Verfolgung der Fibrinolyse von Chandler-Schleifen-gebildeten Vollblutgerinnseln unter Scherströmung in einem In-vitro-Thrombolysemodell

Zusammenfassung

In-vitro-Thrombolyse-Assays haben oft Schwierigkeiten, In-vivo-Bedingungen zu replizieren, sei es im Modellthrombus, der verdaut wird, oder in der Umgebung, in der die Thrombolyse stattfindet. Im Folgenden untersuchen wir, wie die Kopplung des Chandler-Loops und des Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) für eine hochgenaue Ex-vivo-Überwachung der Gerinnsellyse verwendet wird.

Zusammenfassung

Thromboembolien und damit verbundene Komplikationen sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität, und es wurden verschiedene Assays entwickelt, um die Wirksamkeit thrombolytischer Arzneimittel sowohl in vitro als auch in vivo zu testen. Die Nachfrage nach physiologisch relevanteren In-vitro-Gerinnselmodellen für die Arzneimittelentwicklung steigt aufgrund der Komplexität und der Kosten, die mit Tiermodellen verbunden sind, sowie ihrer oft fehlenden Übertragbarkeit auf die Humanphysiologie. Strömung, Druck und Schergeschwindigkeit sind wichtige Eigenschaften des Kreislaufsystems, wobei Gerinnsel, die unter Fluss gebildet werden, eine andere Morphologie und Verdauungseigenschaften aufweisen als statisch gebildete Gerinnsel. Diese Faktoren sind in herkömmlichen In-vitro-Assays für den Gerinnselverdau oft nicht vertreten, was pharmakologische Implikationen haben kann, die sich auf die translationalen Erfolgsraten von Arzneimitteln auswirken.

Der Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) Assay wurde als High-Fidelity-Thrombolyse-Testplattform entwickelt, bei der fluoreszenzmarkierte Gerinnsel verwendet werden, die unter Scherfluss gebildet und dann mit zirkulierendem Plasma in Gegenwart oder Abwesenheit von fibrinolytischen pharmazeutischen Wirkstoffen verdaut werden. Die Modifikation der Flussraten sowohl der Gerinnselbildung als auch der Gerinnselverdauungsschritte ermöglicht es dem System, arterielle, pulmonale und venöse Erkrankungen in sehr unterschiedlichen Versuchsanordnungen zu imitieren. Die Messungen können kontinuierlich mit einem Inline-Fluorometer oder durch Messung diskreter Zeitpunkte sowie mit einer herkömmlichen Endpunkt-Gerinnselmassenmessung durchgeführt werden. Der RT-FluFF-Assay ist ein flexibles System, das die Echtzeit-Verfolgung des Gerinnselverdaus unter Flussbedingungen ermöglicht, die die physiologischen Bedingungen in vivo genauer darstellen und gleichzeitig die Kontrolle und Reproduzierbarkeit eines In-vitro-Testsystems beibehalten.

Einleitung

Krankheiten, die im Wesentlichen auf thromboembolische Ätiologien zurückzuführen sind, stellen in der heutigen Gesellschaft eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität dar. Zu den Manifestationen der thromboembolischen Pathogenese gehören unter anderem Myokardinfarkte, ischämische Schlaganfälle, tiefe Venenthrombosen und Lungenembolien¹. Ein enormer Teil der laufenden Forschung, die sich über mehrere Disziplinen erstreckt, dreht sich um die Entwicklung sicherer und wirksamer Methoden für den Umgang mit pathogenen Thrombosen. Unterschiedliche arterielle und venöse Manifestationen der Thrombose und unterschiedliche anatomische Lokalisationen haben zur Entwicklung unterschiedlicher Behandlungsansätze geführt. Die Akutbehandlung beruht jedoch im Allgemeinen auf dem Einsatz einer pharmakologischen Thrombolyse über Plasminogenaktivatoren, die unter bestimmten klinischen Umständen eine mechanische Thrombektomie ermöglichen^{können 2}.

Die Entwicklung neuartiger pharmakologischer Behandlungsstrategien stützt sich grundsätzlich sowohl auf In-vivo-Tiermodelle als auch auf In-vitro-Verdauungsmodelle für die präklinische Erprobung ^3,4. In-vivo-Modelle profitieren natürlich von ihrer Fähigkeit, das komplexe Zusammenspiel verschiedener physiologischer Parameter auf die Wirksamkeit der Behandlung zu erfassen, einschließlich der Clearance von pharmazeutischen Wirkstoffen sowie zellulärer Wechselwirkungen mit Arzneimitteln. Dieselbe Komplexität macht solche Modelle jedoch oft recht kostspielig und führt zu zusätzlichen Problemen beim Versuch, die zugrunde liegende Pharmakodynamik/Kinetik bei Tieren zu isolieren, die sich erheblich von der menschlichen Physiologie unterscheidet. Die Entwicklung von In-vitro-Modellen hat dazu beigetragen, dass eine destillierte Testumgebung ermöglicht wurde, in der die Entwicklung und das Screening von Arzneimitteln durchgeführt werden können, die jedoch oft nicht die erforderliche Genauigkeit aufweisen, um den untersuchten Krankheitszustand zu rekapitulieren.

Häufig anzutreffende In-vitro-Protokolle zur Erprobung neuartiger Thrombolytika beruhen auf der Verwendung von Gerinnseln, die unter statischen Bedingungen gebildet und lysiert werden, wobei die verbleibende Gerinnselmasse als primärer Endpunkt dient ^5,6. Leider berücksichtigen solche Techniken nicht die mechanischen Aspekte der Gerinnsellyse, wie z. B. turbulente Strömung und transthrombusische Druckabfälle, die die Pharmakodynamik von Testmedikamenten erheblich verändern können. Darüber hinaus enthalten Gerinnsel, die unter statischen Bedingungen gebildet werden, eine Mikroarchitektur, die sich von physiologischen Gerinnseln unterscheidet. Es wurde reproduzierbar gezeigt, dass das Vorhandensein von Scherung während der Gerinnselbildung die resultierenden Gerinnseleigenschaften wie Thrombozytenaktivierung und Fibrinvernetzung beeinflusst. Gerinnsel, die unter Scherströmung erzeugt werden, weisen eine komplexe Heterogenität von der Spitze bis zum Ende auf, die bei statisch gebildeten Gerinnseln nicht vorhanden ist ^7,8. Solche Abweichungen von der physiologischen Gerinnselarchitektur können sich auf die Charakterisierung wichtiger Arzneimittelentwicklungen auswirken, die die Wirkstoffpenetration innerhalb eines Thrombus und die anschließende Lyseeffizienz umfassen⁹.

Um einige dieser Einschränkungen im Zusammenhang mit der Verwendung von statischen Gerinnungs-/Gerinnungslysemodellen zu beheben, hat die Einführung der Chandler-Schleife sowohl für die Gerinnselbildung als auch für die Gerinnsellyse in Gegenwart von Scherung ein Wiederaufleben erlebt¹⁰. Obwohl solche Systeme eine bessere Darstellung der Strömungsdynamik ermöglichen und Gerinnsel mit einer physiologisch relevanteren Architektur im Vergleich zu relativ statischen Assays erzeugen, stellen ihre vereinfachten Strömungsbedingungen immer noch eine Abweichung von den physiologischen Bedingungen dar. Schließlich wurden auch mikrofluidische Ansätze aufgrund ihrer einfachen Bildgebung und ihrer gleichmäßigen Strömungsmuster verfolgt. Sie bleiben jedoch eine signifikante Entfernung von den physiologischen Bedingungen, die bei den größeren Gefäßen erwartet werden, die hauptsächlich von den meisten klinisch relevanten thromboembolischen Erkrankungen betroffen sind^11,12.

Vor dem Hintergrund der obigen Diskussion haben wir ein hochgenaues In-vitro-Thrombolysemodell für das präklinische Thrombolytik-Screening entwickelt. Das Modell zielt darauf ab, einige der oben beschriebenen aktuellen Fallstricke im Bereich des neuartigen thrombolytischen Therapie-Screenings zu beheben und wurde auf Reproduzierbarkeit und Sensitivität bei unterschiedlichen Konzentrationen von Gewebeplasminogenaktivator (tPA) validiert. Das hierin beschriebene System bietet physiologische Scherströmungen unter Verwendung einer Peristaltikpumpe, eines Druckdämpfers, eines beheizten Reservoirs, zweier Drucksensoren, eines Inline-Fluorometers und eines fluoreszenzmarkierten Chandler-Schleifen-schergebildeten Gerinnselanalogons, um die Echtzeitverfolgung der Fibrinolyse¹³ zu erleichtern. Zusammengenommen wird das Gesamtsystem als Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)¹⁴ bezeichnet, und in diesem Manuskript werden die Feinheiten der erfolgreichen Einrichtung und Durchführung von Assays in diesem hochpräzisen In-vitro-Thrombolysemodell erörtert.

Protokoll

Alle unten genannten Methoden stehen in Übereinstimmung mit den Protokollen des Institutional Review Board (IRB) und der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung. Alle gesunden Freiwilligen gaben vor der Blutspende eine schriftliche und informierte Einverständniserklärung ab. Zu beachten ist, dass alle Materialien, auf die im Protokoll verwiesen wird, in der Materialtabelle zu finden sind. Während humaner WB und Plasma in diesem Protokoll diskutiert werden, kann die Verwendung von Forschungstierblut und faktorentleerten Blutprodukten gekauft und ersetzt werden.

1. Vollblutentnahme

1. Entnehmen Sie venöses Vollblut (WB) von einwilligenden gesunden Freiwilligen unter Verwendung von Standard-Phlebotomietechniken.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass universelle Vorsichtsmaßnahmen befolgt werden, um das Risiko des Kontakts mit Blut oder anderen potenziell infektiösen Materialien während dieses Protokolls zu verringern. Das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel und einem Gesichtsschutz ist erforderlich.
2. Sammeln Sie ~50 mL WB direkt in 3,2 % Natriumcitrat-Röhrchen und füllen Sie sie sofort in 50 mL Röhrchen zur späteren Verwendung.
   HINWEIS: Vor der Blutentnahme in das Citratröhrchen ist eine Entsorgung des Röhrchens erforderlich, zusätzlich zur Sicherstellung, dass die Röhrchen auf das vom Hersteller empfohlene Volumen gefüllt sind. Frisch gesammelter WB rekapituliert am besten die Gerinnungsdynamik des Wirts. Eine kurzfristige Lagerung von WB bei Raumtemperatur (≤4 h vor der Verwendung) ist zulässig. WB wird nicht über Nacht gelagert, da sich bei der Untersuchung mittels Thromboelastographie gezeigt hat, dass dies die Gerinnungsdynamik beeinflusst¹⁵.

