מעקב אחר פיברינוליזה של קרישי דם שלמים שנוצרו בלולאה של צ'נדלר תחת זרימת גזירה במודל פקקת חוץ גופית

Summary

בדיקות טרומבוליזה חוץ-גופית נאבקו לעתים קרובות לשכפל תנאי in-vivo בין אם בפקקת המודל המעוכלת או בסביבה שבה מתרחשת פקקת. במאמר זה, אנו חוקרים כיצד צימוד לולאת צ'נדלר ובדיקת פיברינוליזה פלואורומטרית זורמת בזמן אמת (RT-FluFF) משמש לניטור ליזה של קרישי דם באיכות גבוהה, ex-vivo.

Abstract

טרומבואמבוליזם וסיבוכים נלווים הם גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם ובדיקות שונות פותחו כדי לבדוק את יעילות התרופה הטרומבוליטית הן במבחנה והן in vivo. יש ביקוש גובר למודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של קריש דם במבחנה לפיתוח תרופות בשל המורכבות והעלות הכרוכות במודלים של בעלי חיים, בנוסף לחוסר התרגום שלהם לעתים קרובות לפיזיולוגיה האנושית. זרימה, לחץ וקצב גזירה הם מאפיינים חשובים של מערכת הדם, כאשר קרישי דם הנוצרים תחת זרימה מציגים מורפולוגיה ומאפייני עיכול שונים מאשר קרישי דם שנוצרו באופן סטטי. גורמים אלה לעתים קרובות אינם מיוצגים בבדיקות קונבנציונליות של עיכול קרישי דם במבחנה , אשר יכולות להיות להן השלכות פרמקולוגיות המשפיעות על שיעורי ההצלחה של תרופות.

בדיקת Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) פותחה כפלטפורמת בדיקת פקקת באיכות גבוהה המשתמשת בקרישי דם מתויגים פלואורסצנטית הנוצרים תחת זרימת גזירה, אשר מתעכלים לאחר מכן באמצעות פלזמה במחזור בנוכחות או היעדר חומרים פרמצבטיים פיברינוליטיים. שינוי קצבי הזרימה הן של שלבי היווצרות קרישי הדם והן של שלבי עיכול הקריש מאפשר למערכת לחקות מצבים עורקיים, ריאתיים וורידיים על פני מערכי ניסוי מגוונים ביותר. ניתן לבצע מדידות ברציפות באמצעות פלואורומטר בתוך הקו או על ידי לקיחת נקודות זמן בדידות, כמו גם מדידת מסת קריש נקודת קצה קונבנציונלית. בדיקת RT-FluFF היא מערכת גמישה המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר עיכול קריש דם בתנאי זרימה המייצגים בצורה מדויקת יותר תנאים פיזיולוגיים in-vivo תוך שמירה על הבקרה והשחזור של מערכת בדיקות במבחנה.

Introduction

מחלות הנובעות ביסודן מאטיולוגיות טרומבו-אמבוליות מהוות מקור עיקרי לתחלואה ולתמותה בחברה של ימינו. ביטויים של פתוגנזה טרומבו-אמבולית כוללים, אך אינם מוגבלים לאוטם שריר הלב, שבץ איסכמי, פקקת ורידים עמוקים ואמבולי ריאתי¹. כמות עצומה של מחקר מתמשך, המתפרש על פני דיסציפלינות רבות, סובבת סביב פיתוח שיטות בטוחות ויעילות להתמודדות עם פקקת פתוגנית. שינויים בביטויים עורקיים וורידיים של פקקת ומיקומים אנטומיים משתנים הביאו לפיתוח גישות טיפול שונות. עם זאת, טיפול אקוטי מסתמך בדרך כלל על שימוש תרומבוליזה פרמקולוגית באמצעות מפעילי פלסמינוגן עם פוטנציאל לכריתת תרומבקטומיה מכנית בנסיבות קליניות מסוימות².

