Отслеживание фибринолиза цельных кровяных сгустков, образованных петлей Чандлера, под действием сдвигового потока в модели тромболизиса in vitro

Резюме

Анализы тромболизиса in vitro часто изо всех сил пытались воспроизвести условия in vivo, будь то в модельном тромбе, который переваривается, или в среде, в которой происходит тромболизис. В данной работе мы исследуем, как сочетание петли Чандлера и флуориметрического анализа проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF) используется для высокоточного мониторинга лизиса сгустков ex-vivo.

Аннотация

Тромбоэмболия и связанные с ней осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, и были разработаны различные анализы для проверки эффективности тромболитических препаратов как in vitro , так и in vivo. Существует растущий спрос на более физиологически релевантные модели тромбов in vitro для разработки лекарств из-за сложности и стоимости, связанных с животными моделями, в дополнение к их частой непереносимости на физиологию человека. Поток, давление и скорость сдвига являются важными характеристиками системы кровообращения, при этом сгустки, которые образуются под действием потока, имеют другую морфологию и характеристики пищеварения, чем статически образующиеся сгустки. Эти факторы часто не представлены в обычных анализах переваривания сгустков in vitro , что может иметь фармакологические последствия, влияющие на показатели успеха трансляции препарата.

Орометрическийанализ Real-T ime Flu Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) был разработан в качестве высокоточной платформы для тестирования тромболизиса, в которой используются флуоресцентно помеченные сгустки, образующиеся под действием поперечного потока, которые затем расщепляются с использованием циркулирующей плазмы в присутствии или без фибринолитических фармацевтических агентов. Изменение скорости потока как на этапе образования тромба, так и на этапах его расщепления позволяет системе имитировать артериальные, легочные и венозные состояния в самых разнообразных экспериментальных установках. Измерения могут проводиться непрерывно с помощью встроенного флуориметра или путем измерения дискретных временных точек, а также обычного измерения массы конечного сгустка. Анализ RT-FluFF представляет собой гибкую систему, которая позволяет отслеживать расщепление сгустков в режиме реального времени в условиях потока, которые более точно отражают физиологические условия in vivo, сохраняя при этом контроль и воспроизводимость системы тестирования in vitro.

Введение

Заболевания, в основном обусловленные тромбоэмболической этиологией, представляют собой основной источник заболеваемости и смертности в современном обществе. Проявления тромбоэмболического патогенеза включают, но не ограничиваются ими, инфаркт миокарда, ишемические инсульты, тромбозы глубоких вен и легочную эмболию¹. Огромное количество текущих исследований, охватывающих несколько дисциплин, вращается вокруг разработки безопасных и эффективных методов борьбы с патогенным тромбозом. Вариации артериальных и венозных проявлений тромбоза и различные анатомические локализации привели к разработке различных подходов к лечению. Тем не менее, острое лечение, как правило, основано на использовании фармакологического тромболизиса с помощью активаторов плазминогена с потенциалом механической тромбэктомии при определенных клинических обстоятельствах².

Разработка новых стратегий фармакологического лечения в основном опирается как на животные модели in vivo, так и на модели экстракорпорального разложения для доклинических испытаний ^3,4. Модели in-vivo, естественно, выигрывают от своей способности фиксировать сложное взаимодействие различных физиологических параметров на эффективность лечения, включая клиренс фармацевтических агентов, а также клеточные взаимодействия с лекарствами. Тем не менее, эта же сложность часто делает такие модели довольно дорогостоящими и создает дополнительные проблемы при попытке изолировать лежащую в основе фармакодинамику/кинетику у животных, которые значительно отличаются от физиологии человека. Разработка моделей in vitro помогла в этом, облегчив условия дистиллированного тестирования, в которых можно проводить разработку лекарств и скрининг, но часто им не хватает точности, необходимой для повторения изучаемого состояния заболевания.

Обычно встречающиеся протоколы in vitro для тестирования новых тромболитиков основаны на использовании тромбов, сформированных и лизированных в статических условиях, при этом остаточная масса тромба служит первичной конечной точкой ^5,6. К сожалению, такие методы не учитывают механические аспекты лизиса тромба, такие как турбулентный поток и перепады давления через тромбы, которые могут значительно изменить фармакодинамику испытуемых препаратов. Кроме того, сгустки, образующиеся в статических условиях, содержат микроархитектуру, отличную от физиологических сгустков. Было показано, что присутствие сдвига во время образования тромба воспроизводимо влияет на результирующие характеристики тромба, такие как активация тромбоцитов и сшивание фибрина. Сгустки, образующиеся при сдвиговом потоке, демонстрируют сложную неоднородность от кончика до хвоста, которая отсутствует в статически сформированных сгустках ^7,8. Такие отклонения от физиологической архитектуры тромба могут повлиять на важную характеристику разработки лекарственного средства, которая включает проникновение препарата в тромб и последующую эффективность лизиса⁹.

