АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье мы описываем экспериментальные протоколы создания животной модели взрывоиндуцированного повреждения улитки с использованием лазерно-индуцированной ударной волны (LISW). Воздействие LISW на височную кость позволяет воспроизвести бласт-индуцированную патофизиологию улитки. Эта животная модель может стать платформой для выяснения патологии улитки и изучения потенциальных методов лечения взрывных травм.

Аннотация

Ухо является органом, наиболее восприимчивым к избыточному давлению при взрыве, и травмы улитки часто возникают после воздействия взрыва. Взрывное воздействие может привести к сенсоневральной тугоухости (SNHL), которая представляет собой необратимую потерю слуха, негативно влияющую на качество жизни. Ранее были задокументированы детальные бласт-индуцированные кохлеарные патологии, такие как потеря волосковых клеток, спиральных ганглиозных нейронов, синапсов улитки и нарушение стереоцилии. Тем не менее, определение ухудшения состояния кохлеарной сенсоневральной оболочки после взрывной травмы является сложной задачей, поскольку у животных, подвергшихся воздействию избыточного давления взрывной волны, обычно наблюдается перфорация барабанной перепонки (TMP), которая вызывает сопутствующую кондуктивную тугоухость. Чтобы оценить чисто сенсоневральную кохлеарную дисфункцию, мы разработали экспериментальную модель травмы улитки, вызванной взрывом, на животных с использованием ударной волны, вызванной лазером. Этот метод позволяет избежать ТМП и сопутствующих системных повреждений и воспроизводит функциональное снижение компонента SNHL энергетически зависимым образом после воздействия LISW. Эта животная модель может стать платформой для выяснения патологических механизмов и изучения потенциальных методов лечения взрывной дисфункции улитки.

Введение

Потеря слуха и шум в ушах являются одними из наиболее распространенных видов инвалидности, о которых сообщается у 62% ветеранов1. Сообщалось о нескольких слуховых осложнениях, вызванных взрывом, включая сенсоневральную тугоухость (SNHL) и перфорацию барабанной перепонки (TMP), у лиц, подвергшихся воздействию взрывного избыточного давления2. Более того, исследования на людях, подвергшихся воздействию взрывной волны, показывают, что воздействие взрыва часто приводит к дефектам слухового временного разрешения, даже когда пороги слышимости находятся в пределах нормы, что известно как «скрытая потеря слуха (HHL)»3. Хорошо известно, что при бласт-ассоциированной патологии улитки происходит значительная потеря кохлеарных синапсов между внутренними волосковыми клетками (ИГХ) и слуховыми нейронами (АН)4. Синаптическая дегенерация приводит к нарушению слуховой обработки и является основным фактором, способствующим развитию HHL5. Таким образом, органы слуха являются хрупкими компонентами, содержащими сложные и высокоорганизованные структуры. Однако точный механизм, с помощью которого взрывные волны воздействуют на внутреннее ухо на клеточном уровне, остается неясным. Это связано с трудностями в воспроизведении точных клинических и механических сложностей взрывных травм в лабораторных условиях, а также со сложностью кохлеарных патологий, вызванных взрывом.

Основным компонентом взрывной травмы является ударная волна (SW), характеризующаяся быстрым и высоким повышением пиковогодавления6. Сложность взрывных травм была подробно изучена в многочисленных ретроспективных исследованиях 7,8,9. Существуют различные устройства для генерации взрыва, такие как сжатый газ10, ударные трубки11 и маломощные взрывчатые вещества12, при различных уровнях давления. Форма волны давления ПО, генерируемая недавно разработанными устройствами, очень напоминала форму реального взрыва. Важной концепцией в создании модели сенсоневральной тугоухости у животных является минимизация сопутствующих травм, отличных от повреждения слуха, для снижения смертности животных. Таким образом, были разработаны исследования взрывных травм, в которых ударные трубки были миниатюризированы, а выходная мощность может быть точно контролирована, чтобы животные, подвергшиеся воздействию, редко умирали. Однако, несмотря на то, что у этих животных моделей обычно развиваются осложнения, такие как ТМП, оценка функции улитки затруднена из-за сопутствующей кондуктивной тугоухости2. Ранее мы провели исследование травм от взрыва с использованием берушей на животных с использованием защитных ушей и не обнаружили случаев TMP13. Беруши могут частично ослаблять серьезное повреждение улитки, но не центральную слуховую нейродегенерацию или развитие тиннитуса. Таким образом, беруши защищают улитки, а также барабанную перепонку. Тем не менее, для изучения патофизиологии улитки, вызванной взрывными повреждениями, вызванными взрывными травмами, требуется животная модель чистого повреждения улитки без ТМП.