הפיתוח של אסטרטגיות טיפול פרמקולוגיות חדשניות מסתמך ביסודו הן על מודלים של בעלי חיים in-vivo והן על מודלים של עיכול במבחנה לבדיקות פרה-קליניות ^3,4. מודלים של In-vivo נהנים באופן טבעי מיכולתם ללכוד את האינטראקציה המורכבת של פרמטרים פיזיולוגיים שונים על יעילות הטיפול הכוללים פינוי של חומרים פרמצבטיים כמו גם אינטראקציות תאיות עם תרופות. עם זאת, אותה מורכבות הופכת לעתים קרובות מודלים כאלה ליקרים למדי ומציגה בעיות נוספות כאשר מנסים לבודד את הפרמקו-דינמיקה/קינטיקה הבסיסית בבעלי חיים השונים באופן משמעותי מהפיזיולוגיה האנושית. הפיתוח של מודלים במבחנה סייע בכך שהקל על סביבת בדיקות מזוקקות שבה ניתן לבצע פיתוח תרופות ובדיקות סקר, אך לעתים קרובות חסרה את הנאמנות הדרושה כדי לשחזר את מצב המחלה הנחקר.

פרוטוקולים במבחנה נפוצים לבדיקת טרומבוליטיקה חדשנית מסתמכים על ניצול קרישי דם שנוצרו וליזה בתנאים סטטיים שבהם מסת הקריש השיורית משמשת כנקודת הקצה העיקרית ^5,6. למרבה הצער, טכניקות כאלה אינן מסתיירות בהיבטים המכניים של ליזה קרישה כגון זרימה טורבולנטית וטיפות לחץ טרנס-טרומבוס שיכולות לשנות באופן משמעותי את הפרמקודינמיקה של תרופות בדיקה. בנוסף, קרישי דם הנוצרים בתנאים סטטיים מכילים מיקרו-ארכיטקטורה השונה מקרישי דם פיזיולוגיים. נוכחות של גזירה במהלך היווצרות קריש הוכחה כמשפיעה על מאפייני הקריש המתקבלים כגון הפעלת טסיות דם וקישור פיברין. קרישי דם המיוצרים תחת זרימת גזירה מפגינים הטרוגניות מורכבת מקצה לזנב הנעדרת בקרישי דם שנוצרו סטטית ^7,8. סטיות כאלה מארכיטקטורת הקריש הפיזיולוגי עשויות להשפיע על אפיון פיתוח תרופות חשוב הכולל חדירת תרופה בתוך פקקת ויעילות ליזה לאחר מכן⁹.

כדי להתמודד עם חלק מהמגבלות הללו הקשורות לשימוש במודלים סטטיים של קרישה / קריש דם, אימוץ לולאת צ'נדלר הן ליצירת קריש והן לליזה של קריש דם בנוכחות גזירה ראה התעוררות מחודשת¹⁰. למרות שמערכות כאלה מאפשרות ייצוג טוב יותר של דינמיקת זרימה ומייצרות קרישי דם עם ארכיטקטורה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית בהשוואה לבדיקות סטטיות יחסית, תנאי הזרימה הפשוטים שלהן עדיין מייצגים סטייה מהתנאים הפיזיולוגיים. לבסוף, גישות מיקרופלואידיות ננקטו גם בשל קלות ההדמיה ודפוסי הזרימה האחידים שלהן; עם זאת, הם עדיין מהווים הסרה משמעותית מהתנאים הפיזיולוגיים הצפויים בתוך כלי הדם הגדולים יותר המושפעים בעיקר ברוב הפרעות טרומבו-אמבוליות רלוונטיות מבחינה קלינית^11,12.

בהתחשב בדיון לעיל, פיתחנו מודל תרומבוליזה במבחנה באיכות גבוהה לבדיקת תרופות תרומבוליטיות פרה-קליניות. המודל נועד לטפל בכמה מהמלכודות הנוכחיות שפורטו לעיל בתחום הסינון החדשני לטיפול תרומבוליטי ואומת לשחזור ורגישות בריכוזים משתנים של מפעיל פלסמינוגן רקמתי (tPA). המערכת המתוארת כאן מציעה זרמי גזירה פיזיולוגיים באמצעות משאבה פריסטלטית, מדכאת לחץ, מאגר מחומם, שני חיישני לחץ, פלואורומטר מובנה ואנלוג צ'נדלרי בצורת קריש גזירה עם תווית פלואורסצנטית כדי להקל על מעקב בזמן אמת אחר פיברינוליזה¹³. יחד, המערכת הכוללת נקראת Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)¹⁴ וכתב יד זה ידון במורכבויות של הקמה והפעלה מוצלחת של בדיקות במודל טרומבוליזה חוץ-גופית זה באיכות גבוהה.