Для устранения некоторых из этих ограничений, связанных с использованием статических моделей свертывания/лизиса сгустков, наблюдается возрождение петли Чандлера как для образования сгустков, так и для лизиса сгустков в присутствии сдвига. Несмотря на то, что такие системы позволяют лучше представить динамику потока и генерировать сгустки с более физиологически релевантной архитектурой по сравнению с относительно статическими анализами, их упрощенные условия потока все же представляют собой отклонение от физиологических условий. Наконец, микрофлюидные подходы также были использованы из-за их простоты визуализации и равномерных схем течения; Тем не менее, они остаются значительным удалением от физиологических состояний, ожидаемых в крупных сосудах, в первую очередь пораженных при наиболее клинически значимых тромбоэмболических заболеваниях^11,12.

Учитывая вышеизложенное, мы разработали высокоточную модель тромболизиса in vitro для доклинического скрининга тромболитических препаратов. Модель направлена на устранение некоторых из описанных выше ловушек в области скрининга новой тромболитической терапии и была проверена на воспроизводимость и чувствительность при различных концентрациях активатора тканевого плазминогена (tPA). Описанная здесь система обеспечивает физиологические сдвиговые потоки с использованием перистальтического насоса, демпфера давления, нагреваемого резервуара, двух датчиков давления, встроенного флуориметра и флуоресцентно помеченного аналога сгустка Чандлера, формируемого при сдвиге, для облегчения отслеживания фибринолиза¹³ в режиме реального времени. В совокупности вся система называется Флуориметрический анализ проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF Assay)¹⁴ , и в этой рукописи будут обсуждаться тонкости успешной постановки и проведения анализов в этой высокоточной модели тромболизиса in vitro .

протокол

Все методы, упомянутые ниже, соответствуют протоколам институционального наблюдательного совета (IRB) и институционального комитета по этике исследований человека. Все здоровые добровольцы предоставили письменное и информированное согласие до сдачи крови. Следует отметить, что все материалы, на которые ссылается протокол, можно найти в Таблице материалов. В то время как ВБ и плазма человека обсуждаются в настоящем протоколе, можно приобрести и заменить их кровью исследуемых животных и продуктами крови, обедненными факторами.

1. Забор цельной крови

1. Соберите венозную цельную кровь (WB) у здоровых добровольцев с использованием стандартных методов флеботомии.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что соблюдаются универсальные меры предосторожности для снижения риска контакта с кровью или другими потенциально инфекционными материалами на протяжении всего этого протокола. Необходимо использовать перчатки, лабораторный халат и лицевой щиток.
2. Соберите ~50 мл WB непосредственно в пробирки с 3,2% цитратом натрия и немедленно объедините их в пробирки объемом 50 мл для последующего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед забором крови в цитратную пробирку необходимо выбросить пробирку в дополнение к тому, чтобы пробирки были заполнены до рекомендованного производителем объема. Свежесобранный ВБ лучше всего повторит динамику свертывания крови хозяина. Допускается кратковременное хранение ВБ при комнатной температуре (≤за 4 ч до использования). WB не хранится в течение ночи, так как было показано, что это влияет на динамику свертывания крови при исследовании с помощью тромбоэластографии¹⁵.