2. Bildung von Gerinnseln

1. In 3 ml citriertes Vollblut wird fluoreszierendes (Fluorescein-Isothiocyanat [FITC]) markiertes Fibrinogen (FITC-Fg) bis zu einer Endkonzentration von 60 μg/ml gegeben (Verhältnis von 1:50 fluoreszierend markiertem Fibrinogen zu unmodifiziertem Fibrinogen unter der Annahme einer endogenen Plasmafibrinogenkonzentration von 3 mg/ml).
   HINWEIS: Dieses Verhältnis kann auf bis zu 1:10 erhöht werden, mit minimalen Auswirkungen auf die Gerinnselmorphologie. ^13,14 Fluoreszenzmarkiertes Fibrinogen kann gekauft oder durch Reaktion von Fibrinogen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) erzeugt werden. Das Fibrinogen-Mischen sollte ≤5 Minuten vor Beginn des Laufs erfolgen.
   1. Wenn Fibrinogen zuvor aliquotiert und eingefroren wurde, ist das aufgetaute FITC-Fg zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Polymerisation nicht vorzeitig begonnen hat und dadurch unbrauchbar wird (stellen Sie sicher, dass die Lösung keine Partikel oder Fasern enthält).
2. Bereiten Sie das Chandler-Loop-Setup mit einer Trommel mit einem Durchmesser von 120 mm in einem 37 °C-Wasserbad vor (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass sich die Chandler-Schlaufe während des gesamten Gerinnselbildungsprozesses mit einer festen Drehzahl von 0-90 U/min drehen kann.
   HINWEIS: Weitere Einstellungen und Modifikationen der Chandler-Schleife finden Sie in Zeng et al.¹⁶. Urheberrecht
3. Schneiden Sie die Schläuche ab (Innendurchmesser 5/32", Außendurchmesser 7/32") und formen Sie Schlaufen, die fest, aber nicht fest um die Trommel passen. Schneiden Sie für die hier besprochene empfohlene Schlauchgröße ein Standard-PCR-Röhrchen mit 200 μl ab, das als Anschluss verwendet wird, um die Enden des Schlauchs zu verbinden, um den geschlossenen Kreislauf zu bilden.
   HINWEIS: Unterschiedliche Schlauchgrößen können verwendet werden, um Klumpen unterschiedlicher Größe^{zu erzeugen 16}.
4. Initiieren Sie die Blutgerinnung, indem Sie 200 mM Calciumchloridlösung in einem Verhältnis von 1:17 Calciumlösung zum Vollblut hinzufügen. Laden Sie das Blut mit einer 3-ml-Spritze in den Schlauch (füllen Sie ~50% des Schlauchvolumens). Platzieren Sie die Schlaufe sofort auf der Chandler-Schlauftrommel, die die Enden verbindet, und beginnen Sie mit der Drehung.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Mischen vor dem Laden ordnungsgemäß mit sanfter Inversion durchgeführt wird, um Probleme zu vermeiden, die sich aus dem Absetzen der WB-Komponenten ergeben.
   2. Stellen Sie sicher, dass jedem Röhrchen bei jedem Lauf die gleiche Menge Blut zugesetzt wird, da dies die Gerinnselgröße beeinflussen kann, wenn es nicht konstant gehalten wird.
   3. Da Blasen in der Blutsäule auch die Blutgerinnung beeinflussen können, entfernen Sie sie, indem Sie den Schlauch vorsichtig in einer "Wippe" bewegen, um das Entweichen der Blasen zu erleichtern, bevor Sie sie auf die Trommel laden.
5. Drehen Sie die Trommel teilweise im Wasserbad mit einer Rotationsrate von 40 U/min, um eine berechnete Scherrate von ~450 ^s-1 zu erreichen.
   HINWEIS: Informationen zu berechneten Scheren basierend auf der Schlauchgröße und der Drehzahl (20 bis 60 U/min) finden Sie unter Zeng et ^al.16. Typische venöse und arterielle Scherraten sind 20-200 ^s-1 bzw. 300-1.000 ^s-1, wobei ~400-500 ^s-1 repräsentativ für die Lungenarterie ist.
6. Lassen Sie die Gerinnsel 40-60 Minuten lang bei schlechten Lichtverhältnissen entstehen, um das Photobleichen des fluoreszenzmarkierten Fibrinogens zu minimieren.
7. Nachdem die gewünschte Gerinnungszeit erreicht ist, entfernen Sie die Gerinnsel aus dem Schlauch und verwenden Sie sie sofort. Um eine sanfte Entfernung der Gerinnsel zu gewährleisten, ohne die Struktur zu beeinträchtigen, drehen Sie den Schlauch vorsichtig um, damit das Gerinnsel langsam aus dem Röhrchen in einen kleinen Behälter gleiten kann.
   HINWEIS: Die Lagerung von gebildeten Gerinnseln in Citratplasma oder PBS über Nacht bei 4 °C kann sich auf die nachfolgende Analyse des Gerinnselverdaus im Fließkreislauf auswirken.

