In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

要約

in vitro血栓溶解アッセイは、消化されるモデル血栓や血栓溶解が起こっている環境など、生体内条件を再現するのに苦労することがよくありました。ここでは、ChandlerループとReal-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF)の結合が、高忠実度のex-vivo血栓溶解モニタリングにどのように使用されているかを探ります。

要約

血栓塞栓症および関連する合併症は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、 in vitro と in vivo の両方で血栓溶解薬の有効性をテストするためのさまざまなアッセイが開発されています。動物モデルには複雑性とコストがかかることに加え、ヒトの生理機能への翻訳性が欠如していることが多いことから、医薬品開発のためのより生理学的に関連性のある in-vitro 血栓モデルに対する需要が高まっています。流量、圧力、およびせん断速度は循環器系の重要な特性であり、流れの下で形成される血栓は、静的に形成された血栓とは異なる形態と消化特性を示します。これらの因子は、従来の in-vitro 血栓消化アッセイでは表現されないことが多く、薬物の翻訳成功率に影響を与える薬理学的な意味を持つ可能性があります。

Real-T ime Flu造山運動法 Flowing F線溶 (RT-FluFF) アッセイは、せん断流下で形成された蛍光タグ付き血栓を使用し、線維素溶解薬の有無下で循環プラズマを使用して消化する高忠実度の血栓溶解試験プラットフォームとして開発されました。血栓形成と血栓消化ステップの両方の流速を変更することで、システムは非常に多様な実験設定で動脈、肺、静脈の状態を模倣することができます。測定は、インライン蛍光光度計を使用するか、離散的な時間点を取ることによって連続的に行うことができ、従来のエンドポイントの血栓質量測定も可能です。RT-FluFFアッセイは、in-vitro試験システムの制御性と再現性を維持しながら、in-vivoの生理学的条件をより正確に表現する流条件下での血餅消化のリアルタイム追跡を可能にする柔軟なシステムです。

概要

基本的に血栓塞栓症の病因に起因する疾患は、現代社会における罹患率と死亡率の主要な原因を示しています。血栓塞栓症の病因の徴候には、心筋梗塞、虚血性脳卒中、深部静脈血栓症、および肺塞栓¹が含まれるが、これらに限定されない。病原性血栓症に対処するための安全で効果的な方法の開発を中心に、複数の分野にまたがる膨大な量の進行中の研究が展開されています。血栓症の動脈および静脈の症状の変動と解剖学的位置の変動により、さまざまな治療アプローチが開発されました。ただし、急性期の治療は一般に、プラスミノーゲン活性化剤を介した薬理学的血栓溶解の使用に依存しており、特定の臨床状況下で機械的血栓摘出術の可能性があります²。

新しい薬理学的治療戦略の開発は、基本的に前臨床試験のためのinvivo動物モデルとinvitro消化モデルの両方に依存しています^3,4。In-vivoモデルは、医薬品のクリアランスや薬物との細胞相互作用など、治療効果に関するさまざまな生理学的パラメータの複雑な相互作用を捉える能力から自然に恩恵を受けます。しかし、この同じ複雑さにより、このようなモデルは非常に高価になることが多く、ヒトの生理機能とは大きく異なる動物の基礎となる薬力学/動態を分離しようとすると、追加の問題が発生します。インビトロモデルの開発は、医薬品の開発とスクリーニングを実施できる蒸留試験環境を促進するのに役立ちましたが、多くの場合、研究対象の疾患状態を再現するために必要な忠実度に欠けています。

新規血栓溶解薬を試験するための一般的に見られるinvitroプロトコルは、残留血栓質量が^{主要評価項目5,6}として機能する静的条件下で形成および溶解された血栓の利用に依存しています。残念ながら、このような手法では、乱流や経血栓圧力降下など、試験薬の薬力学を大きく変える可能性のある血栓溶解の機械的側面を説明できていません。さらに、静的条件下で形成された血栓には、生理学的血栓とは異なるマイクロアーキテクチャが含まれています。血栓形成中のせん断の存在は、血小板の活性化やフィブリン架橋など、結果として生じる血餅の特性に影響を与えることが再現性よく示されています。せん断流下で生成される血餅は、静的に形成された血餅^7,8にはない、先端から尾までの複雑な不均一性を示します。このような生理学的血栓構造からの逸脱は、血栓内への薬物浸透とその後の溶解効率を含む重要な医薬品開発の特性評価に影響を与える可能性があります⁹。

