Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi

Özet

İn vitro tromboliz deneyleri, ister model trombüsün sindirildiği ortamda ister trombolizin meydana geldiği ortamda olsun, in vivo koşulları tekrarlamak için sıklıkla mücadele etmiştir. Burada, Chandler döngüsü ve Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testinin (RT-FluFF) birleştirilmesinin yüksek kaliteli, ex-vivo, pıhtı lizisi izleme için nasıl kullanıldığını keşfediyoruz.

Özet

Tromboembolizm ve ilişkili komplikasyonlar dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir ve trombolitik ilaç etkinliğini hem in vitro hem de in vivo olarak test etmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Hayvan modelleriyle ilişkili karmaşıklık ve maliyetin yanı sıra genellikle insan fizyolojisine çevrilebilirlik eksikliği nedeniyle, ilaç geliştirme için fizyolojik olarak daha ilgili in vitro pıhtı modellerine yönelik artan bir talep vardır. Akış, basınç ve kayma hızı dolaşım sisteminin önemli özellikleridir ve akış altında oluşan pıhtılar, statik olarak oluşan pıhtılardan farklı morfoloji ve sindirim özellikleri gösterir. Bu faktörler genellikle geleneksel in vitro pıhtı sindirim testlerinde temsil edilmez ve bu da ilaç translasyonel başarı oranlarını etkileyen farmakolojik etkilere sahip olabilir.

Real-T ime Griporometrik Fdüşük Fibrinoliz (RT-FluFF) testi, kesme akışı altında oluşan floresan etiketli pıhtıları kullanan ve daha sonra fibrinolitik farmasötik ajanların varlığında veya yokluğunda dolaşımdaki plazma kullanılarak sindirilen yüksek kaliteli bir tromboliz test platformu olarak geliştirilmiştir. Hem pıhtı oluşumunun hem de pıhtı sindirim adımlarının akış hızlarını değiştirmek, sistemin çok çeşitli deney düzeneklerinde arteriyel, pulmoner ve venöz koşulları taklit etmesine olanak tanır. Ölçümler, bir in-line florometre kullanılarak veya ayrı zaman noktaları alınarak ve ayrıca geleneksel bir son nokta pıhtı kütlesi ölçümü kullanılarak sürekli olarak alınabilir. RT-FluFF testi, bir in vitro test sisteminin kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini korurken, in vivo fizyolojik koşulları daha doğru bir şekilde temsil eden akış koşulları altında pıhtı sindiriminin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin veren esnek bir sistemdir.

Giriş

Temelde tromboembolik etiyolojilerden kaynaklanan hastalıklar günümüz toplumunda önemli bir morbidite ve mortalite kaynağı oluşturmaktadır. Tromboembolik patogenezin belirtileri arasında, bunlarla sınırlı olmamak üzere, miyokard enfarktüsü, iskemik inmeler, derin ven trombozları ve pulmoner emboli¹ bulunur. Birden fazla disiplini kapsayan muazzam miktarda devam eden araştırma, patojenik trombozla başa çıkmak için güvenli ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi etrafında dönmektedir. Trombozun arteriyel ve venöz bulgularındaki farklılıklar ve değişen anatomik lokalizasyonlar farklı tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, akut tedavi genellikle belirli klinik koşullar altında mekanik trombektomi potansiyeli olan plazminojen aktivatörleri yoluyla farmakolojik tromboliz kullanımına dayanır².

Yeni farmakolojik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi temel olarak hem in-vivo hayvan modellerine hem de klinik öncesi testler için in-vitro sindirim modellerine dayanmaktadır ^3,4. İn vivo modeller, farmasötik ajanların temizlenmesinin yanı sıra ilaçlarla hücresel etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik parametrelerin tedavi etkinliği üzerindeki karmaşık etkileşimini yakalama yeteneklerinden doğal olarak yararlanır. Bununla birlikte, bu aynı karmaşıklık genellikle bu tür modelleri oldukça maliyetli hale getirir ve hayvanlarda insan fizyolojisinden önemli ölçüde farklı olan altta yatan farmako-dinamikleri / kinetiği izole etmeye çalışırken ek sorunlar ortaya çıkarır. İn vitro modellerin geliştirilmesi, ilaç geliştirme ve taramanın gerçekleştirilebildiği, ancak genellikle incelenen hastalık durumunu özetlemek için gerekli aslına uygun olmayan damıtılmış bir test ortamının kolaylaştırılmasına yardımcı olmuştur.

