Monitoraggio della fibrinolisi di coaguli di sangue intero formati ad ansa di Chandler sotto flusso di taglio in un modello di trombolisi in vitro

Riepilogo

I test di trombolisi in vitro hanno spesso faticato a replicare le condizioni in vivo, sia nel trombo modello da digerire che nell'ambiente in cui si verifica la trombolisi. In questo articolo, esploriamo come l'accoppiamento del ciclo di Chandler e del saggio di fibrinolisi a flusso fluorimetrico in tempo reale (RT-FluFF) viene utilizzato per il monitoraggio della lisi del coagulo ex-vivo ad alta fedeltà.

Abstract

Il tromboembolismo e le complicanze correlate sono una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo e sono stati sviluppati vari test per testare l'efficacia dei farmaci trombolitici sia in vitro che in vivo. C'è una crescente domanda di modelli di coaguli in vitro fisiologicamente più rilevanti per lo sviluppo di farmaci a causa della complessità e del costo associati ai modelli animali, oltre alla loro spesso mancanza di traducibilità nella fisiologia umana. Il flusso, la pressione e la velocità di taglio sono caratteristiche importanti del sistema circolatorio, con coaguli che si formano sotto il flusso che mostrano caratteristiche morfologiche e digestive diverse rispetto ai coaguli formati staticamente. Questi fattori sono spesso non rappresentati nei saggi convenzionali in vitro di digestione dei coaguli, che possono avere implicazioni farmacologiche che influiscono sui tassi di successo della traduzione dei farmaci.

Il test Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) è stato sviluppato come piattaforma di test della trombolisi ad alta fedeltà che utilizza coaguli marcati in fluorescenza formati sotto flusso di taglio, che vengono poi digeriti utilizzando plasma circolante in presenza o assenza di agenti farmaceutici fibrinolitici. La modifica delle velocità di flusso sia delle fasi di formazione del coagulo che di digestione del coagulo consente al sistema di imitare le condizioni arteriose, polmonari e venose in configurazioni sperimentali molto diverse. Le misurazioni possono essere effettuate in modo continuo utilizzando un fluorimetro in linea o prendendo punti temporali discreti, nonché una misurazione convenzionale della massa del coagulo del punto finale. Il test RT-FluFF è un sistema flessibile che consente il monitoraggio in tempo reale della digestione del coagulo in condizioni di flusso che rappresentano in modo più accurato le condizioni fisiologiche in vivo, pur mantenendo il controllo e la riproducibilità di un sistema di test in vitro.

Introduzione

Le malattie che derivano fondamentalmente da eziologie tromboemboliche rappresentano una delle principali fonti di morbilità e mortalità nella società odierna. Le manifestazioni della patogenesi trombo-embolica includono, ma non sono limitate a, infarti del miocardio, ictus ischemici, trombosi venose profonde ed emboli polmonari¹. Un'enorme quantità di ricerca in corso, che abbraccia più discipline, ruota attorno allo sviluppo di metodi sicuri ed efficaci per affrontare la trombosi patogena. Le variazioni nelle manifestazioni arteriose e venose della trombosi e le diverse sedi anatomiche hanno portato allo sviluppo di diversi approcci terapeuti....

Protocollo

Tutti i metodi menzionati di seguito sono conformi ai protocolli dell'Institutional Review Board (IRB) e al comitato etico istituzionale per la ricerca umana. Tutti i volontari sani hanno fornito il consenso scritto e informato prima della donazione di sangue. Da notare che tutti i materiali a cui si fa riferimento all'interno del protocollo sono disponibili nella Tabella dei materiali. Mentre il WB e il plasma umano sono discussi in questo protocollo, l'uso di sangue animale da ricerca e di emoderivati impoveriti di fattori può essere acquistato e sostituito.

1. Prelievo di sangue intero

1. Raccogli....

Discussione

Formazione e marcatura del coagulo
È stato dimostrato che l'ansa di Chandler fornisce un mezzo semplice ed efficace per generare in modo riproducibile coaguli che imitano i trombi 16 in vivo. Parametri di messa a punto come le dimensioni del tubo, la velocità di rotazione, il diametro del tamburo e il tempo di coagulazione consentono la rapida generazione di coaguli in diverse condizioni di taglio in grado di catturare caratteristiche architettoniche apprezzate in un.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,