Ранее мы разработали модель топического взрывного повреждения внутреннего уха у крыс и мышей с использованием лазерно-индуцированной ударной волны (LISW)14,15. Этот метод может быть безопасно и легко выполнен на стандартном лабораторном уровне и использовался для создания моделей взрывных травм легких и головы16,17. Энергию LISW можно регулировать, изменяя тип и мощность лазера, что позволяет контролировать степень повреждения улитки. Модель LISW-индуцированной травмы улитки представляет ценность для изучения механизмов SNHL, вызванных взрывными травмами, и для изучения потенциальных методов лечения. В этом исследовании мы описываем подробные экспериментальные протоколы для создания мышиной модели бласт-индуцированного повреждения улитки с использованием LISW и демонстрируем дегенерацию улитки, включая потерю волосковых клеток (ГК), синапсов улитки и спиральных ганглиозных нейронов (SGN), энергетически зависимым образом у мышей после воздействия LISW.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа национальной обороны (одобрение #18050) и выполнены в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения и Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество животных и их страдания.

1. Животные

  1. Используйте 8-недельных самцов мышей CBA/J для соблюдения этого протокола. Перед экспериментом подвергните мышей тесту функции слуха и эндоскопическому наблюдению за барабанной перепонкой, чтобы убедиться в нормальном состоянии.
  2. Разделите 27 мышей CBA/J на три группы: (1) группа с дозой 2,0 Дж/см2 (n = 9 мышей); (2) 2,25 Дж/см2 облученная группа (n = 9 мышей); и (3) 2,5 Дж/см2 группы, подвергшейся воздействию (n = 9 мышей). Удалите все уши для оценки через 1 месяц после воздействия LISW.

2. Экспериментальные настройки экспозиции LISW

  1. Лазерная мишень представляет собой черный диск из натурального каучука диаметром 10 мм и толщиной 0,5 мм. Чтобы увеличить импульс LISW, используйте клей для сварки акриловой смолой, чтобы приклеить прозрачный лист полиэтилентерефталата (ПЭТ) толщиной 1,0 мм к верхней части целевой области. Облучите лазер Nd:YAG с модуляцией добротности 532 нм для генерации LISW позади цели (рис. 1A).
  2. Сфокусируйте лазерный импульс с помощью плоско-выпуклой линзы в пятно диаметром 3,0 мм на лазерной мишени.
  3. Используйте облучение LISW для генерации плазмы на поверхности соединения двух материалов и испарения резины (плазменно-опосредованная абляция), оставляя испарившуюся резину в полости.
  4. Используйте гидрофон для измерения волны давления LISW на глубине 1,0 мм под водой, а не в живых тканях. Поместите оптоволоконный гидрофон диаметром 0,25 мм под черную резину на глубине 1,0 мм ниже поверхности воды, чтобы записать формы волны давления LISW и измерить их с помощью цифрового осциллографа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формы волн давления показали стабильные характеристики при одинаковых максимальных давлении и импульсах, как показано на рисунке 1B.
  5. Выполнять все процедуры на животных под общей анестезией с использованием внутрибрюшинных инъекций 1 мг/кг медетомидина гидрохлорида и 75 мг/кг кетамина. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание и обеспечить тепловую поддержку.
  6. Тщательно брейте заушные области, чтобы избежать задержки воздуха в шерсти. Зафиксируйте мышей на пластине и расположите постаурикулярные области в фокальной области LISW в вертикальном направлении вверх.
  7. Приложите черную резиновую мишень чрескожно к заушной области уха мыши. Чтобы обеспечить согласование акустического импеданса, используйте ультразвуковой проводящий гель между лазерной мишенью и поверхностью кожи.
  8. Подайте один импульс LISW на улитку через височную кость. Установите выходы лазерных импульсов на три плотности энергии: 2,0 Дж/см2 , 2,25 Дж/см2 и 2,5 Дж/см2.

3. Тест кохлеарной функции

ПРИМЕЧАНИЕ: Тесты на слуховую реакцию ствола мозга (АБР) были выполнены, как сообщалось ранее14,15.

