폭발로 인한 달팽이관 손상을 연구하기 위한 레이저 유도 충격파의 연구 응용

요약

여기에서는 레이저 유도 충격파(LISW)를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 동물 모델을 만들기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 측두골이 LISW에 노출되면 폭발에 의한 달팽이관 병태생리학이 재현될 수 있습니다. 이 동물 모델은 달팽이관 병리학을 밝히고 폭발 부상에 대한 잠재적 치료법을 탐색하기 위한 플랫폼이 될 수 있습니다.

초록

귀는 폭발 과압에 가장 취약한 기관이며, 폭발 노출 후 달팽이관 손상이 자주 발생합니다. 폭발에 노출되면 삶의 질에 부정적인 영향을 미치는 돌이킬 수 없는 난청인 감각신경성 난청(SNHL)이 발생할 수 있습니다. 유모 세포의 손실, 나선형 신경절 뉴런, 달팽이관 시냅스, 입체섬모의 파괴와 같은 폭발로 인한 달팽이관 병리에 대한 자세한 설명이 이전에 문서화되었습니다. 그러나 폭발 부상 후 달팽이관 감각 신경 저하를 결정하는 것은 어려운 일인데, 폭발 과압에 노출된 동물은 일반적으로 고막 천공(TMP)을 경험하여 동시 전음성 난청을 유발하기 때문입니다. 순수 감각신경성 달팽이관 기능 장애를 평가하기 위해 레이저 유도 충격파를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 실험 동물 모델을 개발했습니다. 이 방법은 TMP 및 수반되는 전신 손상을 피하고 LISW 노출 후 에너지 의존적 방식으로 SNHL 구성 요소의 기능 저하를 재현합니다. 이 동물 모델은 병리학적 메커니즘을 규명하고 모세포로 인한 달팽이관 기능 장애에 대한 잠재적인 치료법을 탐색하기 위한 플랫폼이 될 수 있습니다.

서문

난청과 이명은 가장 흔한 장애 중 하나이며, 재향 군인의 최대 62%가 보고하고 있습니다¹. 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss, SNHL) 및 고막천공(tympanic membrane perforation, TMP)을 포함한 여러 폭발로 인한 청각 합병증이 폭발 과압에 노출된 사람들에게서 보고되었다². 또한, 폭발에 노출된 개인에 대한 연구에 따르면 폭발에 노출되면 청력 역치가 정상 범위 내에 있는 경우에도 청각 시간 해상도에 결함이 발생하는 경우가 많으며, 이를 "숨겨진 청력 손실(HHL)"이라고 ^합니다3. 모세포 관련 달팽이관 병리학에서 내부 유모세포(IHC)와 청각 뉴런(AN) 사이의 달팽이관 시냅스가 크게 소실된다는 것은 잘 알려진 사실이다⁴. 시냅스 퇴행은 청각 처리 장애를 초래하며 HHL⁵의 발병에 기여하는 주요 요인입니다. 따라서 청각 기관은 복잡하고 고도로 조직화된 구조를 포함하는 깨지기 쉬운 구성 요소입니다. 하지만 돌파가 세포 수준에서 내이에 영향을 미치는 정확한 메커니즘은 아직 불분명합니다. 이는 실험실 환경에서 폭발 부상의 정확한 임상 및 기계적 복잡성을 복제하는 데 어려움이 있고 폭발로 인한 달팽이관 병리학의 복잡성 때문입니다.

