Monitoraggio della fibrinolisi di coaguli di sangue intero formati ad ansa di Chandler sotto flusso di taglio in un modello di trombolisi in vitro

Riepilogo

I test di trombolisi in vitro hanno spesso faticato a replicare le condizioni in vivo, sia nel trombo modello da digerire che nell'ambiente in cui si verifica la trombolisi. In questo articolo, esploriamo come l'accoppiamento del ciclo di Chandler e del saggio di fibrinolisi a flusso fluorimetrico in tempo reale (RT-FluFF) viene utilizzato per il monitoraggio della lisi del coagulo ex-vivo ad alta fedeltà.

Abstract

Il tromboembolismo e le complicanze correlate sono una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo e sono stati sviluppati vari test per testare l'efficacia dei farmaci trombolitici sia in vitro che in vivo. C'è una crescente domanda di modelli di coaguli in vitro fisiologicamente più rilevanti per lo sviluppo di farmaci a causa della complessità e del costo associati ai modelli animali, oltre alla loro spesso mancanza di traducibilità nella fisiologia umana. Il flusso, la pressione e la velocità di taglio sono caratteristiche importanti del sistema circolatorio, con coaguli che si formano sotto il flusso che mostrano caratteristiche morfologiche e digestive diverse rispetto ai coaguli formati staticamente. Questi fattori sono spesso non rappresentati nei saggi convenzionali in vitro di digestione dei coaguli, che possono avere implicazioni farmacologiche che influiscono sui tassi di successo della traduzione dei farmaci.

Il test Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) è stato sviluppato come piattaforma di test della trombolisi ad alta fedeltà che utilizza coaguli marcati in fluorescenza formati sotto flusso di taglio, che vengono poi digeriti utilizzando plasma circolante in presenza o assenza di agenti farmaceutici fibrinolitici. La modifica delle velocità di flusso sia delle fasi di formazione del coagulo che di digestione del coagulo consente al sistema di imitare le condizioni arteriose, polmonari e venose in configurazioni sperimentali molto diverse. Le misurazioni possono essere effettuate in modo continuo utilizzando un fluorimetro in linea o prendendo punti temporali discreti, nonché una misurazione convenzionale della massa del coagulo del punto finale. Il test RT-FluFF è un sistema flessibile che consente il monitoraggio in tempo reale della digestione del coagulo in condizioni di flusso che rappresentano in modo più accurato le condizioni fisiologiche in vivo, pur mantenendo il controllo e la riproducibilità di un sistema di test in vitro.

Introduzione

Le malattie che derivano fondamentalmente da eziologie tromboemboliche rappresentano una delle principali fonti di morbilità e mortalità nella società odierna. Le manifestazioni della patogenesi trombo-embolica includono, ma non sono limitate a, infarti del miocardio, ictus ischemici, trombosi venose profonde ed emboli polmonari¹. Un'enorme quantità di ricerca in corso, che abbraccia più discipline, ruota attorno allo sviluppo di metodi sicuri ed efficaci per affrontare la trombosi patogena. Le variazioni nelle manifestazioni arteriose e venose della trombosi e le diverse sedi anatomiche hanno portato allo sviluppo di diversi approcci terapeutici. Tuttavia, il trattamento acuto si basa generalmente sull'uso della trombolisi farmacologica tramite attivatori del plasminogeno con il potenziale di trombectomia meccanica in determinate circostanze cliniche².

Lo sviluppo di nuove strategie di trattamento farmacologico si basa fondamentalmente sia su modelli animali in vivo che su modelli di digestione in vitro per i test preclinici ^3,4. I modelli in vivo beneficiano naturalmente della loro capacità di catturare la complessa interazione di vari parametri fisiologici sull'efficacia del trattamento, che includono l'eliminazione degli agenti farmaceutici e le interazioni cellulari con i farmaci. Tuttavia, questa stessa complessità rende spesso tali modelli piuttosto costosi e introduce ulteriori problemi quando si tenta di isolare le farmacodinamiche/cinetiche sottostanti negli animali che differiscono significativamente dalla fisiologia umana. Lo sviluppo di modelli in vitro ha contribuito facilitando un ambiente di test distillato in cui lo sviluppo e lo screening dei farmaci possono essere eseguiti, ma spesso manca della fedeltà necessaria per ricapitolare lo stato della malattia oggetto di studio.