Protocol

כל השיטות המוזכרות להלן הן בהתאם לפרוטוקולים של ועדת הביקורת המוסדית (IRB) וועדת האתיקה המוסדית למחקר אנושי. כל המתנדבים הבריאים נתנו הסכמה בכתב ומדעת לפני תרומת הדם. שימו לב, ניתן למצוא את כל החומרים המוזכרים בפרוטוקול בטבלת החומרים. בעוד ש-WB ופלזמה אנושיים נידונים לאורך פרוטוקול זה, ניתן לרכוש ולהחליף את השימוש בדם של חיות מחקר ובמוצרי דם מרוקנים מפקטורים.

1. איסוף דם שלם

1. איסוף דם ורידי שלם (WB) ממתנדבים בריאים בהסכמה באמצעות טכניקות פלבוטומיה סטנדרטיות.
   התראה: ודא כי אמצעי זהירות אוניברסליים ננקטים כדי להפחית את הסיכון למגע עם דם או חומרים אחרים שעלולים להיות זיהומיים לאורך פרוטוקול זה. יש צורך להשתמש בכפפות, מעיל מעבדה ומגן פנים.
2. יש לאסוף ~50 מ"ל של WB ישירות לתוך צינורות נתרן ציטראט 3.2% ומיד לאוגד לתוך צינורות 50 מ"ל לשימוש לאחר מכן.
   הערה: יש צורך בצינורית השלכה לפני איסוף הדם לציטראט בנוסף להבטחת מילוי הצינורות לנפח המומלץ על ידי היצרן. WB שנאסף טרי ישחזר בצורה הטובה ביותר את דינמיקת הקרישה של המארח. אחסון לטווח קצר של WB בטמפרטורת החדר (≤4 שעות לפני השימוש) מותר. WB אינו מאוחסן בן לילה מכיוון שהוכח כי זה משפיע על דינמיקת הקרישה כאשר נבדק באמצעות טרומבואלסטוגרפיה¹⁵.