폭발 부상의 주요 구성 요소는 충격파(SW)이며, 이는^{최고 압력(}6)의 빠르고 높은 증가를 특징으로 합니다. 폭발 부상의 복잡성은 수많은 후향적 연구에서 광범위하게 조사되었습니다 ^7,8,9. 압축 가스(¹⁰), 충격관(¹¹) 및 소형 폭발물⁽¹²)과 같은 폭발 발생을 위한 다양한 장치가 서로 다른 압력 수준에서 존재한다. 최근에 개발된 장치에서 발생하는 SW의 압력 파형은 실제 폭발 때와 매우 흡사했습니다. 모세포에 의한 감각신경성 난청의 동물 모델을 확립하는 데 있어 중요한 개념은 동물의 죽음을 줄이기 위해 청각 손상 이외의 동반 부상을 최소화하는 것입니다. 따라서 폭발 부상 연구가 개발되어 충격 튜브가 소형화되고 출력을 정밀하게 제어하여 노출된 동물이 거의 죽지 않도록 할 수 있습니다. 그러나 이러한 동물모델에서는 일반적으로 TMP와 같은 합병증이 발생하지만, 동시에 발생하는 전음성 난청으로 인해 달팽이관 기능 평가가 어렵다². 우리는 이전에 귀마개를 사용한 폭발 부상에 대한 귀 보호 동물 연구를 수행했으며 TMP¹³의 발생률을 발견하지 못했습니다. 귀마개는 심각한 달팽이관 손상을 부분적으로 약화시킬 수 있지만 중추 청각 신경 퇴행이나 이명 발생은 완화할 수 없습니다. 따라서 귀마개는 달팽이관과 고막을 보호합니다. 그러나 폭발 손상으로 인한 달팽이관 병태생리를 연구하기 위해서는 TMP가 없는 폭발로 인한 순수 달팽이관 손상의 동물 모델이 필요합니다.

우리는 이전에 레이저 유도 충격파(LISW)를 사용하여 쥐와 생쥐에서 내이의 국소 폭발 손상 모델을 개발했습니다^14,15. 이 방법은 표준 실험실 수준에서 안전하고 쉽게 수행 할 수 있으며 폐 및 두부 폭발 손상 모델을 생성하는 데 사용되었습니다^16,17. LISW의 에너지는 레이저 유형과 출력을 변경하여 조정할 수 있으므로 달팽이관 손상 정도를 제어할 수 있습니다. LISW 유발 달팽이관 손상 모델은 폭발 손상으로 인한 인공와우의 메커니즘을 연구하고 잠재적인 치료법을 조사하는 데 유용합니다. 이 연구에서는 LISW를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 마우스 모델을 만들기 위한 자세한 실험 프로토콜을 설명하고 LISW 노출 후 마우스에서 에너지 의존적 방식으로 유모 세포(HC), 달팽이관 시냅스 및 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 손실을 포함한 달팽이관 퇴행을 보여줍니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 국방 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 #18050)의 승인을 받았으며 국립 보건원과 일본 문부과학성의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 동물

1. 이 프로토콜을 따르기 위해 8주 된 수컷 CBA/J 마우스를 사용하십시오. 실험 전에 쥐에게 청력 기능 검사와 고막의 내시경 관찰을 실시하여 정상성을 확인합니다.
2. 27 CBA / J 마우스를 세 그룹으로 나눕니다 : (1) 2.0 J / cm² 노출 그룹 (n = 9 마우스); (2) 2.25 J/^cm2 노출군(n=9마리 마우스); 및 (3) 2.5 J/^cm2 노출군(n = 9 마우스). LISW 노출 후 1개월 후에 평가를 위해 모든 귀를 제거합니다.

