura de estereocílios, foram documentadas anteriormente. No entanto, determinar a deterioração neurossensorial coclear após uma lesão por explosão é um desafio, pois os animais expostos à sobrepressão da explosão geralmente apresentam perfuração da membrana timpânica (TMP), que causa perda auditiva condutiva concomitante. Para avaliar a disfunção coclear neurossensorial pura, desenvolvemos um modelo animal experimental de lesão coclear induzida por blasto usando uma onda de choque induzida por laser. Esse método evita TMP e lesões sistêmicas concomitantes e reproduz o declínio funcional do componente PASN de maneira dependente de energia após a exposição ao LISW. Este modelo animal pode ser uma plataforma para elucidar os mecanismos patológicos e explorar possíveis tratamentos para a disfunção coclear induzida por blasto.

Introdução

A perda auditiva e o zumbido estão entre as deficiências mais prevalentes, relatadas em até 62% dos veteranos¹. Várias complicações auditivas induzidas por blastos, incluindo perda auditiva neurossensorial (PASN) e perfuração da membrana timpânica (PTM), têm sido relatadas em indivíduos expostos à sobrepressão blástica². Além disso, pesquisas em indivíduos expostos a blastos sugerem que a exposição ao blasto freqüentemente resulta em defeitos na resolução temporal auditiva, mesmo quando os limiares auditivos estão dentro da normalidade, o que é conhecido como "perda auditiva oculta (HHL)^"3. Está bem estabelecido que há uma perda substancial de sinapses cocleares entre as células ciliadas internas (CCIs) e os neurônios auditivos (NAs) na patologia coclear relacionada à explosão⁴. A degeneração sináptica resulta em comprometimento do processamento auditivo e é um dos principais fatores que contribuem para o desenvolvimento da HHL⁵. Assim, os órgãos auditivos são componentes frágeis contendo estruturas complexas e altamente organizadas. No entanto, o mecanismo preciso pelo qual as ondas de choque afetam o ouvido interno no nível celular permanece obscuro. Isso se deve aos desafios em replicar as complexidades clínicas e mecânicas precisas das lesões por explosão em ambientes de laboratório e à complexidade das patologias cocleares induzidas por blasto.

O principal componente de uma lesão por explosão é a onda de choque (SW), caracterizada por um aumento rápido e alto na pressão de pico⁶. A complexidade das lesões por explosão tem sido extensivamente investigada em vários estudos retrospectivos ^7,8,9. Existem vários dispositivos para geração de explosões, como gás comprimido¹⁰, tubos de choque¹¹ e explosivos de pequena magnitude¹², em diferentes níveis de pressão. A forma de onda de pressão do SW gerada por dispositivos desenvolvidos recentemente se assemelhava muito à de uma explosão real. Um conceito importante no estabelecimento de um modelo animal de perda auditiva neurossensorial induzida por explosão é minimizar lesões concomitantes, além de danos auditivos, para reduzir a morte animal. Assim, estudos de lesões por explosão foram desenvolvidos nos quais os tubos de choque foram miniaturizados e a saída pode ser controlada com precisão para que os animais expostos raramente morram. No entanto, embora esses modelos animais geralmente desenvolvam complicações, como a PTM, a avaliação da função coclear é difícil devido à perda auditiva condutiva concomitante². Anteriormente, realizamos um estudo em animais com orelha protegida sobre lesão por explosão usando tampões de ouvido e não encontramos incidência de TMP¹³. Os tampões auditivos podem atenuar parcialmente os danos cocleares graves, mas não a neurodegeneração auditiva central ou o desenvolvimento do zumbido. Assim, os tampões de ouvido protegem a cóclea, bem como a membrana timpânica. No entanto, um modelo animal de dano coclear puro induzido por explosão sem TMP é necessário para estudar a fisiopatologia coclear causada por lesões por blasto.