静的凝固/血栓溶解モデルの使用に関連するこれらの制限のいくつかに対処するために、血栓形成とせん断の存在下での血栓溶解の両方にチャンドラーループを採用することで、復活が見られました¹⁰。このようなシステムは、比較的静的なアッセイと比較して、流れのダイナミクスをより適切に表現し、より生理学的に関連性のあるアーキテクチャの血栓を生成することができますが、その単純化された流れ条件は依然として生理学的条件からの逸脱を表しています。最後に、イメージングの容易さと均一なフローパターンにより、マイクロ流体アプローチも実施されています。しかし、それらは、主に臨床的に関連する血栓塞栓症^11,12で影響を受けるより大きな血管内で予想される生理学的条件からの有意な除去のままです。

上記の議論を念頭に置いて、前臨床血栓溶解薬スクリーニングのための高忠実度の in-vitro 血栓溶解モデルを開発しました。このモデルは、新規血栓溶解療法スクリーニングの領域で上記で詳述した現在の落とし穴のいくつかに対処することを目的としており、さまざまな濃度の組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)での再現性と感度が検証されました。本明細書に記載のシステムは、蠕動ポンプ、圧力減衰器、加熱リザーバー、2つの圧力センサ、インライン蛍光計、および蛍光標識されたチャンドラーループせん断形成血餅アナログを利用して生理学的せん断流を提供し、線維素溶解¹³のリアルタイム追跡を容易にする。まとめると、システム全体は Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF Assay)¹⁴ と呼ばれ、この原稿では、この高忠実度の in-vitro 血栓溶解モデルでアッセイを正常にセットアップして実行するための複雑さについて説明します。

プロトコル

以下に示すすべての方法は、治験審査委員会(IRB)のプロトコルおよび機関のヒト研究倫理委員会に準拠しています。すべての健康なボランティアは、献血前に書面でインフォームドコンセントを提供しました。なお、プロトコール内で参照されているすべての材料は、 材料表に記載されています。このプロトコルでは、ヒトの WB と血漿について説明しますが、研究動物の血液と因子が枯渇した血液製剤の使用を購入して代用することができます。

1.全血採取

1. 標準的な瀉血技術を使用して、同意した健康なボランティアから静脈全血(WB)を採取します。
   注意: このプロトコル全体で、血液やその他の感染性の可能性のある物質との接触のリスクを減らすために、普遍的な予防措置が守られていることを確認してください。手袋、白衣、フェイスシールドの使用が必要です。
2. ~50 mL の WB を 3.2% クエン酸ナトリウムチューブに直接集め、すぐに 50 mL チューブにプールして後で使用します。
   注:クエン酸チューブに採血する前にチューブを廃棄することに加えて、チューブがメーカー推奨の量まで充填されていることを確認する必要があります。採集したばかりのWBは、宿主の凝固ダイナミクスを最もよく再現します。WBの室温(使用≤4時間前)での短期保存は許容されます。WBは、トロンボエラスト^{グラフィー15}で検査すると凝固ダイナミクスに影響を与えることが示されているため、一晩保存されません。