2. LISW 노출의 실험 설정

1. 레이저 타겟은 직경 10mm, 두께 0.5mm의 검은색 천연 고무 디스크입니다. LISW 임펄스를 높이려면 아크릴 수지 용접 접착제를 사용하여 1.0mm 두께의 투명한 폴리에틸렌 테레프탈레이트 시트(PET)를 대상 영역의 상단에 접착합니다. 532nm Q-switched Nd: YAG 레이저를 조사하여 대상 뒤에 LISW를 생성합니다(그림 1A).
2. plano-convex lens를 사용하여 레이저 대상의 3.0mm 직경 스폿에 레이저 펄스의 초점을 맞춥니다.
3. LISW 조사를 사용하여 두 재료의 결합 표면에서 플라즈마를 생성하고 고무를 기화(플라즈마 매개 절제)하여 기화된 고무를 캐비티에 남깁니다.
4. 수중 청음기를 사용하여 생체 조직이 아닌 수중 1.0mm에서 LISW의 압력파를 측정합니다. 수표면 아래 0.25mm 아래의 검은색 고무 아래에 1.0mm 직경의 광섬유 수중 청음기를 배치하여 LISW 압력 파형을 기록하고 디지털 오실로스코프를 사용하여 측정합니다.
   참고: 압력 파형은 그림 1B와 같이 유사한 최대 압력 및 임펄스로 안정적인 특성을 보여주었습니다.
5. 1mg/kg 메데토미딘 염산염 및 75mg/kg 케타민의 복강 내 주사를 사용하여 전신 마취 하에 모든 동물 시술을 수행합니다. 생쥐의 양쪽 눈에 안과 연고를 바르면 건조를 방지하고 열을 공급할 수 있습니다.
6. 털에 갇힌 공기가 남지 않도록 귓바퀴 뒤쪽 부위를 조심스럽게 면도하십시오. 마우스를 플레이트에 고정하고 LISW의 초점 영역에서 후귓바퀴 영역을 수직으로 위쪽 방향으로 배치합니다.
7. 검은색 고무 타겟을 마우스 귀의 귓바퀴 뒤쪽 부위에 경피적으로 부착합니다. 음향 임피던스 정합을 보장하려면 레이저 대상과 피부 표면 사이에 초음파 전도성 젤을 사용하십시오.
8. 측두골을 통해 달팽이관에 단일 LISW 펄스를 적용합니다. 레이저 펄스의 출력을 2.0 J/cm² , 2.25 J/cm² 및 2.5 J/cm²의 세 가지 에너지 밀도로 설정합니다.

3. 인공와우 기능 검사

참고: 청각 뇌간 반응(ABR) 검사는 이전에 보고된^{대로 수행되었습니다 14,15}.

1. LISW 노출 1일 전과 1일 및 1개월 후에 ABR 측정을 수행합니다.
2. ABR은 청각 자극에 대한 반응으로 청각적으로 유발되는 전위이며 일반적으로 4가지 주파수(12.0kHz, 16.0kHz, 20.0kHz 및 24.0kHz)에서 청력 임계값을 평가하는 데 사용됩니다.
3. 작은 이어폰을 통해 자극음을 제시하고 이어폰 근처에 위치한 작은 마이크를 사용하여 마우스의 고막 부근의 음압 레벨을 측정합니다. 사운드 제너레이터에서 37 cycles/s로 버스트 자극을 출력하고 5dB SPL 단계로 20dB 음압 레벨(SPL)에서 80dB SPL로 음압을 증폭합니다.
4. 귀의 외이도와 전두부 아래에 뇌파 기록을 위한 스테인리스강 바늘 전극을 삽입하고 꼬리의 꼬리 부분 아래에 접지 전극을 삽입합니다.
5. ABR 피크 I(P1) 진폭을 측정하여 달팽이관 기능을 평가합니다. 이전에 보고된 바와 같이 ABR 피크 분석 소프트웨어를 사용하여 청력 임계값 및 ABR P1 진폭에 대한 ABR 파형을 자동으로 분석합니다¹⁸.
6. 노출 전에 얻은 임계값을 빼서 ABR 임계값 이동을 계산합니다. 노출된 3개 그룹의 ABR 역치 이동을 노출되지 않은 반대측 귀(대조군)의 역치 이동과 비교합니다. 80dB SPL 자극 중 ABR 파형을 사용하여 ABR 진폭을 측정합니다.

4. 조직학적 평가

참고: 조직학적 평가는 앞서 설명한 바와 같이^{수행하였다 14,15}.

1. HC와 달팽이관 시냅스
   1. LISW 노출 후 1개월 후에 달팽이관의 병리학적 검사를 수행합니다.
   2. 관류 전에 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인합니다. 젖산 링거 용액으로 혈액 관류 후 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL/g으로 심장 경관류를 수행합니다. 참수 후 달팽이관을 제거하고 4% PFA를 직접 관류한 다음 밤새 4°C에서 고정합니다.
   3. 고정 후 0.5mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 2일 동안 흔들어 달팽이관을 제거합니다.
   4. 탈염된 달팽이관을 네 조각으로 나눕니다. 달팽이관의 각 조각을 드라이아이스에 10분 동안 얼린 후, 투과성을 위해 0.3% Triton X와 간단히 결합된 5% 일반 말 혈청에서 실온에서 1시간 동안 차단을 수행합니다.
   5. anti-myosin 7a(Myo7A), anti-C-terminal binding protein(CtBP2) 및 anti-neurofilament(NF) 항체를 1차 항체로 사용하고 37°C에서 밤새 배양합니다. Myo7A, CtBP2 및 NF 항체를 사용하여 각각 HC, 시냅스전 리본 및 달팽이관 신경 섬유를 평가합니다.
   6. 결합되지 않은 1차 항체를 인산염 완충 식염수(PBS)로 5 x 3분 동안 씻어냅니다. 적절한 2차 항체로 37°C에서 2시간 동안 검체를 배양합니다. 염색 후 PBS로 3 x 5분 동안 표본을 세척하고 커버 유리를 사용하여 수용성 캡슐화제로 슬라이드 유리에 표본을 캡슐화합니다.
   7. 평가를 위해 10x 배율로 달팽이관의 전체 이미지(4개 조각으로 나뉘어짐)를 획득하고 참조된 ImageJ 소프트웨어 플러그인을 사용하여 달팽이관 주파수 맵을 계산하여 12.0kHz, 16.0kHz, 20.0kHz 및 24.0kHz 주파수에서 특정 달팽이관 영역의 위치를 정확하게 파악합니다.
   8. HC 생존율과 각 주파수에서 시냅스의 수를 계산합니다.
      1. HC 생존율을 계산하려면 각 주파수에서 200μm 길이당 생존 및 누락된 HC의 수를 세고 아래 표시된 방정식 (1)을 사용하여 HC의 생존율을 계산합니다.
         HC 생존율(%) = (생존 HC의 수 / 생존 및 누락된 HC의 수) × 100 (1)
      2. 시냅스 수를 계산하려면 컨포칼 형광 현미경 검사에서 3.1x 디지털 줌 및 0.25μm 단계 크기의 오일 이멀젼 대물렌즈(63×)를 사용하여 내부 HC 영역의 고해상도 z-stack 이미지를 얻습니다. 이미지 스택을 ImageJ로 가져오고 각 이미지 스택에서 50μm 범위 내에서 IHC당 CtBP2 점을 자동으로 계산합니다. 방정식 (2)를 사용하여 시냅스 리본 생존율을 계산합니다.
         시냅스 리본 생존율(%) = (LISW 노출된 귀의 시냅스 리본 수 / 대조 귀의 시냅스 리본 수) × 100 (2)
   9. 주사전자현미경(SEM)의 경우 앞에서 설명한 대로 달팽이관을 제거한 다음 4°C에서 밤새 2% PFA와 2.5% 글루타르알데히드로 고정합니다. 4°C에서 0.5mol/L EDTA 용액을 7일 동안 흔들어 달팽이관을 석회화한 후 달팽이관을 4조각으로 절개하여 전체 산 준비를 합니다.
   10. 4°C에서 30분 동안 1% 사산화오스뮴으로 조직을 고정하고, 실온에서 50% 에탄올로 10분 동안 탈수하고, 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올로 반복하고, 오스뮴으로 스퍼터 코팅하고, 이전에 보고된 바와 같이 5.0kV에서 전자 현미경으로 검사합니다¹⁴.
   11. SEM 이미지¹⁴를 사용하여 각 에너지 그룹에서 파괴된 입체섬모의 비율(파괴된 OHC 입체섬모의 수/OHC 입체섬의 총 수)을 계산하여 외부 유모 세포(OHC)의 입체섬모 파괴에 대한 정량적 분석을 수행합니다. 16.0kHz 및 24.0kHz 영역의 중심에서 100μm당 입체섬모의 수를 계산합니다. 측면으로 구부러져 있거나, 얽혀 있거나, 밑면이 없는 OHC 다발을 하나 이상 끊어진 것으로 지정합니다.
2. SGN (영문)
   1. LISW 노출 후 1개월에 SGN 수를 정량적으로 평가하려면 위에서 설명한 것과 동일한 조건에서 4% PBS로 심장 경관류를 수행하고, 목을 자르고, 달팽이관을 제거하고, 후방 고정을 수행합니다. 1주일 동안 0.5M EDTA에서 달팽이관을 석회질화합니다.
   2. 석회질을 제거한 후, 달팽이관을 30% 자당에 밤새 담그고, 이를 동결 절제 화합물에 매립시키고, 액체 질소에 동결하여 15μm 두께의 Rosenthal's canal 근처 절편을 준비하고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 광학 현미경으로 관찰합니다¹⁴.
   3. SGN 밀도 측정의 경우, Rosenthal's canal의 중간 회전에 있는 SGN의 수를 세고 대조군당 SGN 생존을 계산합니다.