I protocolli in vitro comunemente presenti per testare nuovi trombolitici si basano sull'utilizzo di coaguli formati e lisati in condizioni statiche, in cui la massa residua del coagulo funge da endpoint primario ^5,6. Sfortunatamente, tali tecniche non tengono conto degli aspetti meccanici della lisi del coagulo, come il flusso turbolento e le cadute di pressione trans-trombo che possono alterare significativamente la farmacodinamica dei farmaci in esame. Inoltre, i coaguli formati in condizioni statiche contengono una microarchitettura che differisce dai coaguli fisiologici. È stato dimostrato che la presenza di taglio durante la formazione del coagulo influisce in modo riproducibile sulle caratteristiche del coagulo risultanti, come l'attivazione piastrinica e la reticolazione della fibrina. I coaguli prodotti sotto flusso di taglio mostrano una complessa eterogeneità dalla punta alla coda che è assente nei coaguli formati staticamente ^7,8. Tali deviazioni dall'architettura fisiologica del coagulo possono influire su un'importante caratterizzazione dello sviluppo di farmaci che include la penetrazione del farmaco all'interno di un trombo e la successiva efficienza della lisi⁹.

Per affrontare alcune di queste limitazioni associate all'uso di modelli statici di coagulazione/lisi del coagulo, l'adozione del ciclo di Chandler sia per la formazione del coagulo che per la lisi del coagulo in presenza di taglio ha visto una rinascita¹⁰. Sebbene tali sistemi consentano una migliore rappresentazione della dinamica del flusso e generino coaguli con un'architettura fisiologicamente più rilevante rispetto ai saggi relativamente statici, le loro condizioni di flusso semplificate rappresentano ancora una deviazione dalle condizioni fisiologiche. Infine, sono stati intrapresi anche approcci microfluidici grazie alla loro facilità di imaging e ai modelli di flusso uniformi; tuttavia, rimangono una significativa rimozione dalle condizioni fisiologiche attese all'interno dei vasi più grandi principalmente colpiti nella maggior parte dei disturbi tromboembolici clinicamente rilevanti^11,12.

Tenendo presente la discussione di cui sopra, abbiamo sviluppato un modello di trombolisi in vitro ad alta fedeltà per lo screening preclinico dei farmaci trombolitici. Il modello mira ad affrontare alcune delle attuali insidie descritte sopra nell'ambito dello screening di nuove terapie trombolitiche ed è stato convalidato per la riproducibilità e la sensibilità a concentrazioni variabili dell'attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Il sistema qui descritto offre flussi di taglio fisiologici utilizzando una pompa peristaltica, uno smorzatore di pressione, un serbatoio riscaldato, due sensori di pressione, un fluorimetro in linea e un analogo del coagulo formato da taglio ad anello Chandler etichettato in fluorescenza per facilitare il monitoraggio in tempo reale della fibrinolisi¹³. Nel complesso, l'intero sistema è chiamato Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolilysis Assay (RT-FluFF Assay)¹⁴ e questo manoscritto discuterà le complessità dell'impostazione e dell'esecuzione di test di successo in questo modello di trombolisi in vitro ad alta fedeltà.

Protocollo

Tutti i metodi menzionati di seguito sono conformi ai protocolli dell'Institutional Review Board (IRB) e al comitato etico istituzionale per la ricerca umana. Tutti i volontari sani hanno fornito il consenso scritto e informato prima della donazione di sangue. Da notare che tutti i materiali a cui si fa riferimento all'interno del protocollo sono disponibili nella Tabella dei materiali. Mentre il WB e il plasma umano sono discussi in questo protocollo, l'uso di sangue animale da ricerca e di emoderivati impoveriti di fattori può essere acquistato e sostituito.

1. Prelievo di sangue intero

1. Raccogliere sangue intero venoso (WB) da volontari sani consenzienti utilizzando tecniche di flebotomia standard.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che vengano seguite le precauzioni universali per ridurre il rischio di contatto con sangue o altri materiali potenzialmente infettivi durante questo protocollo. È necessario l'uso di guanti, camice da laboratorio e visiera.
2. Raccogliere ~50 mL di WB direttamente in provette di citrato di sodio al 3,2% e raccoglierle immediatamente in provette da 50 mL per un uso successivo.
   NOTA: È necessaria una provetta di smaltimento prima del prelievo del sangue nella provetta di citrato, oltre a garantire che le provette siano riempite al volume raccomandato dal produttore. Il WB appena raccolto ricapitolerà al meglio le dinamiche di coagulazione dell'ospite. È consentita la conservazione a breve termine del WB a temperatura ambiente (≤4 ore prima dell'uso). Il WB non viene conservato durante la notte poiché è stato dimostrato che influisce sulla dinamica della coagulazione quando esaminato tramite tromboelastografia¹⁵.

