Detección de la interacción proteína-umbeliferona CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido

Resumen

Este protocolo describe un método único para detectar la unión entre compuestos y moléculas de proteínas, que ofrece las ventajas de una pérdida mínima de muestras de proteínas y una alta precisión de los datos.

Resumen

La investigación de las interacciones entre diferentes moléculas es un aspecto crucial para comprender la patogénesis de la enfermedad y la detección de dianas farmacológicas. La umbeliferona, un ingrediente activo de la medicina tibetana Vicatia thibetica, exhibe un efecto inmunomodulador con un mecanismo desconocido. La proteína CD40 es un objetivo clave en la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, este estudio emplea el principio de la tecnología de fluorescencia diferencial de barrido para analizar las interacciones entre la proteína CD40 y la umbeliferona utilizando marcadores enzimáticos fluorescentes. Inicialmente, se verificó experimentalmente la estabilidad de la proteína colorante naranja fluorescente y se determinó la relación de dilución óptima de 1:500. Posteriormente, se observó que el valor de fusión a temperatura (Tm) de la proteína CD40 tendía a disminuir con un aumento en la concentración. Curiosamente, se descubrió que la interacción entre la proteína CD40 y la umbeliferona mejora la estabilidad térmica de la proteína CD40. Este estudio representa el primer intento de detectar el potencial de unión de compuestos y proteínas de moléculas pequeñas utilizando microplacas de fluorescencia y colorantes fluorescentes. La técnica se caracteriza por una alta sensibilidad y precisión, lo que promete avances en los campos de la estabilidad de las proteínas, la estructura de las proteínas y las interacciones proteína-ligando, lo que facilita la investigación y la exploración posteriores.

Introducción

Vicatia thibetica H. Boissieu, una planta de la familia de los umbelíferos, se usa comúnmente en la medicina tibetana y representa uno de los componentes esenciales de los cinco ingredientes básicos (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., y Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Distribuida principalmente en el suroeste de China, como el noroeste de Yunnan, el oeste de Sichuan, el Tíbet y otras áreas, su raíz seca sirve como sustituto local de la Angélica¹. La raíz, cono....

Protocolo

La solución compuesta, la solución proteica y el colorante se introdujeron en una solución de PBS. Posteriormente, las muestras se sometieron a un calentamiento gradual utilizando un baño seco de agitación de calentamiento digital, y se evaluó la estabilidad térmica de las proteínas midiendo el cambio en la intensidad de la fluorescencia dentro del complejo sistema. Los pasos detallados se describen a continuación, y la Figura 1 ilustra una descripción general del protocolo.

1. Preparación de la solución

1. Prepare una solución de umbeliferona de 1 mM añadiendo 0,1 mg de umbeliferona a 6....

Resultados

El colorante naranja exhibió consistentemente una excitación de fluorescencia estable a E_x = 470 nm y E_m = 570 nm, tanto a temperatura ambiente como a temperaturas elevadas. Se determinó una relación de dilución óptima de 1:500 (Figura 2A,B). La detección del valor de Tm resultó difícil cuando la concentración de la proteína CD40 estaba por debajo de 15 μg/mL (Figura 3A,B). Sin embargo, a una concentración de 15 μ.......

Discusión

El DSF, también conocido como ensayo de desplazamiento térmico o ensayo de fluorescencia térmica, es una técnica empleada para detectar el proceso de desnaturalización térmica de las proteínas en las muestras mediante el seguimiento de los cambios en la señal de fluorescencia de la muestra de prueba o del colorante durante un aumento de temperatura lento y programado. Establecido inicialmente por Pantoliano¹⁴, DSF sirve como un método de alto rendimiento. El procedimiento principal consis.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854