Yeni trombolitiklerin test edilmesi için yaygın olarak bulunan in vitro protokoller, statik koşullar altında oluşan ve parçalanan pıhtıların kullanımına dayanır, bu sayede artık pıhtı kütlesi birincil son nokta olarak hizmet eder ^5,6. Ne yazık ki, bu tür teknikler, test ilaçlarının farmakodinamiğini önemli ölçüde değiştirebilen türbülanslı akış ve trans-trombüs basınç düşüşleri gibi pıhtı lizizinin mekanik yönlerini hesaba katmamaktadır. Ek olarak, statik koşullar altında oluşan pıhtılar, fizyolojik pıhtılardan farklı mikro mimari içerir. Pıhtı oluşumu sırasında kaymanın varlığının, trombosit aktivasyonu ve fibrin çapraz bağlanması gibi ortaya çıkan pıhtı özelliklerini etkilediği tekrarlanabilir bir şekilde gösterilmiştir. Kesme akışı altında üretilen pıhtılar, statik olarak oluşturulmuş pıhtılarda bulunmayan uçtan kuyruğa karmaşık heterojenlik sergiler ^7,8. Fizyolojik pıhtı mimarisinden bu tür sapmalar, bir trombüs içinde ilaç penetrasyonunu ve müteakip lizis etkinliğini içeren önemli ilaç geliştirme karakterizasyonunu etkileyebilir⁹.

Statik pıhtılaşma/pıhtı parçalama modellerinin kullanımıyla ilişkili bu sınırlamalardan bazılarını ele almak için, kesme varlığında hem pıhtı oluşumu hem de pıhtı lizisi için Chandler döngüsünün benimsenmesi bir canlanma gördü¹⁰. Bu tür sistemler, akış dinamiklerinin daha iyi bir temsiline izin vermesine ve nispeten statik tahlillere kıyasla fizyolojik olarak daha ilgili mimariye sahip pıhtılar oluşturmasına rağmen, basitleştirilmiş akış koşulları hala fizyolojik koşullardan bir sapmayı temsil eder. Son olarak, görüntüleme kolaylığı ve tekdüze akış modelleri nedeniyle mikroakışkan yaklaşımlar da gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, klinik olarak anlamlı tromboembolik bozuklukların çoğunda birincil olarak etkilenen daha büyük damarlarda beklenen fizyolojik koşullardan önemli bir uzaklaştırma olmaya devam etmektedirler^11,12.

Yukarıdaki tartışmayı göz önünde bulundurarak, klinik öncesi trombolitik ilaç taraması için yüksek kaliteli, in vitro tromboliz modeli geliştirdik. Model, yeni trombolitik tedavi taraması alanında yukarıda ayrıntıları verilen mevcut tuzaklardan bazılarını ele almayı amaçlamaktadır ve değişen doku plazminojen aktivatörü (tPA) konsantrasyonlarında tekrarlanabilirlik ve duyarlılık açısından doğrulanmıştır. Burada açıklanan sistem, fibrinoliz^13'ün gerçek zamanlı takibini kolaylaştırmak için bir peristaltik pompa, bir basınç sönümleyici, ısıtılmış bir rezervuar, iki basınç sensörü, bir hat içi florometre ve floresan etiketli bir Chandler döngü kesme biçimli pıhtı analogu kullanan fizyolojik kesme akışları sunar. Birlikte ele alındığında, genel sistem Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi (RT-FluFF Testi)¹⁴ olarak adlandırılır ve bu el yazması, bu yüksek kaliteli in vitro tromboliz modelinde tahlillerin başarılı bir şekilde kurulması ve yürütülmesinin inceliklerini tartışacaktır.

