Seguimiento de la fibrinólisis de coágulos de sangre entera formados en bucle de Chandler bajo flujo de cizallamiento en un modelo de trombólisis in vitro

Resumen

Los ensayos de trombólisis in vitro a menudo han tenido dificultades para replicar condiciones in vivo, ya sea en el trombo modelo que se está digiriendo o en el entorno en el que se produce la trombólisis. En este artículo, exploramos cómo se utiliza el acoplamiento del bucle de Chandler y el ensayo de fibrinólisis fluorométrica de flujo en tiempo real (RT-FluFF) para el monitoreo de lisis de coágulos ex vivo de alta fidelidad.

Resumen

La tromboembolia y las complicaciones relacionadas son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, y se han desarrollado varios ensayos para probar la eficacia de los fármacos trombolíticos tanto in vitro como in vivo. Existe una creciente demanda de modelos de coágulos in vitro más relevantes fisiológicamente para el desarrollo de fármacos debido a la complejidad y el coste asociados a los modelos animales, además de su a menudo falta de traducibilidad a la fisiología humana. El flujo, la presión y la velocidad de cizallamiento son características importantes del sistema circulatorio, ya que los coágulos que se forman bajo flujo muestran una morfología y características de digestión diferentes a las de los coágulos formados estáticamente. Estos factores a menudo no están representados en los ensayos convencionales de digestión de coágulos in vitro , lo que puede tener implicaciones farmacológicas que afectan las tasas de éxito de la traducción de fármacos.

El ensayo Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinólisis (RT-FluFF) se desarrolló como una plataforma de pruebas de trombólisis de alta fidelidad que utiliza coágulos marcados con fluorescencia formados bajo flujo de cizallamiento, que luego se digieren utilizando plasma circulante en presencia o ausencia de agentes farmacéuticos fibrinolíticos. La modificación de las tasas de flujo de las etapas de formación y digestión de coágulos permite que el sistema imite las condiciones arteriales, pulmonares y venosas en configuraciones experimentales muy diversas. Las mediciones se pueden realizar de forma continua utilizando un fluorímetro en línea o tomando puntos de tiempo discretos, así como una medición convencional de la masa del coágulo en el punto final. El ensayo RT-FluFF es un sistema flexible que permite el seguimiento en tiempo real de la digestión de coágulos en condiciones de flujo que representan con mayor precisión las condiciones fisiológicas in vivo, al tiempo que conserva el control y la reproducibilidad de un sistema de pruebas in vitro.

Introducción

Las enfermedades derivadas fundamentalmente de etiologías tromboembólicas presentan una fuente importante de morbilidad y mortalidad en la sociedad actual. Las manifestaciones de la patogenia tromboembólica incluyen, entre otras, infartos de miocardio, accidentes cerebrovasculares isquémicos, trombosis venosas profundas y embolias pulmonares¹. Una enorme cantidad de investigación en curso, que abarca múltiples disciplinas, gira en torno al desarrollo de métodos seguros y eficaces para tratar la trombosis patógena. Las variaciones en las manifestaciones arteriales y venosas de la trombosis y las diferentes localizaciones anatómicas han dado luga....

Protocolo

Todos los métodos que se mencionan a continuación están de acuerdo con los protocolos de la junta de revisión institucional (IRB) y el comité institucional de ética de investigación en seres humanos. Todos los voluntarios sanos dieron su consentimiento escrito e informado antes de la donación de sangre. Cabe destacar que todos los materiales a los que se hace referencia en el protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Si bien el WB humano y el plasma se discuten a lo largo de este protocolo, el uso de sangre animal de investigación y productos sanguíneos con factor agotado se pueden comprar y sustituir.

....

Discusión

Formación de coágulos y etiquetado
Se ha demostrado que el asa de Chandler proporciona un medio fácil y eficaz para generar coágulos de forma reproducible que imitan los trombos in vivo ¹⁶. Los parámetros de ajuste fino, como el tamaño del tubo, las velocidades de rotación, el diámetro del tambor y el tiempo de coagulación, permiten la rápida generación de coágulos en diferentes condiciones de cizallamiento que pueden capturar las características arquitect.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,