2. היווצרות קריש

1. לתוך 3 מ"ל של דם שלם ציטרציה, להוסיף פלואורסצנטית (fluorescein isothiocyanate [FITC]) מתויג פיברינוגן (FITC-Fg) לריכוז סופי של 60 מיקרוגרם / מ"ל (יחס של 1:50 מתויג פלואורסצנטית פיברינוגן לפיברינוגן ללא שינוי בהנחה ריכוז פיברינוגן פלזמה אנדוגני של 3 מ"ג / מ"ל).
   הערה: ניתן להגדיל יחס זה ל-1:10 עם השפעה מינימלית על המורפולוגיה של הקריש. ^13,14 ניתן לרכוש או ליצור פיברינוגן מתויג פלואורסצנטית על ידי תגובה פיברינוגן עם איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC). ערבוב פיברינוגן צריך להיעשות ≤5 דקות לפני תחילת הריצה.
   1. אם פיברינוגן היה בעבר aliquoted ו קפוא, לבדוק את FITC-Fg מופשר כדי לוודא פילמור לא התחיל מוקדם מדי ובכך להפוך אותו שמיש (להבטיח את היעדר חלקיקים או סיבים בתמיסה).
2. הכינו את מערך לולאת צ'נדלר עם תוף בקוטר 120 מ"מ באמבט מים של 37°C (איור 1). ודא שהתקן הלולאה של צ'נדלר מסוגל להסתובב בקצב סיבוב קבוע של 0-90 סל"ד במהלך כל תהליך היווצרות הקריש.
   הערה: ניתן למצוא הגדרות ושינויים נוספים בלולאת צ'נדלר ב- Zeng et al.¹⁶.
3. חותכים צינורות (קוטר פנימי 5/32 אינץ', קוטר חיצוני 7/32 אינץ') ויוצרים לולאות שמתאימות היטב אך לא בחוזקה סביב התוף. עבור גודל הצינור המומלץ שנדון כאן, חתכו צינור PCR סטנדרטי של 200 μL לשימוש כהתאמה לחיבור קצות הצינור ליצירת הלולאה הסגורה.
   הערה: ניתן להשתמש בצינורות בגדלים שונים כדי לייצר קרישי דם בגדלים שונים¹⁶.
4. להתחיל קרישת דם על ידי הוספת 200 mM תמיסת סידן כלוריד ביחס של 1:17 תמיסת סידן לדם שלם. טען את הדם לתוך הצינור (מלא ~ 50% מנפח הצינור) באמצעות מזרק 3 מ"ל. הניחו מיד את הלולאה על תוף הלולאה של צ'נדלר המחבר בין הקצוות והתחילו בסיבוב.
   1. ודא ערבוב נכון עם היפוך עדין לפני הטעינה כדי למנוע בעיות הנובעות מהתגבשות רכיבי WB.
   2. ודא כי כמות שווה של דם מתווספת לכל צינור בכל ריצה, שכן זה יכול להשפיע על גודל הקריש אם לא נשמר עקבי.
   3. מכיוון שבועות בתוך עמוד הדם יכולות להשפיע גם על קרישת הדם, הסר אותן על ידי הזזת הצינור בעדינות באופן דמוי "נדנדה" כדי להקל על בריחת הבועות לפני העמסתן על התוף.
5. סובב את התוף השקוע חלקית באמבט המים בקצב סיבוב של 40 סל"ד כדי להשיג קצב גזירה מחושב של ~450 ^s-1.
   הערה: עיין ב- Zeng et al. לקבלת מידע על גזירות מחושבות בהתבסס על גודל הצינור ומהירות הסיבוב (20 עד 60 סל"ד)¹⁶. שיעורי גזירה ורידיים ועורקיים אופייניים הם 20-200 ^s-1 ו- 300-1,000 ^s-1, בהתאמה, כאשר ~ 400-500 ^s-1 מייצג את עורק הריאה.
6. אפשרו להיווצרות קרישי דם במשך 40-60 דקות בתנאי תאורה חלשה כדי למזער את ההלבנה של הפיברינוגן המתויג באופן פלואורסצנטי.
7. לאחר שהגיע זמן הקרישה הרצוי, הוציאו את הקרישים מהצינורית והשתמשו בהם מיד. כדי להבטיח הסרה עדינה של הקרישים מבלי לפגוע במבנה, הפכו בעדינות את הצינור כדי לאפשר לקריש להחליק באיטיות החוצה מהצינור לתוך מיכל קטן.
   הערה: אחסון קרישי דם שנוצרו בפלזמה ציטרלית או PBS למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עשוי להשפיע על ניתוח מאוחר יותר של עיכול קריש דם בלולאת הזרימה.