2. Образование тромба

1. В 3 мл цитратированной цельной крови добавьте флуоресцентно (флуоресцеин изотиоцианат [FITC]) меченый фибриноген (FITC-Fg) до конечной концентрации 60 г/мл (соотношение 1:50 флуоресцентно меченного фибриногена к немодифицированному фибриногену при условии концентрации эндогенного фибриногена в плазме крови 3 мг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это соотношение может быть увеличено до 1:10 с минимальным влиянием на морфологию тромба. ^13,14 Флуоресцентно меченный фибриноген может быть приобретен или получен путем реакции фибриногена с флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТК). Смешивание фибриногена следует проводить за ≤5 минут до начала бега.
   1. Если фибриноген был ранее аликвотирован и заморожен, осмотрите размороженный FITC-Fg, чтобы убедиться, что полимеризация не началась преждевременно, что делает его непригодным для использования (убедитесь в отсутствии частиц или волокон в растворе).
2. Подготовьте установку петли Чандлера с барабаном диаметром 120 мм на водяной бане при температуре 37 °C (Рисунок 1). Убедитесь, что устройство петли Чандлера способно вращаться с фиксированной скоростью вращения от 0 до 90 об/мин в течение всего процесса образования тромба.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные сведения о настройке и модификации петли Чендлера можно найти в работе Zeng et al.¹⁶.
3. Отрежьте трубку (внутренний диаметр 5/32", внешний диаметр 7/32") и сформируйте петли, которые плотно, но не плотно прилегают к барабану. Для рекомендуемого размера трубки, описанного здесь, вырежьте стандартную ПЦР-пробирку объемом 200 мкл для использования в качестве фитинга для соединения концов трубки с образованием замкнутого контура.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки разных размеров могут быть использованы для получения сгустков^{разного размера 16}.
4. Инициируйте свертывание крови путем добавления 200 мМ раствора хлорида кальция в соотношении 1:17 раствора кальция к цельной крови. Загрузите кровь в трубку (заполните ~50% объема пробирки) с помощью шприца объемом 3 мл. Немедленно поместите петлю на барабан петли Чандлера, соединяющий концы, и начните вращение.
   1. Обеспечьте правильное смешивание с помощью мягкой инверсии перед загрузкой, чтобы избежать проблем, связанных с усадкой компонентов WB.
   2. Убедитесь, что в каждую пробирку добавляется одинаковое количество крови, так как это может повлиять на размер тромба, если его не держать постоянно.
   3. Поскольку пузырьки в столбе крови также могут влиять на свертываемость крови, удалите их, осторожно перемещая трубку в виде «качелей», чтобы облегчить выход пузырьков перед загрузкой их в барабан.
5. Вращайте барабан, частично погруженный в водяную баню, со скоростью вращения 40 об/мин, чтобы достичь расчетной скорости сдвига ~450 ^с-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Zeng et al. для получения информации о рассчитанных ножницах на основе размера трубки и скорости вращения (от 20 до 60 об/мин)¹⁶. Типичная скорость венозного и артериального сдвига составляет 20-200 ^с-1 и 300-1000 ^с-1 соответственно, при этом ~400-500 ^с-1 является репрезентативной для легочной артерии.
6. Дайте образоваться сгусткам в течение 40-60 минут в условиях низкой освещенности, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание фибриногена с флуоресцентной меткой.
7. После того, как будет достигнуто желаемое время свертывания, удалите сгустки из трубки и немедленно используйте их. Чтобы обеспечить бережное удаление сгустков без ущерба для структуры, аккуратно переверните трубку, чтобы сгусток медленно выскользнул из трубки в небольшой контейнер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение образовавшихся сгустков в цитратированной плазме или PBS в течение ночи при температуре 4 °C может повлиять на последующий анализ разложения сгустков в проточной петле.

3. Настройка прибора RT-FluFF

1. Убедитесь, что устройство контура потока подключено, как показано на рисунке 2 , и что все соединения надежно защищены. Короче говоря, аппарат контура потока включает в себя, в порядке направления потока: насос > демпфер > датчик давления на входе > датчик давления > сгусток датчик давления на выходе > флуориметр > нагреваемый резервуар > насос. Отрегулируйте выбор производительности насоса, экспериментального расхода, диаметра и длины трубки, температуры, объема резервуара, а также размера/геометрии сгустка в соответствии с экспериментальными потребностями, уникальными для каждого исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере трубка того же диаметра, которая использовалась в петле Чандлера, была использована для RT-FluFF. Трубка может использоваться для нескольких прогонов в один и тот же день, но ее необходимо контролировать на предмет деградации или утечки и при необходимости менять/промывать ее. Промывание рекомендуется теплой дистиллированной водой между прогонами. В зависимости от экспериментального дизайна может потребоваться замена трубки после каждого прогона.
2. Как только все трубки будут закреплены, включите монитор давления. Убедитесь, что монитор давления показывает 0 мм рт.ст. для датчиков на входе и выходе. Если это не так, откройте клапаны, чтобы убедиться, что датчики давления открыты для атмосферного давления, и обнулите датчики.
3. Включите используемый нагревательный блок или водяную баню и следите за температурой в ходе эксперимента. Поддерживайте температуру на уровне 37 °C, чтобы имитировать физиологическую температуру человеческого тела.
4. Включите насос на нужный расход, чтобы проверить наличие утечек и убедиться в работоспособности датчиков давления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока ~160 мл/мин при этом размере трубки будет представлять скорость сдвига ~500 ^с-1.
5. Выключите насос, чтобы облегчить загрузку сгустка.