2. Formazione di coaguli

1. In 3 mL di sangue intero cittrato, aggiungere fibrinogeno marcato con fluorescenza (isotiocianato di fluoresceina [FITC]) (FITC-Fg) a una concentrazione finale di 60 μg/mL (rapporto tra fibrinogeno marcato in fluorescenza 1:50 e fibrinogeno non modificato assumendo una concentrazione di fibrinogeno plasmatico endogeno di 3 mg/mL).
   NOTA: Questo rapporto può essere aumentato fino a 1:10 con un impatto minimo sulla morfologia del coagulo. ^13,14 Il fibrinogeno marcato in fluorescenza può essere acquistato o generato facendo reagire il fibrinogeno con l'isotiocianato di fluoresceina (FITC). La miscelazione del fibrinogeno deve essere eseguita ≤5 minuti prima dell'inizio della corsa.
   1. Se il fibrinogeno è stato precedentemente aliquotato e congelato, ispezionare il FITC-Fg scongelato per assicurarsi che la polimerizzazione non sia iniziata prematuramente, rendendolo così inutilizzabile (assicurarsi dell'assenza di particolato o fibre nella soluzione).
2. Preparare la configurazione Chandler loop con un tamburo di 120 mm di diametro in un bagno d'acqua a 37 °C (Figura 1). Assicurarsi che il dispositivo ad anello Chandler sia in grado di ruotare a una velocità di rotazione fissa di 0-90 giri/min durante l'intero processo di formazione del coagulo.
   NOTA: Ulteriori impostazioni e modifiche del ciclo di Chandler possono essere trovate in Zeng et al.¹⁶.
3. Tagliare il tubo (diametro interno 5/32", diametro esterno 7/32") e formare anelli che si adattino saldamente ma non strettamente attorno al tamburo. Per le dimensioni consigliate del tubo discusse qui, tagliare una provetta PCR standard da 200 μL da utilizzare come raccordo per collegare le estremità del tubo per formare il circuito chiuso.
   NOTA: È possibile utilizzare tubi di diverse dimensioni per produrre coaguli di dimensioni diverse¹⁶.
4. Iniziare la coagulazione del sangue aggiungendo 200 mM di soluzione di cloruro di calcio in un rapporto di soluzione di calcio 1:17 per sangue intero. Caricare il sangue nel tubo (riempire ~50% del volume del tubo) utilizzando una siringa da 3 ml. Posizionare immediatamente l'anello sul tamburo ad anello Chandler collegando le estremità e iniziare la rotazione.
   1. Garantire una miscelazione adeguata con un'inversione delicata prima del caricamento per evitare problemi derivanti dall'assestamento dei componenti WB.
   2. Assicurarsi che venga aggiunta una quantità uguale di sangue a ciascuna provetta a ogni corsa, in quanto ciò può influire sulla dimensione del coagulo se non viene mantenuta costante.
   3. Poiché anche le bolle all'interno della colonna di sangue possono influire sulla coagulazione del sangue, rimuoverle muovendo delicatamente il tubo in modo "altalenante" per facilitare la fuoriuscita delle bolle prima di caricarle sul tamburo.
5. Ruotare il tamburo parzialmente immerso nel bagno d'acqua a una velocità di rotazione di 40 giri/min per ottenere una velocità di taglio calcolata di ~450 ^s-1.
   NOTA: Fare riferimento a Zeng et al. per informazioni sulle cesoie calcolate in base alle dimensioni del tubo e alla velocità di rotazione (da 20 a 60 giri/min)¹⁶. Le tipiche frequenze di taglio venoso e arterioso sono rispettivamente di 20-200 ^s-1 e 300-1.000 ^s-1, con ~400-500 ^s-1 rappresentativo dell'arteria polmonare.
6. Lasciare che si formino coaguli per 40-60 minuti in condizioni di scarsa illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento del fibrinogeno marcato con fluorescenza.
7. Dopo aver raggiunto il tempo di coagulazione desiderato, rimuovere i coaguli dal tubo e utilizzarli immediatamente. Per garantire una rimozione delicata dei coaguli senza compromettere la struttura, capovolgere delicatamente il tubo per consentire al coagulo di scivolare lentamente fuori dal tubo in un piccolo contenitore.
   NOTA: La conservazione dei coaguli formati nel plasma citrato o nel PBS durante la notte a 4 °C può influire sulla successiva analisi della digestione dei coaguli nel ciclo di flusso.