2.血栓形成

1. 3 mLのクエン酸全血に、蛍光(フルオレセインイソチオシアネート[FITC])タグ付きフィブリノーゲン(FITC-Fg)を最終濃度60 μg / mLまで添加します(内因性血漿フィブリノーゲン濃度を3 mg / mLと仮定すると、蛍光タグ付きフィブリノーゲンと未修飾フィブリノーゲンの比率は1:50です)。
   注:この比率は、血餅の形態への影響を最小限に抑えながら、1:10まで高めることができます。^13,14蛍光タグ付きフィブリノーゲンは、フィブリノーゲンをフルオレセインイソチオシアネート(FITC)と反応させることによって購入または生成できます。フィブリノーゲンの混合は、実行開始の≤5分前に行う必要があります。
   1. フィブリノーゲンが以前に分注および凍結されていた場合は、解凍したFITC-Fgを検査して、重合が時期尚早に開始されて使用不能になっていないことを確認します(溶液中に微粒子や繊維がないことを確認してください)。
2. 直径120 mmのドラムを37°Cのウォーターバスに入れたChandlerループセットアップを準備します(図1)。Chandlerループデバイスが、血栓形成プロセス全体を通じて0〜90rpmの固定回転速度で回転できることを確認してください。
   注:追加のChandlerループのセットアップと変更については、Zeng et al.を参照してください。¹⁶.
3. チューブ(内径5/32インチ、外径7/32インチ)をカットし、ドラムの周りにしっかりとフィットするが、しっかりとフィットしないループを形成します。ここで説明する推奨チューブサイズについては、チューブの端を接続してクローズドループを形成するためのフィッティングとして使用するために、標準の200 μL PCRチューブをカットします。
   注:異なるサイズの血栓¹⁶を生成するために、異なるチューブサイズを利用することができます。
4. 全血に200 mMの塩化カルシウム溶液を1:17の比率で追加することにより、血液の凝固を開始します。.3 mLシリンジを使用して、血液をチューブ(チューブ容量の~50%を充填)にロードします。すぐにループを両端を接続するチャンドラーループドラムに置き、回転を開始します。
   1. ロード前に穏やかな反転で適切な混合を確保し、WBコンポーネントの沈降に起因する問題を回避します。
   2. 一貫性が保たれていないと血栓のサイズに影響を与える可能性があるため、各チューブに毎回同じ量の血液が追加されていることを確認してください。
   3. 血液柱内の気泡も血液凝固に影響を与える可能性があるため、チューブを「シーソー」のようにゆっくりと動かして泡を取り除き、ドラムに泡をロードする前に泡の脱出を促進します。
5. ウォーターバスに部分的に沈めたドラムを40RPMの回転速度で回転させ、計算されたせん断速度~450 ^s-1を達成します。
   注:チューブのサイズと回転速度(20〜60 RPM)に基づいて計算されたせん断に関する情報については、Zengらを参照してください¹⁶。典型的な静脈および動脈のせん断速度は、それぞれ 20-200 ^s-1 と 300-1,000 ^s-1 であり、~400-500 ^s-1 が肺動脈の代表です。
6. 蛍光タグ付きフィブリノーゲンの光退色を最小限に抑えるために、低照度条件下で40〜60分間血栓が形成されます。
7. 希望の凝固時間に達したら、チューブから血栓を取り出し、すぐに使用します。構造を損なうことなく血栓を穏やかに除去するには、チューブを静かに反転させて、血栓がチューブからゆっくりと滑り出して小さな容器に入るようにします。
   注:形成された血栓をクエン酸血漿または PBS で 4 °C で一晩保存すると、その後のフローループでの血栓消化の分析に影響を与える可能性があります。

3. RT-FluFF装置のセットアップ

1. 図2に示すように、フローループ装置が接続され、すべての接続が安全であることを確認してください。要するに、フローループ装置には、流れの方向の順に、ポンプ>ダンパー>入口圧力センサー>血栓>出口圧力センサー>蛍光光度計>加熱リザーバー>ポンプが含まれます。ポンプ容量、実験流量、チューブの直径と長さ、温度、リザーバー容量、血栓のサイズ/形状の選択を、各研究に固有の実験ニーズに合わせて調整します。
   注:この例では、チャンドラーループで使用されたのと同じ直径のチューブがRT-FluFFに使用されました。チューブは、同じ日に複数回の運転に使用できますが、劣化や漏れがないか監視し、必要に応じて交換/すすぎる必要があります。ランの合間に温かい蒸留水ですすぐことをお勧めします。実験計画によっては、実行のたびにチューブを交換する必要がある場合があります。
2. すべてのチューブが固定されたら、圧力モニターをオンにします。圧力モニターが入口センサーと出口センサーの両方で0mmHgを読み取りていることを確認します。開いていない場合は、バルブを開いて圧力センサーが大気圧に対して開いていることを確認し、センサーをゼロにします。
3. 使用している加熱ブロックまたはウォーターバスの電源を入れ、実験中の温度を監視します。人間の生理的な体温を模倣するために、温度を37°Cに近づけてください。
4. ポンプを希望の流量に回して漏れがないか確認し、圧力センサーが機能していることを確認します。
   注:このチューブサイズでの流速が~160 mL/分の場合、せん断速度は~500 ^s-1になります。
5. 血栓の充填を容易にするために、ポンプをオフにしてください。