  1. Выполните измерение ABR за 1 день до и через 1 день и 1 месяц после воздействия LISW.
  2. ABR — это слуховой вызванный потенциал в ответ на слуховые стимулы и обычно используется для оценки порогов слышимости на четырех частотах (12,0 кГц, 16,0 кГц, 20,0 кГц и 24,0 кГц).
  3. Подайте стимулирующий звук через небольшой наушник и измерьте уровень звукового давления возле барабанной перепонки мыши с помощью небольшого микрофона, расположенного рядом с наушником. Выводите импульсные стимулы от генератора звука со скоростью 37 циклов/с и усиливайте звуковое давление с уровня звукового давления (SPL) 20 дБ до 80 дБ SPL с шагом 5 дБ SPL.
  4. Вставьте игольчатый электрод из нержавеющей стали для записи электроэнцефалограммы под слуховой проход и лобную область уха и вставьте заземляющий электрод под каудальную область хвоста.
  5. Оцените функции улитки, измерив амплитуду пика ABR I (P1). Автоматический анализ осциллограмм ABR в отношении порогов слышимости и амплитуды ABR P1 с помощью программного обеспечения для анализа пиков ABR, как сообщалось ранее18.
  6. Рассчитайте сдвиги пороговых значений ABR путем вычитания пороговых значений, полученных до воздействия. Сравните сдвиги пороговых значений ABR в трех облученных группах с таковыми в необнаженных контралатеральных ушах (контроль). Измерение амплитуд ABR с помощью формы сигнала ABR во время стимуляции звуковым уровнем 80 дБ.

4. Гистологическое исследование

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое исследование проводили, как описано ранее14,15.

  1. ГЦ и кохлеарный синапс
    1. Патологоанатомическое исследование улитки проводят через 1 месяц после воздействия LISW.
    2. Подтвердите глубину анестезии с помощью щипки пальца ноги перед перфузией. После гемоперфузии с раствором лактата Рингера проводят транскардиальную перфузию с 1 мл/г 4% параформальдегида (ПФА). После обезглавливания удалите улитку и перфузируйте непосредственно 4% PFA, с последующей фиксацией при 4 °C на ночь.
    3. После фиксации декальцифицируйте улитку, встряхивая в 0,5 моль/л растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 2 дней.
    4. Разделите деминерализованную улитку на четыре части. После замораживания каждого кусочка улитки на сухом льду в течение 10 мин проведите блокирование при комнатной температуре в течение 1 ч в 5% нормальной лошадиной сыворотке, просто конъюгированной с 0,3% Triton X для пермеабилизации.
    5. Используйте анти-миозин 7a (Myo7A), анти-C-концевой связывающий белок (CtBP2) и антитела против нейрофиламентов (NF) в качестве первичных антител и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Используйте антитела Myo7A, CtBP2 и NF для оценки HC, пресинаптических лент и волокон кохлеарного нерва соответственно.
    6. Смойте несвязанное первичное антитело фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 5 x 3 минут. Инкубируйте образцы с соответствующими вторичными антителами при 37 °C в течение 2 ч. После окрашивания промойте образцы в течение 3 x 5 минут PBS и инкапсулируйте образцы на предметное стекло водорастворимым инкапсулятором с использованием покровного стекла.
    7. Для оценки получите полное изображение улитки (разделенной на четыре части) с 10-кратным увеличением и рассчитайте карту частот улитки с помощью прилагаемого программного модуля ImageJ для точной локализации конкретных областей улитки на частотах 12,0 кГц, 16,0 кГц, 20,0 кГц и 24,0 кГц.
    8. Рассчитайте показатели выживаемости ГЦ и количество синапсов на каждой частоте.
      1. Чтобы рассчитать показатели выживаемости ГЦ, подсчитайте количество выживших и отсутствующих ГЦ на 200 мкм длины на каждой частоте и рассчитайте коэффициент выживаемости ГЦ с помощью уравнения (1), показанного ниже:
        Выживаемость УК (%) = (Количество выживших УК / Количество выживших и отсутствующих УК) × 100 (1)
      2. Для расчета количества синапсов необходимо получить z-stack-изображения внутренней области НЦ с высоким разрешением с помощью объектива масляной иммерсии (63×) с 3,1-кратным цифровым зумом и шагом 0,25 мкм при конфокальной флуоресцентной микроскопии. Импортируйте стеки изображений в ImageJ и автоматически подсчитайте CtBP2 точек на IHC в диапазоне 50 μм в каждом стеке изображений. Рассчитаем выживаемость синаптических лент с помощью уравнения (2):
        Выживаемость синаптических лент (%) = (Количество синаптических лент в открытых ушах LISW / Количество синаптических лент в контрольных ушах) × 100 (2)
    9. Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) удалите улитку, как описано ранее, а затем зафиксируйте 2% PFA и 2,5% глутаральдегидом вместе при 4 °C на ночь. После декальцинации улитки путем встряхивания в 0,5 моль/л раствора ЭДТА при температуре 4 °C в течение 7 дней рассеките улитки на четыре части для подготовки целиком.
    10. Зафиксируйте ткани 1% тетраоксидом осмия при температуре 4 °C на 30 мин, обезвоживайте в 50% этаноле при комнатной температуре в течение 10 мин, повторите с 70 %, 80 %, 95 %, а затем 100 % этанолом, распылите покрытие осмием и рассмотрите под электронным микроскопом при напряжении 5,0 кВ, как сообщалось ранее14.
    11. Проведите количественный анализ разрушения стереоцилиарного пучка в наружных волосковых клетках (ОНК) путем расчета соотношения нарушенных стереоцилий (количество нарушенных стереоцилий ОНК/общее число стереоцилий ОНК) в каждой энергетической группе с использованием изображений СЭМ14. Подсчитайте количество стереоцилий на 100 мкм в центре областей 16,0 и 24,0 кГц. Обозначьте один или несколько рядов пучков OHC, которые изогнуты к боковой стороне, запутаны или не имеют основания, как нарушенные.
  2. СГН
    1. Чтобы количественно оценить количество SGN через 1 месяц после воздействия LISW, выполните транскардиальную перфузию с 4% PBS, обезглавливайте, удалите улитку и выполните заднюю фиксацию в тех же условиях, которые описаны выше. Декальцинируйте улитку в 0,5 М ЭДТА в течение 1 недели.
    2. После декальцинации улитки погрузить на ночь в 30% сахарозу, погрузить их в криосекционный состав, заморозить в жидком азоте для получения срезов вблизи канала Розенталя толщиной 15 мкм, окрашивать гематоксилином и эозином и рассмотреть их под световым микроскопом14.
    3. Для измерения плотности SGN подсчитайте количество SGN в среднем повороте канала Розенталя и рассчитайте выживаемость SGN для каждого контроля.

5. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью выбранного программного обеспечения.
  2. Проанализируйте статистические различия в сдвиге порога ABR, HC, SGN и синаптическом подсчете с помощью двухфакторных повторяющихся измерений ANOVA ["частота или кохлеарные части (апикальные/средние/основание)" × "группы животных"], двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим множественным сравнением Тьюки.
  3. Представьте все данные в виде среднего ± стандартной ошибки и установите уровень статистической значимости на уровне p < 0,05.

Результаты

Форма волны LISW
Воспроизводимость формы сигнала давления LISW была измерена в 5 раз при 2,0 Дж/см2 следующим образом. Формы сигналов были в целом схожими и стабильными и демонстрировали резкое увеличение с временной широтой, пиковым давлением и импульсом 0,...

Обсуждение

Это исследование было направлено на валидацию мышиной модели взрывного повреждения улитки с использованием LISW. Наши результаты показали, что после введения LISW через височную кость у подвергшихся воздействию уха мышей наблюдалось последовательное патологическое и ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана двумя грантами от JSPS KAKENHI (номера грантов 21K09573 (K.M.) и 23K15901 (T.K.)).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
532 nm Q-switched Nd:YAG laser QuantelBrilliant b
ABR peak analysis softwareMass Eye and EarN/AEPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive Acrysunday Co., LtdN/A
confocal fluorescence microscopyLeicaTCS SP8
cryosectioning compoundSakuraTissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibodyBD Transduction#612044
Dielectric multilayer mirrorsSIGMAKOKI CO.,LTDTFMHP-50C08-532M1-M3
Digital oscilloscopeTektronixDPO4104B
EarphoneCUICDMG15008-03A
HydrophoneRP acoustics e.K.FOPH2000
Image J software plug-inNIHmeasurement linehttps://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscopeKeyence CorporationBZ-X700
Myosin 7A antibodyProteus Biosciences#25–6790 
Neurofilament antibodySigma#AB5539
Plano-convex lensSIGMAKOKI CO.,LTDSLSQ-30-200PM
Prism softwareGraphPadN/Aver.8.2.1
Scanning electron microscopeJEOL LtdJSM-6340F
Small digital endoscopeAVS Co. LtdAE-C1
Ultrasonic jellyHitachi Aloka MedicalN/A
Variable attenuatorShowa Optronics Co.N/ACurrenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant Dako#S1964