3. Einrichtung des RT-FluFF-Instruments

1. Stellen Sie sicher, dass das Durchflussschleifengerät angeschlossen ist, wie in Abbildung 2 gezeigt, und dass alle Verbindungen sicher sind. Kurz gesagt, die Durchflussschleifenvorrichtung umfasst in der Reihenfolge der Strömungsrichtung: Pumpe > Dämpfer > Einlassdrucksensor > Gerinnsel- > Ausgangsdrucksensor > Fluorometer > beheizter Behälter > Pumpe. Passen Sie die Auswahl der Pumpenkapazität, der experimentellen Durchflussrate, des Schlauchdurchmessers und der Schlauchlänge, der Temperatur, des Reservoirvolumens und der Gerinnselgröße/-geometrie an die für jede Studie individuellen experimentellen Anforderungen an.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde für RT-FluFF der gleiche Schlauchdurchmesser verwendet, der in der Chandler-Schlaufe verwendet wurde. Die Schläuche können für mehrere Läufe am selben Tag verwendet werden, müssen jedoch auf Degradation oder Undichtigkeit überwacht und bei Bedarf gewechselt/gespült werden. Es wird empfohlen, zwischen den Durchläufen mit warmem destilliertem Wasser zu spülen. Je nach Versuchsaufbau kann es erforderlich sein, die Schläuche nach jedem Lauf auszutauschen.
2. Sobald alle Schläuche gesichert sind, schalten Sie das Druckwächter ein. Stellen Sie sicher, dass der Druckwächter 0 mmHg sowohl für den Einlass- als auch für den Auslasssensor anzeigt. Ist dies nicht der Fall, öffnen Sie die Ventile, um sicherzustellen, dass die Drucksensoren für den atmosphärischen Druck geöffnet sind, und stellen Sie die Sensoren auf Null.
3. Schalten Sie den Heizblock oder das Wasserbad ein, das gerade verwendet wird, und überwachen Sie die Temperatur im Verlauf des Experiments. Halten Sie die Temperatur nahe 37 °C, um die physiologische Körpertemperatur des Menschen nachzuahmen.
4. Schalten Sie die Pumpe auf die gewünschte Durchflussmenge ein, um nach Undichtigkeiten zu suchen und sicherzustellen, dass die Drucksensoren funktionieren.
   HINWEIS: Eine Durchflussrate von ~160 ml/min in dieser Schlauchgröße entspricht einer Scherrate von ~500 ^s-1.
5. Schalten Sie die Pumpe aus, um das Laden der Gerinnsel zu erleichtern.