3. Configurazione dello strumento RT-FluFF

1. Assicurarsi che l'apparato ad anello di flusso sia collegato come mostrato nella Figura 2 e che tutti i collegamenti siano sicuri. In breve, l'apparato ad anello di flusso comprende, nell'ordine della direzione del flusso: pompa > smorzatore > sensore di pressione in ingresso > sensore di pressione in uscita > coagulo > fluorimetro > serbatoio riscaldato > pompa. Regolare la selezione della capacità della pompa, della portata sperimentale, del diametro e della lunghezza del tubo, della temperatura, del volume del serbatoio e della dimensione/geometria del coagulo in base alle esigenze sperimentali uniche di ogni studio.
   NOTA: Per questo esempio, per RT-FluFF è stato utilizzato lo stesso diametro del tubo utilizzato nel circuito Chandler. Il tubo può essere utilizzato per più corse nello stesso giorno, ma deve essere monitorato per verificare la presenza di degrado o perdite e sostituito/risciacquato secondo necessità. Si consiglia di risciacquare con acqua distillata tiepida tra una corsa e l'altra. A seconda del progetto sperimentale, potrebbe essere necessario sostituire il tubo dopo ogni corsa.
2. Una volta fissati tutti i tubi, accendere il monitor della pressione. Verificare che il misuratore di pressione indichi 0 mmHg sia per i sensori di ingresso che di uscita. In caso contrario, aprire le valvole per assicurarsi che i sensori di pressione siano aperti alla pressione atmosferica e azzerare i sensori.
3. Accendi il blocco riscaldante o il bagno d'acqua in uso e monitora la temperatura nel corso dell'esperimento. Mantenere la temperatura vicino a 37 °C per imitare la temperatura fisiologica del corpo umano.
4. Accendere la pompa alla portata desiderata per verificare la presenza di perdite e verificare che i sensori di pressione funzionino.
   NOTA: Una velocità di flusso di ~160 mL/min in questa dimensione del tubo rappresenterà una velocità di taglio di ~500 ^s-1.
5. Spegnere la pompa per facilitare il caricamento del coagulo.

4. Caricamento del coagulo nel circuito di flusso

1. Se viene utilizzato un coagulo precedentemente prodotto che è stato conservato, assicurarsi di portare il coagulo a temperatura ambiente prima di caricarlo nel sistema ad anello di flusso.
2. La perdita di massa del coagulo è un'importante misura del punto finale per i test di trombolisi. È buona norma misurare la massa del coagulo appena prima di caricarlo nel circuito di flusso, invece di fare affidamento su misurazioni precedenti.
   1. Le misurazioni della massa del coagulo devono essere eseguite sempre allo stesso modo ogni volta per garantire la coerenza tra i campioni e tra i giorni di analisi, poiché il contenuto di liquido all'interno e sui coaguli può influire in modo significativo sulla loro massa. La migliore pratica consiste nel tamponare delicatamente i coaguli sulle salviette da laboratorio fino a quando non rilasciano più una quantità significativa di liquido sulla salvietta, facendo attenzione a non comprimere il coagulo durante il processo di misurazione.
3. Immergere il coagulo nel plasma (autologo o di tipo corrispondente) o in un'altra soluzione in fase mobile utilizzata nel circuito di flusso (come PBS o mezzi definiti) in un contenitore poco profondo come un piatto di pesata. La soluzione in fase mobile deve essere prelevata direttamente dal serbatoio del sistema da 50 ml per controllare il volume totale del sistema. Nessun agente di test trombolitico o farmaceutico deve essere presente durante la fase di caricamento del coagulo. Si raccomanda che il volume totale della fase mobile per l'esecuzione del ciclo di flusso sia di ≥50 mL e che sia costante in tutti i campioni.
4. Rimuovere la sezione centrale del tubo dell'anello di flusso (tra i sensori di ingresso e di uscita) e collegare una siringa da 10 ml a un'estremità del tubo.
5. Utilizzando l'estremità libera del tubo, posizionarlo nel plasma (o fase mobile) e prelevare un piccolo volume di soluzione per adescare il tubo. Quindi posizionare l'ingresso del tubo vicino al coagulo, esaminando attentamente il coagulo per identificare la testa (in genere l'estremità leggermente più spessa del coagulo) e la coda (estremità opposta alla testa). La testa del coagulo deve essere posizionata verso il sensore di pressione di ingresso e lontano dall'uscita. Posizionare il tubo all'estremità "coda" del coagulo e aspirarlo nel tubo con la siringa.
   NOTA: nei casi in cui la direzionalità della testa/coda del coagulo non può essere determinata visivamente, la direzionalità può essere assegnata al meglio in base alla conoscenza del senso di rotazione dall'anello di Chandler: la testa del coagulo è rivolta nella direzione opposta alla rotazione del tamburo.
6. Ricollegare il tubo all'apparecchio principale in modo che il coagulo sia il più vicino possibile al sensore di pressione di uscita (la testa del coagulo deve essere rivolta lontano dal sensore di uscita). Fissare il coagulo nella sua posizione perforando il tubo e la testa del coagulo con due aghi da 30 G a "X". Lascia questi aghi per tutta la durata della corsa.
   NOTA: A seconda delle impostazioni dello smorzatore e della pompa, potrebbero essere necessari aghi aggiuntivi per garantire che il coagulo non si framprenda prematuramente. Se necessario, è possibile aggiungere uno schermo al tubo a valle del coagulo per evitare che frammenti di coagulo circolino nel sistema. Una volta stabilito un determinato numero di aghi per trattenere il coagulo, mantenerlo costante in tutte le condizioni.
7. Prendere il resto della soluzione in fase mobile e metterla in una provetta da 50 mL come serbatoio.
8. Posizionare il serbatoio nel bagnomaria e inserire i tubi di ingresso e uscita (l'uscita proviene dal fluorimetro e l'ingresso entra nella testa della pompa).
9. Verificare che il fluorimetro in uso sia collegato e monitorato. Verificare che il valore iniziale sia appropriato rispetto a una linea di base del sistema mobile di sola fase all'inizio dell'esperimento.
   NOTA: Se non è disponibile un fluorimetro in linea, è possibile eseguire il campionamento periodico seriale del serbatoio a intervalli definiti durante il periodo di analisi del ciclo di flusso. Le frazioni raccolte possono essere lette utilizzando una piastra a 96 pozzetti immediatamente dopo il completamento dell'esperimento su qualsiasi spettrofotometro disponibile in commercio.
10. Aggiungere 500 μl di 100.000 ng/mL di tPA direttamente al volume del serbatoio per ottenere una concentrazione finale di 1.000 ng/mL di tPA in 50 mL. Il volume, la concentrazione e il farmaco specifico aggiunto dipenderanno dalla concentrazione circolante target desiderata e dal volume del serbatoio del sistema.
11. Controllare quanto segue prima di avviare la pompa:
    1. Tutti gli incroci sono sicuri.
    2. Le due valvole sopra i sensori di pressione si trovano nella posizione di chiusura appropriata.
    3. L'eventuale residuo di plasma (o fluido) è stato sostituito nel serbatoio.
    4. Il trombolitico è stato aggiunto al serbatoio e miscelato correttamente.
    5. Il tubo di ingresso si trova vicino al fondo del serbatoio (questo garantisce bolle minime).
    6. Il tubo di uscita è sicuro e all'altezza appropriata per la pressione desiderata (a seconda della posizione del recipiente che viene modellata).
    7. Il senso di rotazione della pompa è corretto (ordine di flusso: pompa > smorzatore > coagulo > fluorimetro > serbatoio > pompa).
    8. Se i giri della pompa sono impostati su un valore molto alto (>150 giri/min), avviare a una velocità inferiore e aumentare la rampa per garantire che la rapida variazione di pressione non frammenti il coagulo o causi perdite dai tubi.
    9. Assicurarsi che il sistema registri i dati in modo appropriato dal fluorimetro e/o che i materiali di consumo siano preparati per il campionamento periodico della fase mobile per le letture dei punti temporali post-esperimento.
12. Accendere la pompa e impostarla in modo da raggiungere la portata volumetrica desiderata di 160 ml/min o aumentare la portata fino a raggiungere la pressione desiderata. Il sistema si riempirà di liquido e bolle. Le bolle aumenteranno artificialmente le letture fluorometriche, quindi fai attenzione che le bolle si liberino. Una volta fatto, spegni le luci e inizia l'acquisizione dei dati.
13. Lasciare la pompa in funzione fino a quando il coagulo non si è degradato in modo significativo o non è trascorso il tempo sperimentale desiderato (≥60 min). Aggiungere reagenti, se necessario, al sistema durante l'esperimento attraverso il serbatoio per creare condizioni sperimentali uniche che testano una varietà di variazioni trombolitiche.
    NOTA: Il tempo sperimentale dipenderà dalla portata della pompa (livello di taglio) e dalla concentrazione di trombolitico.
14. Una volta completato il saggio, ridurre la portata volumetrica e rimuovere il tubo di ingresso mentre la pompa è ancora in funzione per spingere la maggior parte del fluido nel sistema nel serbatoio (una parte della fase mobile rimarrà nel tubo). Scollegare la sezione del tubo contenente coaguli sul lato del sensore di pressione di uscita del tubo e abbassarla in una barca di pesatura.
15. Rimuovere gli aghi che tengono il coagulo in posizione per raccogliere il liquido residuo dall'interno del sistema e i frammenti di coagulo/coagulo. Utilizzare una siringa per aiutare a pulire il sistema secondo necessità.
16. Pesare ed elaborare il coagulo rimanente per ulteriori analisi, come il calcolo della percentuale di massa persa o per l'istologia.