Ссылки

  1. Arun, P., et al. Blast exposure causes long-term degeneration of neuronal cytoskeletal elements in the cochlear nucleus: A potential mechanism for chronic auditory dysfunctions. Front Neurol. 12, 652190 (2021).
  2. Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Shiotani, A. Correlation of blast-induced tympanic membrane perforation with peripheral cochlear synaptopathy. J Neurotrauma. 39 (13-14), 999-1009 (2022).
  3. Liberman, M. C., Epstein, M. J., Cleveland, S. S., Wang, H., Maison, S. F. Toward a differential diagnosis of hidden hearing loss in humans. PLoS One. 11 (9), e0162726 (2016).
  4. Koizumi, Y., et al. Y-27632, a rock inhibitor, improved laser-induced shock wave (lisw)-induced cochlear synaptopathy in mice. Mol Brain. 14 (1), 105 (2021).
  5. Parthasarathy, A., Kujawa, S. G. Synaptopathy in the aging cochlea: Characterizing early-neural deficits in auditory temporal envelope processing. J Neurosci. 38 (32), 7108-7119 (2018).
  6. Kurioka, T., et al. Characteristics of laser-induced shock wave injury to the inner ear of rats. J Biomed Opt. 19 (12), 125001 (2014).
  7. Paik, C. B., Pei, M., Oghalai, J. S. Review of blast noise and the auditory system. Hear Res. 425, 108459 (2022).
  8. Bryden, D. W., Tilghman, J. I., Hinds, S. R. Blast-related traumatic brain injury: Current concepts and research considerations. J Exp Neurosci. 13, 1179069519872213 (2019).
  9. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  10. Shao, N., et al. Central and peripheral auditory abnormalities in chinchilla animal model of blast-injury. Hear Res. 407, 108273 (2021).
  11. Ou, Y., et al. Traumatic brain injury induced by exposure to blast overpressure via ear canal. Neural Regen Res. 17 (1), 115-121 (2022).
  12. Cho, S. I., et al. Mechanisms of hearing loss after blast injury to the ear. PLoS One. 8 (7), e67618 (2013).
  13. Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Kobayashi, Y., Shiotani, A. Blast-induced central auditory neurodegeneration affects tinnitus development regardless of peripheral cochlear damage. J Neurotrauma. , (2023).
  14. Niwa, K., et al. Pathophysiology of the inner ear after blast injury caused by laser-induced shock wave. Sci Rep. 6, 31754 (2016).
  15. Kimura, E., et al. Effect of shock wave power spectrum on the inner ear pathophysiology in blast-induced hearing loss. Sci Rep. 11 (1), 14704 (2021).
  16. Satoh, Y., et al. Pulmonary blast injury in mice: A novel model for studying blast injury in the laboratory using laser-induced stress waves. Lasers Surg Med. 42 (4), 313-318 (2010).
  17. Kawauchi, S., et al. Effects of isolated and combined exposure of the brain and lungs to a laser-induced shock wave(s) on physiological and neurological responses in rats. J Neurotrauma. 39 (21-22), 1533-1546 (2022).
  18. Cassinotti, L. R., et al. Cochlear neurotrophin-3 overexpression at mid-life prevents age-related inner hair cell synaptopathy and slows age-related hearing loss. Aging Cell. 21 (10), e13708 (2022).
  19. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: Cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  20. Hickman, T. T., Smalt, C., Bobrow, J., Quatieri, T., Liberman, M. C. Blast-induced cochlear synaptopathy in chinchillas. Sci Rep. 8 (1), 10740 (2018).
  21. Jiang, S., Sanders, S., Gan, R. Z. Hearing protection and damage mitigation in chinchillas exposed to repeated low-intensity blasts. Hear Res. 429, 108703 (2023).
  22. Nakagawa, A., et al. Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: Insights from shock-wave research. J Neurotrauma. 28 (6), 1101-1119 (2011).
  23. Wu, P. Z., Liberman, M. C. Age-related stereocilia pathology in the human cochlea. Hear Res. 422, 108551 (2022).
  24. Kurabi, A., Keithley, E. M., Housley, G. D., Ryan, A. F., Wong, A. C. Cellular mechanisms of noise-induced hearing loss. Hear Res. 349, 129-137 (2017).
  25. Kim, J., Xia, A., Grillet, N., Applegate, B. E., Oghalai, J. S. Osmotic stabilization prevents cochlear synaptopathy after blast trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (21), E4853-E4860 (2018).
  26. Hu, N., Rutherford, M. A., Green, S. H. Protection of cochlear synapses from noise-induced excitotoxic trauma by blockade of ca(2+)-permeable ampa receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3828-3838 (2020).
  27. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, e03564 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены