Seguimiento de la fibrinólisis de coágulos de sangre entera formados en bucle de Chandler bajo flujo de cizallamiento en un modelo de trombólisis in vitro

Resumen

Los ensayos de trombólisis in vitro a menudo han tenido dificultades para replicar condiciones in vivo, ya sea en el trombo modelo que se está digiriendo o en el entorno en el que se produce la trombólisis. En este artículo, exploramos cómo se utiliza el acoplamiento del bucle de Chandler y el ensayo de fibrinólisis fluorométrica de flujo en tiempo real (RT-FluFF) para el monitoreo de lisis de coágulos ex vivo de alta fidelidad.

Resumen

La tromboembolia y las complicaciones relacionadas son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, y se han desarrollado varios ensayos para probar la eficacia de los fármacos trombolíticos tanto in vitro como in vivo. Existe una creciente demanda de modelos de coágulos in vitro más relevantes fisiológicamente para el desarrollo de fármacos debido a la complejidad y el coste asociados a los modelos animales, además de su a menudo falta de traducibilidad a la fisiología humana. El flujo, la presión y la velocidad de cizallamiento son características importantes del sistema circulatorio, ya que los coágulos que se forman bajo flujo muestran una morfología y características de digestión diferentes a las de los coágulos formados estáticamente. Estos factores a menudo no están representados en los ensayos convencionales de digestión de coágulos in vitro , lo que puede tener implicaciones farmacológicas que afectan las tasas de éxito de la traducción de fármacos.

El ensayo Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinólisis (RT-FluFF) se desarrolló como una plataforma de pruebas de trombólisis de alta fidelidad que utiliza coágulos marcados con fluorescencia formados bajo flujo de cizallamiento, que luego se digieren utilizando plasma circulante en presencia o ausencia de agentes farmacéuticos fibrinolíticos. La modificación de las tasas de flujo de las etapas de formación y digestión de coágulos permite que el sistema imite las condiciones arteriales, pulmonares y venosas en configuraciones experimentales muy diversas. Las mediciones se pueden realizar de forma continua utilizando un fluorímetro en línea o tomando puntos de tiempo discretos, así como una medición convencional de la masa del coágulo en el punto final. El ensayo RT-FluFF es un sistema flexible que permite el seguimiento en tiempo real de la digestión de coágulos en condiciones de flujo que representan con mayor precisión las condiciones fisiológicas in vivo, al tiempo que conserva el control y la reproducibilidad de un sistema de pruebas in vitro.

Introducción

Las enfermedades derivadas fundamentalmente de etiologías tromboembólicas presentan una fuente importante de morbilidad y mortalidad en la sociedad actual. Las manifestaciones de la patogenia tromboembólica incluyen, entre otras, infartos de miocardio, accidentes cerebrovasculares isquémicos, trombosis venosas profundas y embolias pulmonares¹. Una enorme cantidad de investigación en curso, que abarca múltiples disciplinas, gira en torno al desarrollo de métodos seguros y eficaces para tratar la trombosis patógena. Las variaciones en las manifestaciones arteriales y venosas de la trombosis y las diferentes localizaciones anatómicas han dado lugar al desarrollo de diferentes enfoques de tratamiento. Sin embargo, el tratamiento agudo generalmente se basa en el uso de trombólisis farmacológica a través de activadores del plasminógeno con el potencial de trombectomía mecánica en ciertas circunstancias clínicas².

El desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento farmacológico se basa fundamentalmente tanto en modelos animales in vivo como en modelos de digestión in vitro para ensayos preclínicos ^3,4. Los modelos in vivo se benefician naturalmente de su capacidad para capturar la compleja interacción de varios parámetros fisiológicos en la eficacia del tratamiento, que incluyen la eliminación de agentes farmacéuticos, así como las interacciones celulares con los fármacos. Sin embargo, esta misma complejidad a menudo hace que estos modelos sean bastante costosos e introduce problemas adicionales cuando se intenta aislar la farmacodinámica/cinética subyacente en animales que difieren significativamente de la fisiología humana. El desarrollo de modelos in vitro ha ayudado al facilitar un entorno de prueba destilado en el que se puede realizar el desarrollo y la detección de fármacos, pero a menudo carece de la fidelidad necesaria para recapitular el estado de la enfermedad que se está estudiando.

Los protocolos in vitro comúnmente encontrados para probar nuevos trombolíticos se basan en la utilización de coágulos formados y lisados en condiciones estáticas, en las que la masa residual del coágulo sirve como criterio de valoración primario ^5,6. Desafortunadamente, estas técnicas no tienen en cuenta los aspectos mecánicos de la lisis de coágulos, como el flujo turbulento y las caídas de presión transtrombos, que pueden alterar significativamente la farmacodinámica de los fármacos de prueba. Además, los coágulos formados en condiciones estáticas contienen una microarquitectura que difiere de los coágulos fisiológicos. Se ha demostrado de manera reproducible que la presencia de cizallamiento durante la formación de coágulos afecta las características del coágulo resultante, como la activación plaquetaria y la reticulación de fibrina. Los coágulos que se producen bajo el flujo de cizallamiento exhiben una heterogeneidad compleja desde la punta hasta la cola que está ausente en los coágulos formados estáticamente ^7,8. Tales desviaciones de la arquitectura fisiológica del coágulo pueden afectar a una importante caracterización del desarrollo de fármacos que incluye la penetración del fármaco dentro de un trombo y la posterior eficiencia de la lisis⁹.

Para abordar algunas de estas limitaciones asociadas con el uso de modelos estáticos de coagulación/lisis de coágulos, la adopción del bucle de Chandler tanto para la formación de coágulos como para la lisis de coágulos en presencia de cizallamiento ha experimentado un resurgimiento¹⁰. Aunque estos sistemas permiten una mejor representación de la dinámica de flujo y generan coágulos con una arquitectura fisiológicamente más relevante en comparación con los ensayos relativamente estáticos, sus condiciones de flujo simplificadas siguen representando una desviación de las condiciones fisiológicas. Por último, también se han llevado a cabo abordajes microfluídicos debido a su facilidad de obtención de imágenes y patrones de flujo uniformes; Sin embargo, siguen siendo una remoción significativa de las condiciones fisiológicas esperadas dentro de los vasos más grandes afectados principalmente en la mayoría de los trastornos tromboembólicos clínicamente relevantes^11,12.

Teniendo en cuenta la discusión anterior, desarrollamos un modelo de trombólisis in vitro de alta fidelidad para el cribado preclínico de fármacos trombolíticos. El modelo tiene como objetivo abordar algunos de los escollos actuales detallados anteriormente en el ámbito del cribado de nuevas terapias trombolíticas y se validó la reproducibilidad y la sensibilidad a diferentes concentraciones del activador tisular del plasminógeno (tPA). El sistema descrito en este documento ofrece flujos de cizallamiento fisiológicos que utilizan una bomba peristáltica, un amortiguador de presión, un depósito calentado, dos sensores de presión, un fluorómetro en línea y un análogo de coágulo formado por cizallamiento en bucle de Chandler marcado con fluorescencia para facilitar el seguimiento en tiempo real de la fibrinólisis¹³. En conjunto, el sistema general se denomina ensayo de fibrinólisis fluorométrica de flujo en tiempo real (ensayo RT-FluFF)¹⁴ y este manuscrito analizará las complejidades de la configuración y ejecución exitosas de ensayos en este modelo de trombólisis in vitro de alta fidelidad.

Protocolo

Todos los métodos que se mencionan a continuación están de acuerdo con los protocolos de la junta de revisión institucional (IRB) y el comité institucional de ética de investigación en seres humanos. Todos los voluntarios sanos dieron su consentimiento escrito e informado antes de la donación de sangre. Cabe destacar que todos los materiales a los que se hace referencia en el protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Si bien el WB humano y el plasma se discuten a lo largo de este protocolo, el uso de sangre animal de investigación y productos sanguíneos con factor agotado se pueden comprar y sustituir.

1. Extracción de sangre completa

1. Recolectar sangre entera venosa (WB) de voluntarios sanos que dieron su consentimiento utilizando técnicas estándar de flebotomía.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que se sigan las precauciones universales para reducir el riesgo de contacto con sangre u otros materiales potencialmente infecciosos a lo largo de este protocolo. Es necesario el uso de guantes, una bata de laboratorio y un protector facial.
2. Recoja ~ 50 mL de WB directamente en tubos de citrato de sodio al 3.2% e inmediatamente acumule en tubos de 50 mL para su uso posterior.
   NOTA: Es necesario desechar el tubo antes de la extracción de sangre en el tubo de citrato, además de asegurarse de que los tubos se llenen hasta el volumen recomendado por el fabricante. Los WB recién recolectados recapitularán mejor la dinámica de coagulación del huésped. Se permite el almacenamiento a corto plazo de WB a temperatura ambiente (≤4 h antes de su uso). El WB no se almacena durante la noche, ya que se ha demostrado que afecta la dinámica de la coagulación cuando se examina mediante tromboelastografía¹⁵.

2. Formación de coágulos

1. En 3 mL de sangre entera citrada, añadir fibrinógeno marcado con fluorescencia (isotiocianato de fluoresceína [FITC]) hasta una concentración final de 60 μg/mL (relación entre fibrinógeno marcado con fluorescencia y fibrinógeno no modificado a partir de 1:50, suponiendo una concentración de fibrinógeno plasmático endógeno de 3 mg/mL).
   NOTA: Esta relación se puede aumentar hasta 1:10 con un impacto mínimo en la morfología del coágulo. ^13,14 El fibrinógeno marcado con fluorescencia puede comprarse o generarse haciendo reaccionar el fibrinógeno con el isotiocianato de fluoresceína (FITC). La mezcla de fibrinógeno debe realizarse ≤5 minutos antes de que comience la carrera.
   1. Si el fibrinógeno se había alícuota y congelado previamente, inspeccione el FITC-Fg descongelado para asegurarse de que la polimerización no haya comenzado prematuramente, lo que lo inutilice (asegúrese de la ausencia de partículas o fibras en la solución).
2. Prepare la configuración del bucle Chandler con un tambor de 120 mm de diámetro en un baño de agua a 37 °C (Figura 1). Asegúrese de que el dispositivo de bucle Chandler sea capaz de girar a una velocidad de rotación fija de 0 a 90 rpm durante todo el proceso de formación de coágulos.
   NOTA: La configuración y las modificaciones adicionales del bucle de Chandler se pueden encontrar en Zeng et al.¹⁶ de la Constitución.
3. Corte el tubo (diámetro interno 5/32", diámetro exterior 7/32") y forme bucles que se ajusten firmemente pero no apretados alrededor del tambor. Para el tamaño de tubo recomendado que se discute aquí, corte un tubo PCR estándar de 200 μL para usarlo como accesorio para conectar los extremos del tubo para formar el circuito cerrado.
   NOTA: Se pueden utilizar diferentes tamaños de tubería para producir coágulos de diferentes tamaños¹⁶.
4. Inicie la coagulación de la sangre agregando 200 mM de solución de cloruro de calcio en una proporción de solución de calcio 1:17 a sangre completa. Cargue la sangre en el tubo (llene ~ 50% del volumen del tubo) con una jeringa de 3 ml. Coloque inmediatamente el bucle en el tambor de bucle Chandler conectando los extremos y comience la rotación.
   1. Asegure una mezcla adecuada con una inversión suave antes de cargar para evitar cualquier problema derivado de la sedimentación de los componentes de WB.
   2. Asegúrese de que se agregue una cantidad igual de sangre a cada tubo en cada ejecución, ya que esto puede afectar el tamaño del coágulo si no se mantiene constante.
   3. Como las burbujas dentro de la columna de sangre también pueden afectar la coagulación de la sangre, elimínelas moviendo suavemente el tubo en forma de "balancín" para facilitar el escape de las burbujas antes de cargarlas en el tambor.
5. Gire el tambor parcialmente sumergido en el baño de agua a una velocidad de rotación de 40 RPM para lograr una tasa de cizallamiento calculada de ~ 450 ^s-1.
   NOTA: Consulte Zeng et al. para obtener información sobre las cizallas calculadas en función del tamaño del tubo y la velocidad de rotación (20 a 60 RPM)¹⁶. Las tasas típicas de cizallamiento venoso y arterial son de 20-200 ^s-1 y 300-1.000 ^s-1, respectivamente, siendo ~400-500 ^s-1 representativo de la arteria pulmonar.
6. Deje que se formen coágulos durante 40-60 minutos en condiciones de poca luz para minimizar el fotoblanqueo del fibrinógeno marcado con fluorescencia.
7. Una vez alcanzado el tiempo de coagulación deseado, retire los coágulos del tubo y utilícelos inmediatamente. Para asegurar la eliminación suave de los coágulos sin comprometer la estructura, invierta suavemente el tubo para permitir que el coágulo se deslice lentamente fuera del tubo hacia un recipiente pequeño.
   NOTA: El almacenamiento de los coágulos formados en plasma citrato o PBS durante la noche a 4 °C puede afectar el análisis posterior de la digestión de coágulos en el circuito de flujo.

3. Configuración del instrumento RT-FluFF

1. Asegúrese de que el aparato de circuito de flujo esté conectado como se ve en la Figura 2 y que todas las conexiones estén seguras. En resumen, el aparato de bucle de flujo incluye, en el orden de la dirección del flujo: Bomba > amortiguador > sensor de presión de entrada > > sensor de presión de salida > fluorómetro > depósito calentado > bomba. Ajuste la selección de la capacidad de la bomba, el caudal experimental, el diámetro y la longitud de la tubería, la temperatura, el volumen del depósito y el tamaño/geometría del coágulo para adaptarse a las necesidades experimentales únicas de cada estudio.
   NOTA: Para este ejemplo, el tubo del mismo diámetro utilizado en el bucle de Chandler se utilizó para RT-FluFF. El tubo se puede usar para varios recorridos en el mismo día, pero debe monitorearse para detectar degradación o fugas y cambiarse / enjuagarse según sea necesario. Se recomienda enjuagar con agua destilada tibia entre pasadas. Dependiendo del diseño experimental, puede ser necesario reemplazar la tubería después de cada ejecución.
2. Una vez que todos los tubos estén asegurados, encienda el monitor de presión. Compruebe que el monitor de presión marque 0 mmHg tanto para el sensor de entrada como para el de salida. Si no es así, abra las válvulas para asegurarse de que los sensores de presión estén abiertos a la presión atmosférica y ponga a cero los sensores.
3. Encienda el bloque calefactor o el baño de agua que se esté utilizando y controle la temperatura durante el transcurso del experimento. Mantenga la temperatura cerca de 37 °C para imitar la temperatura fisiológica del cuerpo humano.
4. Encienda la bomba al caudal deseado para comprobar si hay fugas y verificar que los sensores de presión estén funcionando.
   NOTA: Un caudal de ~160 mL/min en este tamaño de tubería representará un caudal de cizallamiento de ~500 ^s-1.
5. Apague la bomba para facilitar la carga de coágulos.

4. Carga del coágulo en el circuito de flujo

1. Si se está utilizando un coágulo previamente hecho que se almacenó, asegúrese de llevar el coágulo a temperatura ambiente antes de cargarlo en el sistema de circuito de flujo.
2. La pérdida de masa del coágulo es una medición importante del criterio de valoración para los ensayos de trombólisis. Es una buena práctica medir la masa del coágulo justo antes de cargarlo en el circuito de flujo en lugar de confiar en mediciones anteriores.
   1. Las mediciones de la masa del coágulo siempre deben realizarse de la misma manera cada vez para garantizar la consistencia en todas las muestras y en los días de ensayo, ya que el contenido de líquido dentro y sobre los coágulos puede afectar significativamente su masa. La mejor práctica es secar suavemente los coágulos en las toallitas de laboratorio hasta que ya no liberen una cantidad significativa de líquido en la toallita, teniendo cuidado de no comprimir el coágulo durante todo el proceso de medición.
3. Sumerja el coágulo en el plasma (autólogo o de tipo equivalente) u otra solución de fase móvil utilizada en el circuito de flujo (como PBS o medios definidos) en un recipiente poco profundo, como un plato de pesaje. La solución de fase móvil debe tomarse directamente del depósito del sistema de 50 ml para controlar el volumen total del sistema. No debe haber ningún agente de prueba trombolítico o farmacéutico durante la etapa de carga del coágulo. Se recomienda que el volumen total de la fase móvil para ejecutar el bucle de flujo sea de ≥50 mL y debe ser consistente en todas las muestras.
4. Retire la sección central del tubo del circuito de flujo (entre los sensores de entrada y salida) y conecte una jeringa de 10 ml a un extremo del tubo.
5. Usando el extremo libre del tubo, colóquelo en el plasma (o fase móvil) y tome un pequeño volumen de la solución para cebar el tubo. Luego, coloque la entrada del tubo cerca del coágulo, examinando cuidadosamente el coágulo para identificar la cabeza (generalmente el extremo ligeramente más grueso del coágulo) y la cola (extremo opuesto a la cabeza). La cabeza del coágulo debe colocarse hacia el sensor de presión de entrada y lejos de la salida. Coloque el tubo en el extremo de la "cola" del coágulo y aspire en el tubo con la jeringa.
   NOTA: en los casos en que la direccionalidad de la cabeza del coágulo / cola no se puede determinar visualmente, la direccionalidad se puede asignar mejor en función de conocer la dirección de rotación del bucle de Chandler: la cabeza del coágulo está orientada en la dirección opuesta a la rotación del tambor.
6. Vuelva a conectar el tubo al aparato principal de modo que el coágulo esté más cerca del sensor de presión de salida (la cabeza del coágulo debe estar en dirección opuesta al sensor de salida). Asegure el coágulo en su posición perforando el tubo y la cabeza del coágulo con dos agujas de 30 G en forma de "X". Deja estas agujas puestas durante toda la carrera.
   NOTA: Dependiendo de la configuración del amortiguador y la bomba, es posible que se necesiten agujas adicionales para garantizar que el coágulo no se fragmente prematuramente. Si es necesario, se puede agregar una pantalla a la tubería aguas abajo del coágulo para evitar que los fragmentos del coágulo circulen en el sistema. Una vez que se haya establecido un número determinado de agujas para sostener el coágulo, manténgalo constante en todas las condiciones.
7. Tome el resto de la solución de fase móvil y colóquela en un tubo de 50 ml como depósito.
8. Coloque el depósito en el baño de agua y coloque la tubería de entrada y salida (la salida es del fluorímetro y la entrada entra en el cabezal de la bomba).
9. Verifique que el fluorómetro que se está utilizando esté conectado y monitoreado. Compruebe que el valor inicial es adecuado en comparación con una línea base de sistema móvil de solo fase al comienzo del experimento.
   NOTA: Si no se dispone de un fluorómetro en línea, se puede realizar un muestreo periódico en serie del yacimiento a intervalos definidos durante todo el período de análisis del bucle de flujo. Las fracciones recolectadas se pueden leer utilizando una placa de 96 pocillos inmediatamente después de la finalización del experimento en cualquier espectrofotómetro disponible comercialmente.
10. Añada 500 μL de 100.000 ng/mL de tPA directamente al volumen del depósito para lograr una concentración final de 1.000 ng/mL de tPA en 50 mL. El volumen, la concentración y el fármaco específico añadido dependerán de la concentración circulante objetivo deseada y del volumen del depósito del sistema.
11. Compruebe lo siguiente antes de poner en marcha la bomba:
    1. Todos los cruces son seguros.
    2. Las dos válvulas sobre los sensores de presión están en la posición cerrada adecuada.
    3. Cualquier plasma (o fluido) residual ha sido reemplazado en el depósito.
    4. El trombolítico se ha añadido al depósito y se ha mezclado adecuadamente.
    5. El tubo de entrada está cerca del fondo del depósito (esto asegura un mínimo de burbujas).
    6. La tubería de salida está segura y a la altura adecuada para la presión deseada (dependiendo de la ubicación del recipiente que se esté modelando).
    7. La dirección de rotación de la bomba es correcta (Orden de flujo: Bomba > amortiguador > coágulo > fluorómetro > depósito > bomba).
    8. Si las RPM de la bomba están configuradas muy altas (>150 rpm), comience a una velocidad más lenta y aumente para asegurarse de que el cambio rápido de presión no fragmente el coágulo ni provoque fugas en la tubería.
    9. Asegúrese de que el sistema esté registrando adecuadamente los datos del fluorímetro y/o de que los suministros estén preparados para el muestreo periódico de la fase móvil para las lecturas de puntos de tiempo posteriores al experimento.
12. Encienda la bomba y configúrela para lograr el caudal volumétrico deseado de 160 mL/min o aumente el caudal hasta alcanzar la presión deseada. El sistema se llenará de líquido y burbujas. Las burbujas elevarán artificialmente las lecturas fluorométricas, así que esté atento a que las burbujas se eliminen. Una vez que lo hagan, apague las luces y comience la adquisición de datos.
13. Deje la bomba en funcionamiento hasta que el coágulo se degrade significativamente o haya transcurrido el tiempo experimental deseado (≥60 min). Agregue reactivos, según sea necesario, al sistema a lo largo del experimento a través del depósito para crear condiciones experimentales únicas que prueben una variedad de variaciones trombolíticas.
    NOTA: El tiempo experimental dependerá del caudal de la bomba (nivel de cizallamiento) y de la concentración de trombolítico.
14. Una vez que se haya completado el ensayo, reduzca el caudal volumétrico y retire la tubería de entrada mientras la bomba aún está funcionando para empujar la mayor parte del fluido del sistema hacia el depósito (alguna fase móvil permanecerá en la tubería). Desconecte la sección del tubo que contiene coágulos en el lado del sensor de presión de salida del tubo y bájelo en un bote de pesaje.
15. Retire las agujas que mantienen el coágulo en su lugar para recoger el líquido remanente del interior del sistema y los fragmentos de coágulo/coágulo. Use una jeringa para ayudar a limpiar el sistema según sea necesario.
16. Pesar y procesar el coágulo restante para análisis adicionales, como el cálculo del porcentaje de masa perdida o para la histología.