4. Laden des Gerinnsels in den Fließkreislauf

1. Wenn ein zuvor hergestelltes Gerinnsel, das gelagert wurde, verwendet wird, stellen Sie sicher, dass das Gerinnsel auf Raumtemperatur gebracht wird, bevor Sie es in das Durchflusskreislaufsystem laden.
2. Der Massenverlust von Gerinnseln ist eine wichtige Endpunktmessung für Thrombolyse-Assays. Es empfiehlt sich, die Gerinnselmasse zu messen, bevor sie in die Fließschleife geladen wird, anstatt sich auf vorherige Messungen zu verlassen.
   1. Die Messung der Gerinnselmasse sollte jedes Mal auf die gleiche Weise durchgeführt werden, um die Konsistenz über die Proben und über die Assay-Tage hinweg zu gewährleisten, da der Flüssigkeitsgehalt innerhalb und auf den Gerinnseln ihre Masse erheblich beeinflussen kann. Die beste Vorgehensweise besteht darin, Gerinnsel vorsichtig auf Labortüchern zu tupfen, bis sie keine signifikante Menge an Flüssigkeit mehr an das Tuch abgeben, wobei darauf zu achten ist, dass das Gerinnsel während des gesamten Messvorgangs nicht zusammengedrückt wird.
3. Tauchen Sie das Gerinnsel in das Plasma (autologe oder typangepasste) oder eine andere mobile Phasenlösung, die im Durchflusskreislauf verwendet wird (z. B. PBS oder definierte Medien), in einen flachen Behälter, z. B. eine Waage. Die Lösung für die mobile Phase sollte direkt aus dem 50-ml-Systemreservoir entnommen werden, um das Gesamtsystemvolumen zu kontrollieren. Während der Phase der Gerinnselbeladung sollte kein thrombolytisches oder pharmazeutisches Prüfmittel vorhanden sein. Es wird empfohlen, das Gesamtvolumen der mobilen Phase für den Betrieb des Flusskreislaufs ≥50 ml zu betragen und sollte über alle Proben hinweg konsistent sein.
4. Entfernen Sie den mittleren Teil des Durchflussschlauchs (zwischen Einlass- und Auslasssensoren) und befestigen Sie eine 10-ml-Spritze an einem Ende des Schlauchs.
5. Legen Sie den Schlauch mit dem freien Ende in das Plasma (oder die mobile Phase) und nehmen Sie ein kleines Volumen der Lösung auf, um den Schlauch zu grundieren. Platzieren Sie dann den Schlaucheinlass in der Nähe des Gerinnsels und untersuchen Sie das Gerinnsel sorgfältig, um den Kopf (in der Regel das etwas dickere Ende des Gerinnsels) und den Schwanz (Ende gegenüber dem Kopf) zu identifizieren. Der Kopf des Gerinnsels sollte in Richtung des Einlassdrucksensors und vom Auslass weg positioniert werden. Platzieren Sie den Schlauch am "hinteren" Ende des Gerinnsels und saugen Sie ihn mit der Spritze in den Schlauch ab.
   HINWEIS: In Fällen, in denen die Richtungsrichtung des Gerinnselkopfes/-schwanzes nicht visuell bestimmt werden kann, kann die Richtungsabhängigkeit am besten auf der Grundlage der Kenntnis der Drehrichtung aus der Chandler-Schlaufe zugewiesen werden - der Gerinnselkopf zeigt in die entgegengesetzte Richtung der Trommeldrehung.
6. Befestigen Sie den Schlauch wieder so am Hauptgerät, dass das Gerinnsel dem Ausgangsdrucksensor am nächsten ist (der Kopf des Gerinnsels sollte vom Auslasssensor weg zeigen). Sichern Sie das Gerinnsel in seiner Position, indem Sie den Schlauch und den Gerinnselkopf mit zwei 30-G-Nadeln in einem "X"-Muster punktieren. Lassen Sie diese Nadeln für die Dauer des Laufs drin.
   HINWEIS: Abhängig von den Einstellungen des Dämpfers und der Pumpe können zusätzliche Nadeln erforderlich sein, um sicherzustellen, dass das Gerinnsel nicht vorzeitig fragmentiert. Bei Bedarf kann der Schlauch hinter dem Gerinnsel mit einem Sieb versehen werden, um zu verhindern, dass Gerinnselfragmente im System zirkulieren. Sobald eine festgelegte Anzahl von Nadeln festgelegt wurde, um das Gerinnsel zu halten, halten Sie diese unter allen Bedingungen konstant.
7. Nehmen Sie den Rest der Lösung für die mobile Phase und geben Sie ihn in ein 50-ml-Röhrchen als Reservoir.
8. Stellen Sie den Behälter in das Wasserbad und setzen Sie den Einlass- und Auslassschlauch ein (der Auslass erfolgt vom Fluorometer und der Einlass geht in den Pumpenkopf).