Protokol

Aşağıda belirtilen tüm yöntemler kurumsal inceleme kurulu (IRB) protokollerine ve kurumsal insan araştırmaları etik kuruluna uygundur. Tüm sağlıklı gönüllüler kan bağışından önce yazılı ve bilgilendirilmiş onam verdiler. Protokolde atıfta bulunulan tüm materyallerin Malzeme Tablosunda bulunabileceğini unutmayın. Bu protokol boyunca insan WB ve plazma tartışılırken, araştırma hayvanı kanı ve faktör tükenmiş kan ürünlerinin kullanımı satın alınabilir ve ikame edilebilir.

1. Tam kan alma

1. Standart flebotomi tekniklerini kullanarak rıza gösteren sağlıklı gönüllülerden venöz tam kan (WB) toplayın.
   DİKKAT: Bu protokol boyunca kan veya diğer potansiyel olarak bulaşıcı materyallerle temas riskini azaltmak için evrensel önlemlerin alındığından emin olun. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz siperi kullanımı gereklidir.
2. ~ 50 mL WB'yi doğrudan% 3.2 sodyum sitrat tüplerine toplayın ve sonraki kullanım için hemen 50 mL tüplere toplayın.
   NOT: Tüplerin üretici tarafından önerilen hacimlerine kadar doldurulmasını sağlamanın yanı sıra, sitrat tüpüne kan alınmadan önce bir atma tüpü gereklidir. Taze toplanan WB, konakçının pıhtılaşma dinamiklerini en iyi şekilde özetleyecektir. WB'nin oda sıcaklığında (kullanımdan ≤4 saat önce) kısa süreli saklanmasına izin verilir. WB, tromboelastografi¹⁵ ile incelendiğinde pıhtılaşma dinamiklerini etkilediği gösterildiğinden gece boyunca saklanmaz.