Anteriormente, desenvolvemos um modelo de lesão por explosão tópica da orelha interna em ratos e camundongos usando uma onda de choque induzida por laser (LISW)^14,15. Este método pode ser realizado com segurança e facilidade em nível laboratorial padrão e tem sido usado para gerar modelos de lesões pulmonares e por explosão craniana^16,17. A energia do LISW pode ser ajustada alterando o tipo e a potência do laser, permitindo o controle sobre o grau de dano coclear. O modelo de lesão coclear induzida por LISW é valioso para estudar os mecanismos de PASN causados por lesões por explosão e investigar possíveis tratamentos. Neste estudo, descrevemos protocolos experimentais detalhados para criar um modelo de camundongo de dano coclear induzido por explosão usando LISW e demonstramos a degeneração coclear, incluindo a perda de células ciliadas (HCs), sinapses cocleares e neurônios ganglionares espirais (SGNs), de maneira dependente de energia em camundongos após a exposição ao LISW.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Defesa Nacional (aprovação # 18050) e realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e seu sofrimento.

1. Animais

1. Use camundongos CBA/J machos de 8 semanas de idade para seguir este protocolo. Antes do experimento, submeta os camundongos a um teste de função auditiva e observação endoscópica da membrana timpânica para garantir a normalidade.
2. Divida 27 camundongos CBA/J em três grupos: (1) 2,0 J/cm² grupo exposto (n = 9 camundongos); (2) grupo exposto a 2,25 J/^cm2 (n = 9 camundongos); e (3) grupo exposto a 2,5 J/^cm2 (n = 9 camundongos). Remova todas as orelhas para avaliação 1 mês após a exposição ao LISW.

2. Configurações experimentais de exposição LISW

1. O alvo do laser é um disco preto de borracha natural, com 10 mm de diâmetro e 0,5 mm de espessura. Para aumentar o impulso LISW, use um adesivo de soldagem de resina acrílica para colar uma folha de tereftalato de polietileno transparente (PET) de 1,0 mm de espessura na parte superior da área alvo. Irradie um laser Nd:YAG Q-switched de 532 nm para gerar o LISW atrás do alvo (Figura 1A).
2. Focalize o pulso de laser com uma lente plano-convexa em um ponto de 3,0 mm de diâmetro no alvo do laser.
3. Use a irradiação LISW para gerar plasma na superfície de ligação dos dois materiais e vaporize a borracha (ablação mediada por plasma), deixando a borracha vaporizada na cavidade.
4. Use um hidrofone para medir a onda de pressão de LISW a 1,0 mm debaixo d'água, não em tecido vivo. Coloque um hidrofone de fibra óptica de 0,25 mm de diâmetro sob a borracha preta 1,0 mm abaixo da superfície da água para registrar as formas de onda de pressão LISW e medi-las usando um osciloscópio digital.
   NOTA: As formas de onda de pressão mostraram características estáveis com pressão e impulso máximos semelhantes, conforme mostrado na Figura 1B.
5. Realize todos os procedimentos em animais sob anestesia geral usando injeções intraperitoneais de cloridrato de medetomidina 1 mg / kg e 75 mg / kg de cetamina. Aplique uma pomada oftálmica em ambos os olhos do camundongo para evitar o ressecamento e fornecer suporte térmico.
6. Depile cuidadosamente as regiões pós-auriculares para evitar reter o ar preso no pelo. Fixe os mouses em uma placa e posicione as regiões pós-auriculares na área focal do LISW verticalmente para cima.
7. Prenda um alvo de borracha preta percutaneamente na região pós-auricular da orelha do rato. Para garantir a correspondência de impedância acústica, use um gel condutor de ultrassom entre o alvo do laser e a superfície da pele.
8. Aplique um único pulso LISW na cóclea através do osso temporal. Defina as saídas dos pulsos de laser para três densidades de energia: 2.0 J/cm² , 2.25 J/cm² e 2.5 J/cm².

3. Teste de função coclear

NOTA: Os testes de potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE) foram realizados conforme relatado anteriormente^14,15.