4. Загрузка сгустка в проточный контур

1. Если используется ранее приготовленный сгусток, который хранился, обязательно доведите его до комнатной температуры перед загрузкой в систему проточного контура.
2. Потеря массы тромба является важной конечной точкой измерения для анализов тромболизиса. Рекомендуется измерять массу сгустка непосредственно перед загрузкой его в проточный контур, а не полагаться на предварительные измерения.
   1. Измерения массы сгустков всегда должны проводиться одним и тем же образом, чтобы обеспечить постоянство между образцами и днями анализа, поскольку содержание жидкости внутри и на сгустках может значительно повлиять на их массу. Лучше всего аккуратно промакивать сгустки на лабораторных салфетках до тех пор, пока они не перестанут выделять значительное количество жидкости на салфетку, стараясь не сдавливать сгусток на протяжении всего процесса измерения.
3. Погрузите сгусток в плазму (аутологичную или согласованную по типу) или другой подвижный фазовый раствор, используемый в контуре потока (например, PBS или определенную среду), в неглубокую емкость, такую как весовая чашка. Решение для подвижной фазы должно быть взято непосредственно из резервуара системы объемом 50 мл для контроля общего объема системы. На стадии загрузки тромба не должно присутствовать тромболитический или фармацевтический агент. Общий объем подвижной фазы для запуска проточной петли рекомендуется составлять ≥50 мл и должен быть одинаковым для всех образцов.
4. Снимите центральную секцию трубки проточной петли (между датчиками на входе и выходе) и прикрепите шприц объемом 10 мл к одному концу трубки.
5. Используя свободный конец трубки, поместите ее в плазму (или подвижную фазу) и возьмите небольшой объем раствора для заполнения трубки. Затем поместите входное отверстие трубки рядом со сгустком, внимательно исследуя сгусток, чтобы определить голову (обычно немного более толстый конец сгустка) и хвост (конец напротив головки). Головка сгустка должна быть расположена по направлению к датчику давления на входе и в сторону от выпускного отверстия. Поместите трубку на «хвостовой» конец сгустка и втяните ее в трубку с помощью шприца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: в случаях, когда направленность головки/хвоста сгустка не может быть определена визуально, направленность может быть назначена наилучшим образом, основываясь на знании направления вращения петли Чендлера - головка сгустка обращена в направлении, противоположном вращению барабана.
6. Прикрепите трубку обратно к основному устройству таким образом, чтобы сгусток находился ближе всего к датчику давления на выходе (головка сгустка должна быть обращена в сторону от датчика выхода). Закрепите тромб на месте, проколов трубку и головку тромба двумя иглами 30 G в форме буквы «X». Оставьте эти иглы на время прогона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от настроек демпфера и насоса могут потребоваться дополнительные иглы, чтобы сгусток не фрагментировался преждевременно. При необходимости к трубке после тромба может быть добавлено сито, чтобы предотвратить циркуляцию фрагментов тромба в системе. После того, как установлено определенное количество игл для удержания тромба, сохраняйте его неизменным в любых условиях.
7. Возьмите оставшуюся часть раствора подвижной фазы и поместите его в пробирку объемом 50 мл в качестве резервуара.
8. Поместите резервуар на водяную баню и вставьте в него входную и выпускную трубки (выход идет от флуориметра, а вход идет в головку насоса).
9. Убедитесь, что используемый флуориметр подключен и контролируется. Убедитесь, что начальное значение является подходящим по сравнению с базовым уровнем мобильной системы, работающей только на фазе, в начале эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если встраиваемый флуориметр недоступен, можно проводить последовательный периодический отбор проб из резервуара через определенные промежутки времени в течение всего периода анализа проточной петли. Собранные фракции могут быть считаны с помощью 96-луночного планшета сразу после завершения эксперимента на любом коммерчески доступном спектрофотометре.
10. Добавьте 500 мкл 100 000 нг/мл tPA непосредственно в объем резервуара для достижения конечной концентрации 1 000 нг/мл tPA в 50 мл. Объем, концентрация и конкретное добавляемое лекарственное средство будут зависеть от желаемой целевой циркулирующей концентрации и объема резервуара системы.
11. Перед запуском насоса проверьте следующее:
    1. Все перекрестки безопасны.
    2. Два клапана над датчиками давления находятся в соответствующем закрытом положении.
    3. Остаточная плазма (или жидкость) была заменена в резервуаре.
    4. Тромболитик был добавлен в резервуар и правильно перемешан.
    5. Входная трубка находится в нижней части резервуара (это обеспечивает минимальное количество пузырьков).
    6. Выпускная трубка надежно закреплена и находится на высоте, соответствующей требуемому давлению (в зависимости от того, какое местоположение резервуара моделируется).
    7. Направление вращения насоса правильное (Порядок потока: Насос > Демпфер > Сгусток > Флуориметр > Резервуар > Насос).
    8. Если частота вращения насоса установлена на очень высоких оборотах (>150 об/мин), начните с более низкой скорости и увеличивайте давление, чтобы быстрое изменение давления не привело к фрагментации тромба или утечке трубки.
    9. Убедитесь, что система правильно записывает данные с флуориметра и/или подготовлены расходные материалы для периодического отбора проб подвижной фазы для считывания временных точек после эксперимента.
12. Включите насос и настройте его на достижение желаемого объемного расхода 160 мл/мин или увеличивайте расход до достижения желаемого давления. Система заполнится жидкостью и пузырьками. Пузырьки будут искусственно повышать флуориметрические показания, поэтому следите за тем, чтобы пузырьки не исчезли. Как только они это сделают, выключите свет и начните сбор данных.
13. Оставьте насос включенным до тех пор, пока сгусток значительно не разложится или не истечет желаемое время эксперимента (≥60 мин). Добавляйте реагенты по мере необходимости в систему на протяжении всего эксперимента через резервуар для создания уникальных экспериментальных условий, тестируя различные вариации тромболитических изменений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время эксперимента будет зависеть от расхода насоса (уровня сдвига) и концентрации тромболитика.
14. После завершения анализа уменьшите объемный расход и удалите входную трубку, пока насос все еще работает, чтобы протолкнуть большую часть жидкости из системы в резервуар (в трубке останется некоторая подвижная фаза). Отсоедините секцию трубки, содержащую сгусток, со стороны датчика давления на выходе трубки и опустите ее в лодку для взвешивания.
15. Удалите иглы, которые удерживают тромб на месте, чтобы собрать остаточную жидкость из системы и сгусток/сгустки. При необходимости используйте шприц для очистки системы.
16. Взвесьте и обработайте оставшийся сгусток для дополнительного анализа, такого как расчет процента потери массы или для гистологии.