4. 血栓をフローループにロードする

1. 以前に保存された血栓を使用する場合は、血栓をフローループシステムにロードする前に、必ず血栓を室温に戻してください。
2. 血栓の質量損失は、血栓溶解アッセイの重要なエンドポイント測定です。血栓の質量は、以前の測定に頼るのではなく、フローループにロードする直前に測定するのがベストプラクティスです。
   1. 血栓の質量測定は、サンプル間および分析日間で一貫性を確保するために、常に同じ方法で行う必要があります。これは、血栓内および血栓上の液体含有量が血栓の質量に大きな影響を与える可能性があるためです。ベストプラクティスは、測定プロセス全体で血栓を圧迫しないように注意しながら、ワイプに大量の液体が放出されなくなるまで、実験室のワイプで血栓を穏やかに吸い取ることです。
3. 血漿(自家またはタイプマッチ)またはフローループで使用される他の移動相溶液(PBSや定義培地など)に血栓を沈め、秤量皿などの浅い容器に入れます。移動相溶液は、50 mLシステムリザーバーから直接取り出して、システム全体の容量を制御する必要があります。血栓溶解剤または医薬品の試験剤は、血栓充填段階では存在してはなりません。フローループを実行するための移動相の総容量は ≥50 mL にすることが推奨され、すべてのサンプルで一貫している必要があります。
4. フローループチューブの中央部分(入口センサーと出口センサーの間)を取り外し、チューブの一方の端に10mLシリンジを取り付けます。
5. チューブの自由端を使用して、チューブをプラズマ(または移動相)に入れ、少量の溶液を取り込み、チューブをプライミングします。次に、チューブインレットを血栓の近くに置き、血栓を注意深く調べて、ヘッド(通常は血栓の少し厚い端)とテール(ヘッドの反対側の端)を特定します。血栓の頭部は、入口圧力センサーの方に、出口から離して配置する必要があります。チューブを血栓の「尾部」端に置き、シリンジでチューブに吸引します。
   注:血栓ヘッド/テールの方向性を視覚的に判断できない場合は、チャンドラーループからの回転方向を知ることに基づいて方向性を割り当てるのが最適です-血栓ヘッドはドラム回転の反対方向を向いています。
6. 血栓が出口圧力センサーに最も近づくように、チューブをメイン装置に取り付け直します(血栓の頭が出口センサーの反対側を向いている必要があります)。チューブと血栓ヘッドに「X」パターンの2本の30G針を刺して、血栓をその位置に固定します。実行中は、これらの針をそのままにしておきます。
   注:ダンパーとポンプの設定によっては、血栓が早期に断片化しないようにするために、追加の針が必要になる場合があります。必要に応じて、血栓の下流のチューブにスクリーンを追加して、血栓の破片がシステム内を循環するのを防ぐことができます。血栓を保持するための針の数が決まったら、これを条件間で一定に保ちます。
7. 移動相溶液の残りを取り出し、リザーバーとして50 mLチューブに入れます。
8. リザーバーをウォーターバスに入れ、入口と出口のチューブに入れます(出口は蛍光光度計からで、入口はポンプヘッドに入ります)。
9. 使用している蛍光光度計が接続され、監視されていることを確認してください。実験開始時の移動相のみのシステムベースラインと比較して、初期値が適切であることを確認してください。
   注:インライン蛍光光度計が利用できない場合は、フローループ分析期間を通じて定義された間隔でリザーバーの連続的な定期サンプリングを実行できます。収集されたフラクションは、実験完了直後に市販の分光光度計で96ウェルプレートを使用して読み取ることができます。
10. 500 μL の 100,000 ng/mL tPA をリザーバー容量に直接加えると、50 mL で最終的に 1,000 ng/mL tPA 濃度が得られます。添加される量、濃度、および特定の薬物は、目的の目標循環濃度とシステムリザーバー容量によって異なります。
11. ポンプを始動する前に、次のことを確認してください。
    1. すべてのジャンクションは安全です。
    2. 圧力センサーの上にある2つのバルブは、適切な閉位置にあります。
    3. リザーバーに残っているプラズマ(または液体)が交換されています。
    4. 血栓溶解薬がリザーバーに追加され、適切に混合されています。
    5. インレットチューブはリザーバーの底近くにあります(これにより、気泡が最小限に抑えられます)。
    6. アウトレットチューブは固定されており、目的の圧力に対して適切な高さにあります(モデル化されている容器の位置によって異なります)。
    7. ポンプの回転方向が正しい(流れの順序:ポンプ>ダンパー>クロット>蛍光光度計>リザーバー>ポンプ)。
    8. ポンプの回転数が非常に高い(>150 rpm)場合は、圧力の急激な変化が血栓を断片化したり、チューブの漏れを引き起こしたりしないように、低速で開始してランプアップします。
    9. システムが蛍光光度計からのデータを適切に記録していることを確認する、および/または実験後の時点の読み取りのために移動相の定期的なサンプリング用に供給が準備されていることを確認します。
12. ポンプの電源を入れ、160 mL/minの所望の体積流量を達成するか、または所望の圧力に達するまで流量を増やすように設定します。システムは液体と泡で満たされます。泡は人為的に蛍光測定値を上げるので、気泡が晴れるのに注意してください。それらが終わったら、ライトをオフにしてデータ取得を開始します。
13. 血栓が著しく劣化するか、目的の実験時間が経過するまで(≥60分)、ポンプを作動させたままにします。必要に応じて、リザーバーを介して実験全体を通してシステムに試薬を追加し、さまざまな血栓溶解性のバリエーションをテストする独自の実験条件を作り出します。
    注:実験時間は、ポンプの流量(せん断レベル)と血栓溶解性の濃度によって異なります。
14. アッセイが完了したら、体積流量を下げ、ポンプがまだ稼働している間にインレットチューブを取り外して、システム内のほとんどの流体をリザーバーに押し込みます(一部の移動相はチューブに残ります)。チューブの出口圧力センサー側にある血栓を含むチューブセクションを外し、計量ボートに下げます。
15. 血栓を所定の位置に保持している針を取り外して、システム内から残った液体と血栓/血栓の破片を収集します。必要に応じて、シリンジを使用してシステムをクリアします。
16. 残りの血栓を秤量して処理し、損失質量率の計算や組織学などの追加分析を行います。

