체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적

요약

체외 혈전용해 분석은 소화되는 모델 혈전이나 혈전용해가 발생하는 환경에서 생체 내 조건을 복제하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 여기에서는 챈들러 루프와 RT-FluFF(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)를 결합하여 고충실도, 생체 외 혈전 용해 모니터링을 수행하는 방법을 살펴봅니다.

초록

혈전색전증 및 관련 합병증은 전 세계적으로 이환율 및 사망률의 주요 원인이며, in vitro 및 in vivo 모두에서 혈전용해제 약물 효과를 테스트하기 위해 다양한 분석법이 개발되었습니다. 인간 생리학으로의 번역성이 부족한 경우가 많을 뿐만 아니라 동물 모델과 관련된 복잡성과 비용으로 인해 약물 개발을 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 체외 혈전 모델에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 유량, 압력 및 전단 속도는 순환계의 중요한 특성이며, 흐름에 따라 형성된 응고는 정적으로 형성된 혈전과 다른 형태 및 소화 특성을 나타냅니다. 이러한 요인은 기존의 체외 혈전 분해 분석에서는 나타나지 않는 경우가 많으며, 이는 약물 번역 성공률에 영향을 미치는 약리학적 영향을 미칠 수 있습니다.

RT-FluFF(Real-T ime Flu Fluorometric Flowing Fibrinolysis) 분석은 전단 흐름 하에서 형성된 형광 태그 응고를 사용하는 고충실도 혈전 용해 검사 플랫폼으로 개발되었으며, 이 혈전은 섬유소 용해제의 유무에 관계없이 순환 플라즈마를 사용하여 분해됩니다. 혈전 형성 및 혈전 소화 단계의 유속을 수정하면 시스템이 매우 다양한 실험 설정에서 동맥, 폐 및 정맥 상태를 모방할 수 있습니다. 측정은 인라인 형광측정기를 사용하거나 이산 시점을 사용하여 연속적으로 수행할 수 있으며, 기존의 종말점 응고 질량 측정도 수행할 수 있습니다. RT-FluFF assay는 체외 검사 시스템의 제어 및 재현성을 유지하면서 생체 내 생리학적 조건을 보다 정확하게 나타내는 유동 조건에서 혈전 분해를 실시간으로 추적할 수 있는 유연한 시스템입니다.

서문

근본적으로 혈전색전증 병인에서 비롯된 질병은 현대 사회에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 혈전색전증의 발병기전으로는 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 심부 정맥 혈전증, 폐색전증 등이 있으나 이에 국한되지 않는다¹. 병원성 혈전증을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 방법의 개발을 중심으로 여러 분야에 걸쳐 엄청난 양의 지속적인 연구가 진행되고 있습니다. 혈전증의 동맥 및 정맥 증상의 변화와 다양한 해부학적 위치로 인해 다양한 치료 접근법이 개발되었습니다. 그러나 급성 치료는 일반적으로 플라스미노겐 활성제를 통한 약물적 혈전용해술에 의존하며, 특정 임상 상황에서 기계적 혈전절제술을 시행할 수 있다².

새로운 약리학적 치료 전략의 개발은 근본적으로 전임상 시험을 위한 체내 동물 모델과 체외 소화 모델 모두에 의존합니다 ^3,4. 생체 내 모델은 의약품의 제거뿐만 아니라 약물과의 세포 상호 작용을 포함하여 치료 효능에 대한 다양한 생리학적 매개변수의 복잡한 상호 작용을 포착할 수 있는 능력의 이점을 자연스럽게 누릴 수....

프로토콜

아래에 언급된 모든 방법은 IRB(Institutional Review Board) 프로토콜 및 기관 인간 연구 윤리 위원회(Institutional Human Research Ethics Committee)를 따릅니다. 모든 건강한 자원봉사자는 헌혈 전에 서면 동의서를 제출했습니다. 참고로, 프로토콜 내에서 참조되는 모든 자료는 재료 목차에서 찾을 수 있습니다. 인간 WB 및 혈장이 이 프로토콜 전반에 걸쳐 논의되는 동안, 연구 동물 혈액 및 인자 고갈 혈액 제제의 사용을 구매하고 대체할 수 있습니다.

1. 전혈 채취

1. 표준 정맥 절개술 기술을 사용하여 동의한 건강한 지원자로부터 정맥 전혈(WB)을 수집합니다.
   주의: 이 프로토콜 전체에서 혈액 또는 기타 잠재적으로 감염될 수 있는 물질과의 접촉 위험을 줄이기 위해 보편적인 예방 조치를 따라야 합니다. 장갑, 실험실 가운 및 안면 보호대를 사용해야 합니다.
2. ~50mL의 WB를 3.2% 구연산나트륨 튜브에 직접 모으고 후속 사용을 위해 즉시 50mL 튜브에 고입니다.
   알림: 구연산염 튜브에 혈액을 수집하기 전에 튜브를 버리는 것은 튜브가 제조업체에서 권장하는 양만큼 채워지도록 하는 것 외에....

토론

응고 형성 및 라벨링
챈들러 루프(Chandler loop)는 생체 내 혈전¹⁶을 모방한 혈전을 재현성 있게 생성하는 쉽고 효과적인 수단을 제공하는 것으로 입증되었습니다. 튜빙 크기, 회전 속도, 드럼 직경 및 응고 시간과 같은 매개변수를 미세 조정하면 다양한 전단 조건에서 혈전을 빠르게 생성할 수 있으며, 동맥 및 정맥 소스를 모두 모방하는 다양한 혈전에서 높이 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,