5. Чистка системы

1. Между образцами промойте всю систему теплой водой на высоких оборотах (>150 об/мин). Загрузите воду в резервуар и пропустите через систему не менее 2 минут, опорожните и снова запустите для двух полных промывок системы. После этих полосканий, если показания флуориметра не возвращаются к исходному уровню, повторите процесс полоскания для дополнительного цикла. Если он все еще не вернулся к исходному уровню, полностью замените трубку перед анализом следующего образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время экспериментов трубки могут быть повторно использованы между образцами; Однако из-за перфорации иглами, используемыми для удержания тромба на месте, участок трубки между датчиками давления на входе и выходе следует заменять после каждого прогона. В некоторых экспериментальных условиях может потребоваться замена всего комплекта трубок после каждого прогона или кластерных анализов для устранения любого перекрестного загрязнения пробы.
2. После того, как все образцы были проверены для экспериментов в этот день, удалите все трубки и выбросьте. Потрите Т-образные соединения горячей водой и щеткой со щетиной до чистоты и дайте высохнуть и промойте демпферы шприца горячей водой. Используйте 70% EtOH для поддержания стерильности.

Результаты

Образование тромба петли Чандлера
При формировании тромбов мы, как правило, стремились к квадрупликатам, чтобы гарантировать, что при наличии каких-либо выбросов сгустков (на основе общей морфологии и массы) у нас все еще есть возможность проводить тройной анализ тромболизи?...

Обсуждение

Образование сгустков и маркировка
Было продемонстрировано, что петля Чандлера является простым и эффективным средством воспроизводимого образования тромбов, имитирующих тромбы 16 in vivo. Точная настройка таких параметров, как размер трубки, скорость вращени...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,