9. Überprüfen Sie, ob das verwendete Fluorometer angeschlossen und überwacht ist. Überprüfen Sie, ob der Anfangswert im Vergleich zu einem reinen Phasensystem für mobile Phasen zu Beginn des Experiments angemessen ist.
   HINWEIS: Wenn kein Inline-Fluorometer verfügbar ist, kann eine serielle periodische Probenahme des Reservoirs in definierten Intervallen während des gesamten Analysezeitraums des Durchflusskreislaufs durchgeführt werden. Die gesammelten Fraktionen können unmittelbar nach Abschluss des Experiments mit einer 96-Well-Platte auf jedem kommerziell erhältlichen Spektralphotometer abgelesen werden.
10. Geben Sie 500 μl 100.000 ng/mL tPA direkt in das Reservoirvolumen, um eine endgültige Konzentration von 1.000 ng/mL tPA in 50 mL zu erreichen. Das Volumen, die Konzentration und das spezifische Medikament, das hinzugefügt wird, hängen von der gewünschten zirkulierenden Zielkonzentration und dem Volumen des Systemreservoirs ab.
11. Überprüfen Sie vor dem Starten der Pumpe Folgendes:
    1. Alle Knotenpunkte sind gesichert.
    2. Die beiden Ventile oberhalb der Drucksensoren befinden sich in der entsprechenden geschlossenen Position.
    3. Jegliches restliche Plasma (oder Flüssigkeit) wurde in das Reservoir ersetzt.
    4. Das Thrombolytikum wurde in das Reservoir gegeben und ordnungsgemäß gemischt.
    5. Der Einlassschlauch befindet sich in der Nähe des Bodens des Behälters (dies sorgt für minimale Blasenbildung).
    6. Der Auslassschlauch ist sicher und in der richtigen Höhe für den gewünschten Druck (abhängig davon, welcher Behälterstandort modelliert wird).
    7. Die Drehrichtung der Pumpe ist korrekt (Durchflussreihenfolge: Pumpe > Dämpfer > Gerinnsel > Fluorometer > Reservoir > Pumpe).
    8. Wenn die Pumpendrehzahl sehr hoch eingestellt ist (>150 U/min), beginnen Sie mit einer langsameren Drehzahl und fahren Sie hoch, um sicherzustellen, dass die schnelle Druckänderung das Gerinnsel nicht fragmentiert oder zu Leckagen an den Schläuchen führt.
    9. Stellen Sie sicher, dass das System die Daten vom Fluorometer ordnungsgemäß aufzeichnet und/oder dass die Vorräte für die regelmäßige Probenahme der mobilen Phase für die Ablesung nach dem Experiment vorbereitet sind.
12. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie sie so ein, dass sie den gewünschten Volumenstrom von 160 mL/min erreicht oder erhöhen Sie die Durchflussmenge, bis der gewünschte Druck erreicht ist. Das System füllt sich mit Flüssigkeit und Blasen. Die Blasen erhöhen die fluorometrischen Messwerte künstlich, also achte darauf, dass sich die Blasen klären. Sobald dies der Fall ist, schalten Sie das Licht aus und beginnen Sie mit der Datenerfassung.
13. Lassen Sie die Pumpe laufen, bis das Gerinnsel deutlich abgebaut ist oder die gewünschte Versuchszeit (≥60 min) abgelaufen ist. Fügen Sie dem System während des gesamten Experiments nach Bedarf Reagenzien über das Reservoir hinzu, um einzigartige experimentelle Bedingungen zu schaffen, unter denen eine Vielzahl von thrombolytischen Variationen getestet werden kann.
    HINWEIS: Die Versuchszeit hängt von der Fördermenge der Pumpe (Schergrad) und der Konzentration des Thrombolytikums ab.
14. Sobald der Assay abgeschlossen ist, reduzieren Sie den Volumenstrom und entfernen Sie die Einlassschläuche, während die Pumpe noch läuft, um den größten Teil der Flüssigkeit im System in das Reservoir zu drücken (eine bewegliche Phase verbleibt in den Schläuchen). Trennen Sie den gerinnselhaltigen Schlauchabschnitt an der Seite des Ausgangsdrucksensors vom Schlauch und senken Sie ihn in ein Wägeschiffchen ab.
15. Entfernen Sie die Nadeln, die das Gerinnsel an Ort und Stelle halten, um die Restflüssigkeit aus dem System und die Gerinnsel-/Gerinnselfragmente aufzufangen. Verwenden Sie bei Bedarf eine Spritze, um das System zu reinigen.
16. Wiegen und verarbeiten Sie das verbleibende Gerinnsel für zusätzliche Analysen, z. B. die Berechnung des prozentualen Massenverlusts oder für die Histologie.