2. Pıhtı oluşumu

1. 3 mL sitrat tam kana, floresan (floresein izotiyosiyanat [FITC]) etiketli fibrinojen (FITC-Fg) 60 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin (3 mg / mL'lik bir endojen plazma fibrinojen konsantrasyonu varsayılarak 1:50 floresan etiketli fibrinojen ila modifiye edilmemiş fibrinojen oranı).
   NOT: Bu oran, pıhtı morfolojisi üzerinde minimum etki ile 1:10'a kadar yükseltilebilir. ^13,14 Floresan etiketli fibrinojen, fibrinojenin floresein izotiyosiyanat (FITC) ile reaksiyona sokulmasıyla satın alınabilir veya üretilebilir. Fibrinojen karışımı koşu başlamadan ≤5 dk önce yapılmalıdır.
   1. Fibrinojen daha önce aliquoted edilmiş ve dondurulmuşsa, polimerizasyonun erken başlamadığından ve böylece kullanılamaz hale gelmediğinden emin olmak için çözülmüş FITC-Fg'yi inceleyin (çözeltide partikül veya lif olmadığından emin olun).
2. 120 ° C'lik bir su banyosunda 37 mm çapında bir tambur ile Chandler döngü kurulumunu hazırlayın (Şekil 1). Chandler döngü cihazının, tüm pıhtı oluşturma süreci boyunca 0-90 rpm'lik sabit bir dönme hızında dönebildiğinden emin olun.
   NOT: Ek Chandler döngü kurulumu ve modifikasyonları Zeng ve ark.¹⁶.
3. Boruları kesin (iç çap 5/32", dış çap 7/32") ve tamburun etrafına sıkıca oturan ancak sıkıca oturmayan halkalar oluşturun. Burada tartışılan önerilen boru boyutu için, kapalı döngüyü oluşturmak üzere borunun uçlarını bağlamak için bir bağlantı parçası olarak kullanmak üzere standart bir 200 μL PCR tüpü kesin.
   NOT: Farklı boyutlarda pıhtılar¹⁶ üretmek için farklı boru boyutları kullanılabilir.
4. Tam kana 1:17 kalsiyum çözeltisi oranında 200 mM Kalsiyum Klorür çözeltisi ekleyerek kanın pıhtılaşmasını başlatın. 3 mL'lik bir şırınga kullanarak kanı tüpe yükleyin (tüp hacminin ~% 50'sini doldurun). Halkayı hemen uçları bağlayan Chandler döngü tamburuna yerleştirin ve döndürmeye başlayın.
   1. WB bileşenlerinin çökmesinden kaynaklanan herhangi bir sorunu önlemek için yüklemeden önce yumuşak ters çevirme ile uygun şekilde karıştırdığınızdan emin olun.
   2. Her çalıştırmada her tüpe eşit miktarda kan eklendiğinden emin olun, çünkü bu, tutarlı tutulmazsa pıhtı boyutunu etkileyebilir.
   3. Kan sütunu içindeki kabarcıklar da kanın pıhtılaşmasını etkileyebileceğinden, kabarcıkların tambura yüklenmeden önce kaçmasını kolaylaştırmak için tüpü "tahterevalli" benzeri bir şekilde hafifçe hareket ettirerek bunları çıkarın.
5. ~450 ^s-1'lik bir hesaplanmış kesme hızı elde etmek için tamburu kısmen su banyosuna batırılmış 40 RPM dönme hızında döndürün.
   NOT: Boru boyutuna ve dönüş hızına (20 ila 60 RPM) dayalı olarak hesaplanan makaslar hakkında bilgi için Zeng ve ^ark.16'ya bakın. Tipik venöz ve arteriyel kesme hızları sırasıyla 20-200 ^s-1 ve 300-1.000 ^s-1'dir ve ~ 400-500 ^s-1 pulmoner arteri temsil eder.
6. Floresan etiketli fibrinojenin foto-ağartılmasını en aza indirmek için düşük ışık koşullarında 40-60 dakika pıhtıların oluşmasına izin verin.
7. İstenilen pıhtılaşma süresine ulaşıldıktan sonra, pıhtıları tüpten çıkarın ve hemen kullanın. Yapıdan ödün vermeden pıhtıların nazikçe çıkarılmasını sağlamak için, pıhtının tüpten yavaşça küçük bir kaba kaymasını sağlamak için boruyu nazikçe ters çevirin.
   NOT: Oluşan pıhtıların gece boyunca 4 °C'de sitratlı plazma veya PBS'de saklanması, akış döngüsündeki pıhtı sindiriminin sonraki analizini etkileyebilir.

3. RT-FluFF cihaz kurulumu

1. Akış döngüsü aparatının Şekil 2'de görüldüğü gibi bağlandığından ve tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olun. Kısacası, akış döngüsü aparatı, akış yönü sırasına göre şunları içerir: Pompa > Sönümleyici > Giriş Basınç Sensörü > Pıhtı > Çıkış Basınç Sensörü > Florometre > Isıtmalı Rezervuar > Pompası. Pompa kapasitesi, deneysel akış hızı, boru çapı ve uzunluğu, sıcaklık, rezervuar hacmi ve pıhtı boyutu/geometrisi seçimini her çalışmaya özgü deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde ayarlayın.
   NOT: Bu örnek için, RT-FluFF için Chandler döngüsünde kullanılan aynı çaptaki boru kullanılmıştır. Boru aynı gün içinde birden fazla çalışma için kullanılabilir, ancak bozulma veya sızıntı açısından izlenmesi ve gerektiğinde değiştirilmesi/durulanması gerekir. Çalışmalar arasında ılık damıtılmış su ile durulama önerilir. Deneysel tasarıma bağlı olarak, her çalıştırmadan sonra borunun değiştirilmesi gerekebilir.
2. Tüm borular sabitlendikten sonra basınç monitörünü açın. Basınç monitörünün hem giriş hem de çıkış sensörleri için 0 mmHg okuduğunu kontrol edin. Olmazsa, basınç sensörlerinin atmosferik basınca açık olduğundan emin olmak için vanaları açın ve sensörleri sıfırlayın.
3. Kullanılan ısıtma bloğunu veya su banyosunu açın ve deney boyunca sıcaklığı izleyin. Fizyolojik insan vücudunun sıcaklığını taklit etmek için sıcaklığı 37 ° C'ye yakın tutun.
4. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek ve basınç sensörlerinin çalıştığını doğrulamak için pompayı istenen akış hızına getirin.
   NOT: Bu boru boyutunda ~ 160 mL / dak'lık bir akış hızı, ~ 500 ^s-1'lik bir kesme hızını temsil edecektir.
5. Pıhtı yüklemesini kolaylaştırmak için pompayı kapatın.

4. Pıhtının akış döngüsüne yüklenmesi

1. Depolanmış önceden yapılmış bir pıhtı kullanılıyorsa, pıhtıyı akış döngüsü sistemine yüklemeden önce oda sıcaklığına getirdiğinizden emin olun.
2. Pıhtı kütle kaybı, tromboliz testleri için önemli bir son nokta ölçümüdür. Önceki ölçümlere güvenmek yerine, pıhtı kütlesini akış döngüsüne yüklemeden hemen önce ölçmek en iyi uygulamadır.
   1. Pıhtı kütlesi ölçümleri, pıhtıların içindeki ve üzerindeki sıvı içeriği kütlelerini önemli ölçüde etkileyebileceğinden, numuneler arasında ve test günleri arasında tutarlılığı sağlamak için her seferinde her zaman aynı şekilde yapılmalıdır. En iyi uygulama, ölçüm işlemi boyunca pıhtıyı sıkıştırmamaya dikkat ederek, mendil üzerine önemli miktarda sıvı salmayana kadar laboratuvar mendilleri üzerindeki pıhtıları nazikçe lekelemektir.
3. Pıhtıyı plazmaya (otolog veya tip uyumlu) veya akış döngüsünde kullanılan başka bir mobil faz çözeltisine (PBS veya tanımlanmış ortam gibi) tartım kabı gibi sığ bir kaba daldırın. Mobil faz çözümü, toplam sistem hacmini kontrol etmek için doğrudan 50 mL sistem rezervuarından alınmalıdır. Pıhtı yükleme aşamasında herhangi bir trombolitik veya farmasötik test ajanı bulunmamalıdır. Akış döngüsünü çalıştırmak için mobil fazın toplam hacminin ≥50 mL olması önerilir ve tüm numunelerde tutarlı olmalıdır.
4. Akış döngüsü borusunun orta bölümünü (giriş ve çıkış sensörleri arasında) çıkarın ve borunun bir ucuna 10 mL'lik bir şırınga takın.
5. Borunun serbest ucunu kullanarak, plazmaya (veya mobil faza) yerleştirin ve boruyu astarlamak için çözeltiden küçük bir hacim alın. Ardından, boru girişini pıhtının yanına yerleştirin, başı (tipik olarak pıhtının biraz daha kalın ucu) ve kuyruğu (başın karşısındaki uç) tanımlamak için pıhtıyı dikkatlice inceleyin. Pıhtı başı giriş basınç sensörüne doğru ve çıkıştan uzağa yerleştirilmelidir. Boruyu pıhtının "kuyruk" ucuna yerleştirin ve şırınga ile boruya aspire edin.
   NOT: pıhtı başı/kuyruk yönlülüğünün görsel olarak belirlenemediği durumlarda, yönlülük en iyi şekilde Chandler döngüsünden dönüş yönünün bilinmesine dayalı olarak atanabilir - pıhtı kafası tambur dönüşünün zıt yönüne bakar.
6. Boruyu, pıhtı çıkış basınç sensörüne en yakın olacak şekilde ana aparata geri takın (pıhtı başı çıkış sensöründen uzağa bakmalıdır). Boruyu ve pıhtı kafasını iki adet 30 G'lik iğne ile "X" şeklinde delerek pıhtıyı yerine sabitleyin. Bu iğneleri çalışma süresince bırakın.
   NOT: Sönümleyici ve pompa ayarlarına bağlı olarak, pıhtının erken parçalanmamasını sağlamak için ek iğneler gerekebilir. Gerekirse, pıhtı parçalarının sistemde dolaşmasını önlemek için pıhtının akış aşağısındaki boruya bir ekran eklenebilir. Pıhtıyı tutmak için belirli sayıda iğne oluşturulduktan sonra, bunu koşullar arasında tutarlı tutun.
7. Mobil faz çözeltisinin geri kalanını alın ve rezervuar olarak 50 mL'lik bir tüpe koyun.
8. Rezervuarı su banyosuna yerleştirin ve giriş ve çıkış borularına yerleştirin (çıkış florometreden gelir ve giriş pompa kafasına girer).