5. システムのクリーニング

1. サンプル間で、システム全体を高rpm(>150rpm)の温水ですすいでください。リザーバーに水を入れ、システムを少なくとも2分間実行し、空にして、再度実行して2回の完全なシステムすすぎを行います。これらのすすぎ後、蛍光光度計の読み取り値がベースラインに戻らない場合は、すすぎプロセスをさらに繰り返します。それでもベースラインに戻らない場合は、次のサンプルをアッセイする前にチューブを完全に交換してください。
   注:実験中、チューブはサンプル間で再利用できます。ただし、血栓を所定の位置に保持するために使用される針による穿孔のため、入口圧力センサーと出口圧力センサーの間のチューブセクションは、実行のたびに交換する必要があります。実験条件によっては、サンプルのクロスコンタミネーションを排除するために、各分析またはクラスタリングアッセイの後にチューブセット全体を交換することが必要になる場合があります。
2. その日の実験のためにすべてのサンプルを実行した後、すべてのチューブを取り外して廃棄します。T字型ジャンクションをお湯と毛ブラシできれいになるまでこすり洗いし、乾かしてシリンジダンパーをお湯ですすいでください。無菌性を助けるために70%EtOHを使用してください。

結果

チャンドラーループ血栓形成
血栓の形成では、一般的に四重結を目指して、血栓の外れ値(総形態と質量に基づく)が存在する場合でも、三重血栓溶解アッセイを実行する能力があることを確認しました。最適な負荷条件を仮定すると、 図3に示すように、血栓はすべて長さ(~3.3 cm)、重量(~100 mg)、および外観が非常に均一である必要があります。FITC-Fgを採?...

ディスカッション

血栓の形成と標識
チャンドラーループは、 生体内 血栓¹⁶を模倣する血栓を再現性よく生成する容易かつ効果的な手段を提供することが実証されている。チューブのサイズ、回転速度、ドラムの直径、凝固時間などのパラメータを微調整することで、動脈と静脈の両方の源を模倣したさまざまな血栓で評価される建築的特徴を捉えることができる、さま...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,