1. Realize a medição do ABR 1 dia antes e 1 dia e 1 mês após a exposição ao LISW.
2. O PEATE é um potencial evocado auditivo em resposta a estímulos auditivos e é comumente utilizado para avaliar os limiares auditivos em quatro frequências (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz e 24,0 kHz).
3. Apresente o som de estimulação em um fone de ouvido pequeno e meça o nível de pressão sonora próximo à membrana timpânica do mouse usando um pequeno microfone colocado próximo ao fone de ouvido. Emite estímulos de explosão de um gerador de som a 37 ciclos/s e amplifica a pressão sonora de um nível de pressão sonora (SPL) de 20 dB para 80 dB SPL em passos de 5 dB SPL.
4. Insira um eletrodo de agulha de aço inoxidável para registro de eletroencefalograma sob o canal auditivo e a região frontal da orelha e insira um eletrodo de aterramento sob a região caudal da cauda.
5. Avaliar as funções cocleares medindo a amplitude do PEATE pico I (P1). Analisar automaticamente as formas de onda do PEATE em relação aos limiares auditivos e à amplitude do PEATE P1 usando o software de análise de pico do PEATE conforme relatado anteriormente¹⁸.
6. Calcule as mudanças do limiar do ABR subtraindo os limiares obtidos antes da exposição. Comparar os desvios do limiar do PEATE nos três grupos expostos com os das orelhas contralaterais não expostas (controle). Meça as amplitudes do ABR usando a forma de onda do ABR durante a estimulação de 80 dB SPL.

4. Avaliação histológica

NOTA: A avaliação histológica foi realizada conforme descrito anteriormente ^14,15.

1. HCs e sinapse coclear
   1. Realize o exame patológico da cóclea 1 mês após a exposição ao LISW.
   2. Confirme a profundidade da anestesia por pinça do dedo do pé antes da perfusão. Após hemoperfusão com solução de Ringer com lactato, realizar perfusão transcardíaca com 1 mL/g de paraformaldeído (PFA) a 4%. Após a decapitação, remova a cóclea e perfunda diretamente com PFA a 4%, seguido de fixação a 4 °C durante a noite.
   3. Após a fixação, descalcifique a cóclea agitando em solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mol/L por 2 dias.
   4. Divida a cóclea desmineralizada em quatro partes. Após congelar cada pedaço de cóclea em gelo seco por 10 min, execute o bloqueio em temperatura ambiente por 1 h em soro de cavalo normal a 5% simplesmente conjugado com Triton X a 0,3% para permeabilização.
   5. Use anticorpos antimiosina 7a (Myo7A), proteína de ligação anti-C-terminal (CtBP2) e antineurofilamento (NF) como anticorpos primários e incubados a 37 ° C durante a noite. Use anticorpos Myo7A, CtBP2 e NF para avaliar HCs, fitas pré-sinápticas e fibras nervosas cocleares, respectivamente.
   6. Lave o anticorpo primário não ligado com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 x 3 min. Incubar as amostras com os anticorpos secundários apropriados a 37 °C durante 2 h. Após a coloração, lave as amostras por 3 x 5 min com PBS e encapsule as amostras no vidro deslizante com um encapsulante solúvel em água usando vidro de cobertura.
   7. Para avaliação, adquira a imagem inteira da cóclea (dividida em quatro partes) com ampliação de 10x e calcule o mapa de frequência coclear usando o plug-in do software ImageJ referenciado para localizar com precisão as regiões cocleares específicas nas frequências de 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz e 24,0 kHz.
   8. Calcule as taxas de sobrevivência do HC e o número de sinapses em cada frequência.
      1. Para calcular as taxas de sobrevivência dos HCs, conte o número de HCs sobreviventes e ausentes por 200 μm de comprimento em cada frequência e calcule a taxa de sobrevivência dos HCs usando a equação (1) mostrada abaixo:
         Taxa de sobrevivência do HC (%) = (Número de HCs sobreviventes / Número de HCs sobreviventes e ausentes) × 100 (1)
      2. Para calcular o número de sinapses, obtenha imagens de pilha z de alta resolução da área interna do HC usando uma lente objetiva de imersão em óleo (63×) com zoom digital de 3,1x e tamanho de passo de 0,25 μm sob microscopia de fluorescência confocal. Importe as pilhas de imagens para o ImageJ e conte automaticamente os pontos CtBP2 por IHC dentro de uma faixa de 50 μm em cada pilha de imagens. Calcule a taxa de sobrevivência das fitas sinápticas usando a equação (2):
         Taxa de sobrevivência das fitas sinápticas (%) = (Número de fitas sinápticas nas orelhas expostas LISW / Número de fitas sinápticas nas orelhas de controle) × 100 (2)
   9. Para microscopia eletrônica de varredura (MEV), remova a cóclea, conforme descrito anteriormente, e fixe com PFA a 2% e glutaraldeído a 2,5% juntos a 4 ° C durante a noite. Após a descalcificação da cóclea agitando em solução de EDTA 0,5 mol/L a 4 °C durante 7 dias, dissecar as cócleas em quatro pedaços para preparação de montagem completa.
   10. Fixar os tecidos com tetróxido de ósmio a 1% a 4 °C durante 30 min, desidratar em etanol a 50% à temperatura ambiente durante 10 min, repetir com etanol a 70 %, 80 %, 95 % e, em seguida, etanol a 100 %, revestir por pulverização catódica com ósmio e examinar ao microscópio eletrónico a 5,0 kV, conforme relatado anteriormente¹⁴.
   11. Realize uma análise quantitativa da ruptura do feixe estereociliar nas células ciliadas externas (OHCs) calculando a proporção de estereocílios interrompidos (número de estereocílios OHC interrompidos / número total de estereocílios OHC) em cada grupo de energia usando as imagens SEM¹⁴. Conte o número de estereocílios por 100 μm no centro das regiões de 16,0 e 24,0 kHz. Designe uma ou mais fileiras de feixes de CCE que estão dobrados para o lado lateral, emaranhados ou sem a base como interrompida.
2. SGNs
   1. Para avaliar quantitativamente o número de SGNs 1 mês após a exposição ao LISW, realizar perfusão transcardíaca com PBS a 4%, decapitar, remover a cóclea e realizar fixação posterior nas mesmas condições descritas acima. Descalcifique a cóclea em EDTA 0,5 M por 1 semana.
   2. Após a descalcificação, mergulhar as cócleas em sacarose a 30% durante a noite, incorporá-las no composto de criossecção, congelar em nitrogênio líquido para preparar cortes próximos ao canal de Rosenthal com espessura de 15 μm, corar com hematoxilina e eosina e visualizá-las ao microscópio óptico¹⁴.
   3. Para medição de densidade de SGN, conte o número de SGNs na volta média do canal de Rosenthal e calcule a sobrevivência do SGN por controle.

5. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando o software de sua escolha.
2. Analise as diferenças estatísticas no deslocamento do limiar do ABR, HC, SGN e contagens sinápticas usando ANOVA de medidas repetidas de duas vias ["frequência ou partes cocleares (apical/média/base)" × "grupos de animais"], análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguida de teste de comparação múltipla de Tukey post-hoc.
3. Apresentar todos os dados como média ± erro padrão e definir o nível de significância estatística em p < 0,05.

Resultados

Forma de onda LISW
A reprodutibilidade da forma de onda de pressão LISW foi medida 5x a 2,0 J/^cm2 da seguinte forma. As formas de onda foram geralmente semelhantes e estáveis e mostraram um aumento acentuado com largura de tempo, pressão de pico e impulso de 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa e 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediana ± DP), o que corresponde às características do SW (Figura 1B). Os LISWs são caracterizados por um tempo ...

Discussão

Este estudo teve como objetivo validar um modelo de camundongo de dano coclear induzido por blasto usando LISW. Nossos achados demonstraram que, após a aplicação do LISW através do osso temporal, a orelha dos camundongos expostos exibiu um declínio patológico e fisiológico consistente na cóclea, que foi acompanhado por um aumento na sobrepressão do LISW. Esses resultados indicam que este modelo de camundongo é apropriado para replicar várias patologias cocleares, ajustando a s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm Q-switched Nd:YAG laser	Quantel	Brilliant b
ABR peak analysis software	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive	Acrysunday Co., Ltd	N/A
confocal fluorescence microscopy	Leica	TCS SP8
cryosectioning compound	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody	BD Transduction	#612044
Dielectric multilayer mirrors	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO4104B
Earphone	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.	FOPH2000
Image J software plug-in	NIH	measurement line	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A antibody	Proteus Biosciences	#25–6790
Neurofilament antibody	Sigma	#AB5539
Plano-convex lens	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prism software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Scanning electron microscope	JEOL Ltd	JSM-6340F
Small digital endoscope	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultrasonic jelly	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variable attenuator	Showa Optronics Co.	N/A	Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant	Dako	#S1964