9. Kullanılan florometrenin bağlı olduğunu ve izlendiğini kontrol edin. Başlangıç değerinin, deneyin başlangıcındaki yalnızca mobil faz sistem taban çizgisine kıyasla uygun olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Bir in-line florometre mevcut değilse, rezervuarın seri periyodik örneklemesi, akış döngüsü analiz periyodu boyunca belirli aralıklarla gerçekleştirilebilir. Toplanan fraksiyonlar, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir spektrofotometrede deneyin tamamlanmasının hemen ardından 96 oyuklu bir plaka kullanılarak okunabilir.
10. 50 mL'de nihai 1.000 ng / mL tPA konsantrasyonu elde etmek için 500 μL 100.000 ng / mL tPA'yı doğrudan rezervuar hacmine ekleyin. Eklenen hacim, konsantrasyon ve spesifik ilaç, istenen hedef dolaşımdaki konsantrasyona ve sistem rezervuar hacmine bağlı olacaktır.
11. Pompayı çalıştırmadan önce aşağıdakileri kontrol edin:
    1. Tüm kavşaklar güvenlidir.
    2. Basınç sensörlerinin üzerindeki iki valf uygun kapalı konumdadır.
    3. Rezervuarda kalan herhangi bir plazma (veya sıvı) değiştirildi.
    4. Trombolitik rezervuara eklendi ve uygun şekilde karıştırıldı.
    5. Giriş borusu rezervuarın dibine yakındır (bu, minimum kabarcık sağlar).
    6. Çıkış borusu güvenlidir ve istenen basınç için uygun yüksekliktedir (hangi kap konumunun modellendiğine bağlı olarak).
    7. Pompa dönüş yönü doğru (Akış sırası: Pompa > Sönümleyici > Pıhtı > Florometre > Rezervuar > Pompası).
    8. Pompa devirleri çok yükseğe ayarlanmışsa (>150 rpm), basınçtaki hızlı değişimin pıhtıyı parçalamamasını veya boru sızıntısına neden olmamasını sağlamak için daha yavaş bir hızda başlayın ve artırın.
    9. Sistemin florometreden gelen verileri uygun şekilde kaydettiğinden ve/veya deney sonrası zaman noktası okumaları için mobil fazın periyodik örneklemesi için sarf malzemelerinin hazırlandığından emin olun.
12. Pompayı açın ve istenen 160 mL/dk hacimsel akış hızını elde edecek şekilde ayarlayın veya istenen basınç elde edilene kadar akış hızını artırın. Sistem sıvı ve kabarcıklarla dolacaktır. Baloncuklar florometrik okumaları yapay olarak yükseltecektir, bu nedenle baloncukların temizlenmesini izleyin. Bunu yaptıklarında, ışıkları kapatın ve veri toplamaya başlayın.
13. Pıhtı önemli ölçüde bozulana veya istenen deney süresi geçene kadar (≥60 dakika) pompayı çalışır durumda bırakın. Çeşitli trombolitik varyasyonları test eden benzersiz deneysel koşullar oluşturmak için rezervuar aracılığıyla deney boyunca sisteme gerektiği gibi reaktifler ekleyin.
    NOT: Deney süresi, pompa akış hızına (kesme seviyesi) ve trombolitik konsantrasyonuna bağlı olacaktır.
14. Test tamamlandıktan sonra, hacimsel akış hızını azaltın ve sistemdeki sıvının çoğunu rezervuara itmek için pompa hala çalışırken giriş borusunu çıkarın (bazı mobil fazlar boruda kalacaktır). Borunun çıkış basınç sensörü tarafındaki pıhtı içeren boru bölümünü ayırın ve bir tartım teknesine indirin.
15. Sistemin içinden kalan sıvıyı ve pıhtı/pıhtı parçalarını toplamak için pıhtıyı yerinde tutan iğneleri çıkarın. Gerektiğinde sistemi temizlemeye yardımcı olması için bir şırınga kullanın.
16. Kaybedilen kütle yüzdesinin hesaplanması veya histoloji gibi ek analizler için kalan pıhtıyı tartın ve işleyin.