5. 통계 분석

1. 선택한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
2. 양방향 반복 측정 ANOVA["빈도 또는 달팽이관 부분(정점/중간/기저)" × "동물 그룹"], 양방향 분산 분석(ANOVA)을 사용한 후 사후 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 ABR 임계값 이동, HC, SGN 및 시냅스 수의 통계적 차이를 분석합니다.
3. 모든 데이터를 평균 ± 표준 오차로 표시하고 통계적 유의수준을 p < 0.05로 설정합니다.

결과

LISW 파형
LISW 압력 파형의 재현성은 다음과 같이 2.0 J/^cm2 에서 5배 측정하였다. 파형은 대체로 유사하고 안정적이었으며, 시간 폭, 피크 압력 및 임펄스가 0.43±0.4μs, 92.1 ± 6.8MPa, 14.1 ± 1.9 Pa∙s(중앙값 ± SD)로 급격히 증가했으며, 이는 SW 특성에 해당합니다(그림 1B). LISW는 빠른 상승 시간, 높은 피크 압력, 짧은 지속 시간 및 양압 ?...

토론

이 연구는 LISW를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 마우스 모델을 검증하는 것을 목표로 했습니다. 우리의 발견은 측두골을 통해 LISW를 적용한 후 노출된 쥐의 귀가 달팽이관에서 일관된 병리학적 및 생리학적 감소를 보였으며 이는 LISW 과압의 증가를 동반했음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 이 마우스 모델이 LISW 출력을 조정하여 다양한 달팽이관 병리학을 복제...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm Q-switched Nd:YAG laser	Quantel	Brilliant b
ABR peak analysis software	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive	Acrysunday Co., Ltd	N/A
confocal fluorescence microscopy	Leica	TCS SP8
cryosectioning compound	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody	BD Transduction	#612044
Dielectric multilayer mirrors	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO4104B
Earphone	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.	FOPH2000
Image J software plug-in	NIH	measurement line	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A antibody	Proteus Biosciences	#25–6790
Neurofilament antibody	Sigma	#AB5539
Plano-convex lens	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prism software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Scanning electron microscope	JEOL Ltd	JSM-6340F
Small digital endoscope	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultrasonic jelly	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variable attenuator	Showa Optronics Co.	N/A	Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant	Dako	#S1964