5. Reinigen des Systems

1. Spülen Sie das gesamte System zwischen den Proben mit warmem Wasser bei hoher Drehzahl (>150 U/min). Laden Sie das Wasser in den Behälter und lassen Sie es mindestens 2 Minuten lang durch das System laufen, leeren Sie es und lassen Sie es für zwei vollständige Systemspülungen erneut laufen. Wenn der Fluorometerwert nach diesen Spülungen nicht auf den Ausgangswert zurückkehrt, wiederholen Sie den Spülvorgang für einen weiteren Zyklus. Wenn es immer noch nicht zum Ausgangswert zurückgekehrt ist, wechseln Sie den Schlauch vollständig, bevor Sie die nächste Probe untersuchen.
   HINWEIS: Während der Versuche können die Schläuche zwischen den Proben wiederverwendet werden. Aufgrund der Perforation mit Nadeln, mit denen das Gerinnsel an Ort und Stelle gehalten wird, sollte der Schlauchabschnitt zwischen den Einlass- und Ausgangsdrucksensoren jedoch nach jedem Lauf ausgetauscht werden. Unter bestimmten experimentellen Bedingungen kann es erforderlich sein, den gesamten Schlauchsatz nach jedem Lauf auszutauschen oder Clustering-Assays durchzuführen, um eine Kreuzkontamination der Probe zu vermeiden.
2. Nachdem alle Proben für die Experimente an diesem Tag durchgeführt wurden, entfernen Sie alle Schläuche und entsorgen Sie sie. Schrubben Sie die T-Übergänge mit heißem Wasser und einer Borstenbürste, bis sie sauber sind, lassen Sie sie trocknen und spülen Sie die Spritzenfeuchter mit heißem Wasser ab. Verwenden Sie 70% EtOH, um die Sterilität zu verbessern.

Ergebnisse

Bildung von Chandler-Schlingengerinnseln
Bei der Bildung von Gerinnseln strebten wir im Allgemeinen Vierfachpräparate an, um sicherzustellen, dass wir auch im Falle von Gerinnselausreißern (basierend auf der Bruttomorphologie und -masse) in der Lage waren, dreifache Thrombolysetests durchzuführen. Unter der Annahme optimaler Belastungsbedingungen sollten alle Gerinnsel in Länge (~3,3 cm), Gewicht (~100 mg) und Aussehen ziemlich einheitlich sein, wie in Abbildung 3 dar...

Diskussion

Gerinnselbildung und -kennzeichnung
Es wurde gezeigt, dass die Chandler-Schleife ein einfaches und effektives Mittel zur reproduzierbaren Erzeugung von Gerinnseln darstellt, die In-vivo-Thromben ^{nachahmen 16}. Die Feinabstimmung von Parametern wie Schlauchgröße, Drehzahlen, Trommeldurchmesser und Gerinnungszeit ermöglicht die schnelle Bildung von Gerinnseln unter unterschiedlichen Scherbedingungen, die architektonische Merkmale erfassen können, die bei einer Reihe v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,