5. Sistemin temizlenmesi

1. Numuneler arasında, tüm sistemi yüksek rpm'de (>150 rpm) ılık suyla durulayın. Suyu hazneye doldurun ve en az 2 dakika boyunca sistemden geçirin, boşaltın ve iki tam sistem durulaması için tekrar çalıştırın. Bu durulamalardan sonra, florometre okuması taban çizgisine dönmezse, durulama işlemini ek bir döngü için tekrarlayın. Hala taban çizgisine dönmediyse, bir sonraki numuneyi tahlil etmeden önce boruyu tamamen değiştirin.
   NOT: Deneyler sırasında, borular numuneler arasında yeniden kullanılabilir; Bununla birlikte, pıhtıyı yerinde tutmak için kullanılan iğnelerle delinme nedeniyle, giriş ve çıkış basınç sensörleri arasındaki boru bölümü her çalıştırmadan sonra değiştirilmelidir. Bazı deneysel koşullar altında, herhangi bir numune çapraz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için her çalıştırmadan veya kümeleme testlerinden sonra tüm boru setinin değiştirilmesi gerekebilir.
2. O günkü deney için tüm numuneler çalıştırıldıktan sonra, tüm boruları çıkarın ve atın. T-bağlantılarını temiz olana kadar sıcak su ve kıllı bir fırça ile ovalayın ve kurumaya bırakın ve şırınga sönümleyicileri sıcak suyla durulayın. Steriliteye yardımcı olmak için% 70 EtOH kullanın.

Sonuçlar

Chandler döngü pıhtı oluşumu
Pıhtı oluştururken, herhangi bir pıhtı aykırı değeri (brüt morfoloji ve kütleye dayalı) varsa, yine de üçlü tromboliz testleri yapma yeteneğimiz olduğundan emin olmak için genellikle dörtlüleri hedefledik. Optimum yükleme koşulları varsayarsak, pıhtıların tümü uzunluk (~ 3.3 cm), ağırlık (~ 100 mg) ve Şekil 3'te gösterildiği gibi görünüm açısından oldukça eşit olmalıdır. FITC-Fg'yi kullanırken, ...

Tartışmalar

Pıhtı oluşumu ve etiketleme
Chandler döngüsünün, in-vivo trombüsleri^taklit eden pıhtıları tekrarlanabilir şekilde oluşturmak için kolay ve etkili bir yol sağladığı gösterilmiştir 16. Boru boyutu, dönme hızları, tambur çapı ve pıhtılaşma süresi gibi ince ayar parametreleri, hem arteriyel hem de venöz kaynakları taklit eden bir dizi trombusta takdir edilen mimari özellikleri yakalayabilen farklı kesme koşulları altında hızlı pıhtı ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,