3. הגדרת מכשיר RT-FluFF

1. ודא שמנגנון לולאת הזרימה מחובר כפי שניתן לראות באיור 2 ושכל החיבורים מאובטחים. בקיצור, מנגנון לולאת הזרימה כולל, לפי סדר כיוון הזרימה: משאבה > שיכוך > חיישן לחץ כניסה > חיישן לחץ > קריש > פלואורומטר > משאבת > מאגר מחומם. התאם את בחירת קיבולת המשאבה, קצב זרימת הניסוי, קוטר ואורך הצינורות, הטמפרטורה, נפח המאגר וגודל / גיאומטריה של קריש כדי להתאים לצרכים הניסיוניים הייחודיים לכל מחקר.
   הערה: עבור דוגמה זו, אותו צינור בקוטר המשמש בלולאת צ'נדלר שימש עבור RT-FluFF. ניתן להשתמש בצנרת למספר ריצות באותו היום, אך יש לעקוב אחריה לאיתור התפרקות או דליפה ולהחליף/לשטוף לפי הצורך. מומלץ לשטוף במים מזוקקים חמים בין המסלולים. בהתאם לתכנון הניסוי, ייתכן שיהיה צורך להחליף את הצינור לאחר כל ריצה.
2. לאחר שכל הצינוריות מאובטחות, הפעל את צג הלחץ. בדוק שצג הלחץ קורא 0 מ"מ כספית הן עבור חיישני הכניסה והן עבור חיישני היציאה. אם לא, פתח את השסתומים כדי לוודא שחיישני הלחץ פתוחים ללחץ אטמוספרי ואפס את החיישנים.
3. הפעל את בלוק החימום או אמבט המים הנמצאים בשימוש ועקוב אחר הטמפרטורה במהלך הניסוי. שמור על הטמפרטורה קרוב ל 37 ° C כדי לחקות את טמפרטורת גוף האדם פיזיולוגית.
4. הפעל את המשאבה לקצב הזרימה הרצוי כדי לבדוק אם יש נזילות ולוודא שחיישני הלחץ פועלים.
   הערה: קצב זרימה של ~160 מ"ל/דקה בגודל צינורות זה ייצג קצב גזירה של ~500 ^s-1.
5. כבה את המשאבה כדי להקל על העמסת קרישי דם.