5. Limpieza del sistema

1. Entre muestras, enjuague todo el sistema con agua tibia a altas rpm (>150 rpm). Cargue el agua en el depósito y pásela por el sistema durante al menos 2 minutos, vacíela y vuelva a correr durante dos enjuagues completos del sistema. Después de estos enjuagues, si la lectura del fluorímetro no vuelve a la línea de base, repita el proceso de enjuague durante un ciclo adicional. Si aún no ha vuelto a la línea de base, cambie completamente el tubo antes de analizar la siguiente muestra.
   NOTA: Durante los experimentos, los tubos se pueden reutilizar entre muestras; Sin embargo, debido a la perforación con agujas utilizadas para mantener el coágulo en su lugar, la sección del tubo entre los sensores de presión de entrada y salida debe reemplazarse después de cada ejecución. En algunas condiciones experimentales, puede ser necesario reemplazar todo el conjunto de tubos después de cada ejecución o realizar ensayos de agrupamiento para eliminar cualquier contaminación cruzada de la muestra.
2. Después de que se hayan ejecutado todas las muestras para la experimentación de ese día, retire todos los tubos y deséchelos. Frote las uniones en T con agua caliente y un cepillo de cerdas hasta que estén limpias y déjelas secar y enjuague los amortiguadores de jeringas con agua caliente. Use 70% de EtOH para ayudar con la esterilidad.

Resultados

Formación de coágulos en bucle de Chandler
Al formar coágulos, generalmente apuntamos a los cuadruplicados para asegurarnos de que, si existían valores atípicos de coágulos (basados en la morfología macroscópica y la masa), aún teníamos la capacidad de realizar ensayos de trombólisis por triplicado. Suponiendo condiciones de carga óptimas, todos los coágulos deben ser bastante uniformes en longitud (~3,3 cm), peso (~100 mg) y apariencia, como se representa en la Figur...

Discusión

Formación de coágulos y etiquetado
Se ha demostrado que el asa de Chandler proporciona un medio fácil y eficaz para generar coágulos de forma reproducible que imitan los trombos in vivo ¹⁶. Los parámetros de ajuste fino, como el tamaño del tubo, las velocidades de rotación, el diámetro del tambor y el tiempo de coagulación, permiten la rápida generación de coágulos en diferentes condiciones de cizallamiento que pueden capturar las características arquitect...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,