5. Pulizia del sistema

1. Tra un campione e l'altro, sciacquare l'intero sistema con acqua tiepida ad un numero di giri elevato (>150 giri/min). Caricare l'acqua nel serbatoio e far scorrere il sistema per almeno 2 minuti, svuotare e ripetere per due risciacqui completi del sistema. Dopo questi risciacqui, se la lettura del fluorimetro non torna alla linea di base, ripetere il processo di risciacquo per un ulteriore ciclo. Se non è ancora tornato al basale, sostituire completamente il tubo prima di analizzare il campione successivo.
   NOTA: Durante gli esperimenti, i tubi possono essere riutilizzati tra i campioni; Tuttavia, a causa della perforazione con aghi utilizzati per tenere il coagulo in posizione, la sezione del tubo tra i sensori di pressione di ingresso e uscita deve essere sostituita dopo ogni corsa. In alcune condizioni sperimentali, potrebbe essere necessario sostituire l'intero set di tubi dopo ogni corsa o saggi di clustering per eliminare qualsiasi contaminazione incrociata del campione.
2. Dopo che tutti i campioni sono stati analizzati per l'esperimento di quel giorno, rimuovere tutti i tubi e gettarli. Strofinare i raccordi a T con acqua calda e una spazzola a setole fino a renderli puliti e lasciare asciugare e sciacquare gli smorzatori della siringa con acqua calda. Usa il 70% di EtOH per aiutare con la sterilità.

Risultati

Formazione di coaguli ad ansa di Chandler
Nella formazione dei coaguli, in genere abbiamo mirato ai quadruplicati per garantire che, se esistevano valori anomali del coagulo (in base alla morfologia e alla massa grossolana), avessimo ancora la capacità di eseguire saggi di trombolisi triplicata. Supponendo condizioni di carico ottimali, i coaguli dovrebbero essere tutti abbastanza uniformi in lunghezza (~3,3 cm), peso (~100 mg) e aspetto, come rappresentato nella Figura 3

Discussione

Formazione e marcatura del coagulo
È stato dimostrato che l'ansa di Chandler fornisce un mezzo semplice ed efficace per generare in modo riproducibile coaguli che imitano i trombi 16 in vivo. Parametri di messa a punto come le dimensioni del tubo, la velocità di rotazione, il diametro del tamburo e il tempo di coagulazione consentono la rapida generazione di coaguli in diverse condizioni di taglio in grado di catturare caratteristiche architettoniche apprezzate in un...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,