4. העמסת הקריש לתוך לולאת הזרימה

1. אם נעשה שימוש בקריש דם שיוצר בעבר ואוחסן, הקפד להביא את הקריש לטמפרטורת החדר לפני העמסתו למערכת לולאת הזרימה.
2. אובדן מסת קריש הוא מדד נקודת קצה חשוב עבור בדיקות פקקת. מומלץ למדוד מסת קריש דם רגע לפני העמסתו ללולאת הזרימה במקום להסתמך על מדידות קודמות.
   1. מדידות מסת קריש צריכות תמיד להיעשות באותה צורה בכל פעם כדי להבטיח עקביות בין דגימות ועל פני ימי בדיקה, שכן תוכן נוזלי בתוך ועל הקרישים יכול להשפיע באופן משמעותי על המסה שלהם. השיטה המומלצת היא להדביק בעדינות קרישי דם על מגבוני מעבדה עד שהם כבר לא משחררים כמות משמעותית של נוזלים על המגבון, תוך זהירות שלא לדחוס את הקריש לאורך כל תהליך המדידה.
3. השקיעו את הקריש בפלזמה (אוטולוגית או תואמת סוג), או פתרון פאזה נייד אחר המשמש בלולאת הזרימה (כגון PBS או מדיה מוגדרת) במיכל רדוד כגון צלחת שקילה. יש לקחת את פתרון הפאזה הנייד ישירות ממאגר המערכת של 50 מ"ל כדי לשלוט בנפח המערכת הכולל. אין צורך בחומר בדיקה תרופתי או תרופתי במהלך שלב העמסת הקריש. הנפח הכולל של השלב הנייד להפעלת לולאת הזרימה מומלץ להיות ≥50 מ"ל וצריך להיות עקבי בכל הדגימות.
4. הסר את החלק המרכזי של צינור לולאת הזרימה (בין חיישני כניסה ויציאה) וחבר מזרק 10 מ"ל לקצה אחד של הצינור.
5. באמצעות הקצה החופשי של הצינור, מניחים אותו בשלב הפלזמה (או הנייד) ותופסים נפח קטן של התמיסה כדי להקדים את הצינור. לאחר מכן הניחו את פתח הצינור ליד הקריש ובחנו בקפידה את הקריש כדי לזהות את הראש (בדרך כלל הקצה העבה מעט יותר של הקריש) ואת הזנב (הקצה מול הראש). ראש הקריש צריך להיות ממוקם לכיוון חיישן לחץ הכניסה והרחק מהשקע. מניחים את הצינור בקצה ה"זנב" של הקריש ושאפו אותו לתוך הצינור עם המזרק.
   הערה: במקרים בהם לא ניתן לקבוע חזותית את כיווניות ראש הקריש/זנב, ניתן להקצות כיווניות בצורה הטובה ביותר על סמך ידיעת כיוון הסיבוב מלולאת צ'נדלר - ראש הקריש פונה לכיוון ההפוך לסיבוב התוף.
6. חבר את הצינור בחזרה למנגנון הראשי כך שהקריש יהיה הקרוב ביותר לחיישן לחץ היציאה (ראש הקריש צריך להיות פונה הרחק מחיישן היציאה). אבטח את הקריש במקומו על ידי ניקוב הצינורית וראש הקריש בשתי מחטים של 30 G בתבנית "X". השאירו את המחטים האלה למשך כל הריצה.
   הערה: בהתאם להגדרות המשככים והמשאבה, ייתכן שיהיה צורך במחטים נוספות כדי להבטיח שהקריש לא יתפרק בטרם עת. במידת הצורך, ניתן להוסיף מסך לצינורות במורד הזרם של הקריש כדי למנוע מרסיסי קריש הדם במערכת. לאחר שנקבע מספר מוגדר של מחטים שיחזיקו את הקריש, שמרו על עקביות בכל התנאים.
7. קח את שארית פתרון הפאזה הנייד והכנס אותו לצינור של 50 מ"ל כמאגר.
8. מניחים את המאגר באמבט המים ומכניסים את צינורות הכניסה והיציאה (המוצא הוא מהפלואורומטר והכניסה נכנסת לראש המשאבה).
9. בדוק שהפלואורומטר שבו נעשה שימוש מחובר ומנוטר. בדוק שהערך ההתחלתי מתאים בהשוואה לבסיס של מערכת פאזה בלבד ניידת בתחילת הניסוי.
   הערה: אם פלואורומטר בתוך השורה אינו זמין, ניתן לבצע דגימה מחזורית סדרתית של המאגר בפרקי זמן מוגדרים לאורך תקופת ניתוח לולאת הזרימה. ניתן לקרוא שברים שנאספו באמצעות צלחת של 96 בארות מיד לאחר השלמת הניסוי בכל ספקטרופוטומטר זמין מסחרית.
10. הוסף 500 μL של 100,000 ng/mL tPA ישירות לנפח המאגר כדי להשיג ריכוז סופי של 1,000 ng/mL tPA ב- 50 מ"ל. הנפח, הריכוז והתרופה הספציפית שתתווסף יהיו תלויים בריכוז היעד הרצוי ובנפח מאגר המערכת.
11. בדוק את הדברים הבאים לפני הפעלת המשאבה:
    1. כל הצמתים מאובטחים.
    2. שני השסתומים מעל חיישני הלחץ נמצאים במצב סגור מתאים.
    3. כל שארית פלזמה (או נוזל) הוחלפה במאגר.
    4. הטרומבוליטי נוסף למאגר ומעורבב כראוי.
    5. צינורות הכניסה נמצאים בסמוך לתחתית המאגר (זה מבטיח בועות מינימליות).
    6. צינורות היציאה מאובטחים ובגובה המתאים ללחץ הרצוי (תלוי באיזה מיקום כלי נבחן).
    7. כיוון סיבוב המשאבה נכון (סדר זרימה: משאבה > דמפנר > קריש > פלואורומטר > מאגר > משאבה).
    8. אם סל"ד המשאבה מוגדר גבוה מאוד (>150 סל"ד), התחל במהירות איטית יותר והגבר כדי להבטיח שהשינוי המהיר בלחץ לא ישבור את הקריש או יגרום לדליפת צינור.
    9. ודא שהמערכת רושמת את הנתונים כראוי מהפלואורומטר ו / או חומרים מתכלים מוכנים לדגימה תקופתית של השלב הנייד לקריאות נקודת זמן לאחר הניסוי.
12. הפעל את המשאבה והגדר אותה להשגת קצב הזרימה הנפחי הרצוי של 160 מ"ל/דקה או הגדל את קצב הזרימה עד להשגת הלחץ הרצוי. המערכת תתמלא בנוזלים ובועות. הבועות יעלו באופן מלאכותי את הקריאות הפלואורומטריות, לכן שימו לב שהבועות יתבהרו. ברגע שהם עושים זאת, כבו את האורות והתחילו באיסוף נתונים.
13. השאירו את המשאבה פועלת עד שהקריש יתפרק משמעותית או עד שחלף זמן הניסוי הרצוי (≥60 דקות). הוספת ריאגנטים, לפי הצורך, למערכת לאורך כל הניסוי דרך המאגר כדי ליצור תנאי ניסוי ייחודיים הבודקים מגוון וריאציות טרומבוליטיות.
    הערה: זמן הניסוי יהיה תלוי בקצב זרימת המשאבה (רמת הגזירה) ובריכוז הטרומבוליטי.
14. לאחר השלמת הבדיקה, הפחיתו את קצב הזרימה הנפחית, והוציאו את צינור הכניסה בזמן שהמשאבה עדיין פועלת כדי לדחוף את רוב הנוזל במערכת לתוך המאגר (שלב נייד כלשהו יישאר בצינורות). נתק את קטע הצינור המכיל קריש בצד חיישן לחץ היציאה של הצינור והורד אותו לסירת שקילה.
15. הסר את המחטים המחזיקות את הקריש במקומו כדי לאסוף את שאריות הנוזל מתוך המערכת ושברי קריש/קריש. השתמש במזרק כדי לסייע בניקוי המערכת לפי הצורך.
16. לשקול ולעבד את הקריש הנותר לניתוח נוסף כגון חישוב אחוז המסה שאבדה או עבור היסטולוגיה.

5. ניקוי המערכת

1. בין הדגימות, שוטפים את כל המערכת במים חמים בסל"ד גבוה (>150 סל"ד). יש להעמיס את המים לתוך המכל ולרוץ דרך המערכת במשך 2 דקות לפחות, ריק, ולרוץ שוב במשך שתי שטיפות מערכת מלאות. לאחר שטיפות אלה, אם קריאת הפלואורומטר אינה חוזרת לקו הבסיס, חזור על תהליך השטיפה למשך מחזור נוסף. אם הוא עדיין לא חזר לקו הבסיס, שנה לחלוטין את הצינורית לפני בדיקת הדגימה הבאה.
   הערה: במהלך הניסויים, ניתן לעשות שימוש חוזר בצינורות בין דגימות; עם זאת, בשל הנקב עם מחטים המשמשות להחזקת הקריש במקומו, יש להחליף את קטע הצינור בין חיישני לחץ הכניסה והמוצא לאחר כל ריצה. בתנאים ניסיוניים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להחליף את כל ערכת הצינוריות לאחר כל ריצה או בדיקות אשכולות כדי למנוע כל זיהום צולב דגימה.
2. לאחר שכל הדגימות הופעלו לניסוי של אותו יום, הסר את כל הצינוריות והשליך. יש לקרצף את צמתי ה-T במים חמים ובמברשת זיפים עד לנקיון ולהשאיר לייבוש ולשטוף את משככי המזרקים במים חמים. השתמש 70% EtOH כדי לעזור עם סטריליות.

תוצאות

היווצרות קריש לולאת צ'נדלר
ביצירת קרישי דם, כיוונו בדרך כלל למרובעים כדי להבטיח שאם קיימים חריגים כלשהם של קריש דם (בהתבסס על מורפולוגיה גסה ומסה), עדיין תהיה לנו היכולת להריץ בדיקות תרומבוליזה משולשות. בהנחה של תנאי העמסה אופטימליים, קרישי הדם צריכים להיות אחידים למדי באורך (~3.3 ...

Discussion

היווצרות קריש דם ותיוג
לולאת צ'נדלר הוכחה כמספקת אמצעי קל ויעיל ליצירת קרישי דם המחקים תרומבי 16 in-vivo. פרמטרים של כוונון עדין כגון גודל צינורות, מהירויות סיבוב, קוטר תוף וזמן קרישה מאפשרים יצירה מהירה של קרישי דם בתנאי גזירה שונים שיכולים ללכוד תכונות אדריכליות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,