Detección de la interacción proteína-umbeliferona CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido

Resumen

Este protocolo describe un método único para detectar la unión entre compuestos y moléculas de proteínas, que ofrece las ventajas de una pérdida mínima de muestras de proteínas y una alta precisión de los datos.

Resumen

La investigación de las interacciones entre diferentes moléculas es un aspecto crucial para comprender la patogénesis de la enfermedad y la detección de dianas farmacológicas. La umbeliferona, un ingrediente activo de la medicina tibetana Vicatia thibetica, exhibe un efecto inmunomodulador con un mecanismo desconocido. La proteína CD40 es un objetivo clave en la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, este estudio emplea el principio de la tecnología de fluorescencia diferencial de barrido para analizar las interacciones entre la proteína CD40 y la umbeliferona utilizando marcadores enzimáticos fluorescentes. Inicialmente, se verificó experimentalmente la estabilidad de la proteína colorante naranja fluorescente y se determinó la relación de dilución óptima de 1:500. Posteriormente, se observó que el valor de fusión a temperatura (Tm) de la proteína CD40 tendía a disminuir con un aumento en la concentración. Curiosamente, se descubrió que la interacción entre la proteína CD40 y la umbeliferona mejora la estabilidad térmica de la proteína CD40. Este estudio representa el primer intento de detectar el potencial de unión de compuestos y proteínas de moléculas pequeñas utilizando microplacas de fluorescencia y colorantes fluorescentes. La técnica se caracteriza por una alta sensibilidad y precisión, lo que promete avances en los campos de la estabilidad de las proteínas, la estructura de las proteínas y las interacciones proteína-ligando, lo que facilita la investigación y la exploración posteriores.

Introducción

Vicatia thibetica H. Boissieu, una planta de la familia de los umbelíferos, se usa comúnmente en la medicina tibetana y representa uno de los componentes esenciales de los cinco ingredientes básicos (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., y Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Distribuida principalmente en el suroeste de China, como el noroeste de Yunnan, el oeste de Sichuan, el Tíbet y otras áreas, su raíz seca sirve como sustituto local de la Angélica¹. La raíz, conocida por su fragancia, se utiliza a menudo como condimento para guisos, y las hojas, conocidas como apio tibetano, contribuyen a deliciosos platos. Por lo tanto, Vicatia thibetica tiene importancia no solo como una planta medicinal única, sino también como fuente de alimento en el Tíbet.

Tanto las investigaciones nacionales como las internacionales indican que la Vicatia thibetica posee propiedades regeneradoras de la sangre y vigorizantes del qi (poder o energía), beneficiosas para regular la menstruación. Se emplea para tratar los síntomas de la dismenorrea menstrual irregular causada por palpitaciones y deficiencia de sangre, exhibiendo efectos farmacológicos como la regulación antioxidante de la inmunidad corporal². El extracto alcohólico de Vicatia thibetica ha demostrado la capacidad de restaurar la masa corporal y el índice de órganos en ratones inmunocomprometidos inducidos por ciclofosfamida. Además, aumenta la actividad de la superóxido dismutasa en suero y reduce el contenido de malondialdehído, sugiriendo una mejora en la capacidad antioxidante y un efecto equilibrante sobre la peroxidación lipídica ^2,3. Al mismo tiempo, aumenta el número de células sanguíneas y la hemoglobina, lo que no solo refleja objetivamente la función hematopoyética del cuerpo, sino que también desempeña un papel crucial en el sistema inmunológico ^2,3.

La umbeliferona, caracterizada por cristales aciculares y un sabor amargo, posee un peso molecular pequeño, es volátil y se puede destilar con vapor. Se sublima fácilmente, tiene baja solubilidad en agua y alta solubilidad en materia orgánica. Como uno de los principales componentes químicos de Vicatia thibetica, la umbeliferona exhibe efectos inmunomoduladores sobre la inmunidad celular, la inmunidad humoral y la inmunidad inespecífica en modelos de ratón de inmunosupresión inducida por hidrocortisona ^4,5.

La molécula de superficie celular CD40, miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, se expresa ampliamente en las células inmunitarias⁶. Su ligando homólogo, CD154, también conocido como CD40L, es una proteína transmembrana de tipo II expresada por linfocitos T activados. La activación de CD40 tiene la capacidad de regular al alza la expresión de moléculas coestimuladoras en la superficie de las células dendríticas (CD) y los monocitos. Este proceso promueve la función de presentación de antígenos de las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) y activa aún más las células T CD8+⁷.

Los macrófagos desempeñan un papel crucial en la formación y regulación del microambiente tumoral, y la activación de CD40 puede mejorar la remodelación del microambiente tumoral por parte de los macrófagos⁸. La activación de la señal CD40 influye significativamente en la proliferación y activación de las células B. Las células B, cuando son activadas por CD40, pueden funcionar como células presentadoras de antígenos efectivas. Presentan antígenos, generan actividad de linfocitos T efectores y, por lo tanto, contribuyen a los efectos antitumorales⁹. Además, la activación de CD40 en las células tumorales puede inducir la apoptosis e inhibir el crecimiento^{tumoral 10}. CD40 transduce principalmente señales mediante el control de la actividad de las proteínas quinasas tirosina no receptoras, incluidas Lyn, Fyn, Syk y otras. Además, tiene la capacidad de estimular las proteínas Bcl-xL, Cdk4 y Cdk6, activar los factores de transcripción Rel/NF-kB y fosforilar CG-2 y PI3K¹⁰.

El método de fluorescencia diferencial de barrido (DSF) se emplea ampliamente para evaluar el impacto de diversas condiciones ambientales, como la composición del tampón, la temperatura y los ligandos de moléculas pequeñas, en la estabilidad térmica de las estructuras de las proteínas. El tinte comúnmente utilizado para DSF es un tinte hidrofóbico naranja, sensible al medio ambiente. En condiciones normales, la estructura de la proteína está plegada, ocultando internamente su segmento hidrofóbico. A medida que aumenta la temperatura, la región hidrofóbica de la proteína queda más expuesta, lo que resulta en una descomposición gradual de la estructura natural de la proteína. El colorante se une selectivamente a esta porción de proteína expuesta, amplificando su fluorescencia. A continuación, se calculan los valores de Tm monitorizando los cambios en la detección de la señal de fluorescencia¹¹. Hasta cierto punto, las variaciones en los valores de Tm pueden medir cambios en la estabilidad de las proteínas debidos a mutaciones, cambios en los tampones o unión de ligandos. Además, puede indicar alteraciones estructurales durante el proceso de plegamiento de proteínas¹². Este enfoque ofrece datos precisos, un amplio rango de temperaturas, alta sensibilidad y una pérdida mínima de muestras de proteínas¹³.

En este estudio, la determinación de la fluorescencia se llevó a cabo utilizando un lector de microplacas fluorescentes en lugar de un aparato de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa de fluorescencia. Esta modificación permite la detección de FSD en laboratorios que carecen de un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente, lo que hace que el método sea menos complejo y reduce los pasos necesarios para la configuración del instrumento, simplificando así el proceso experimental. Sin embargo, este enfoque tiene ciertos inconvenientes. Si bien la complejidad se reduce, el procedimiento se vuelve más engorroso. Es necesaria la detección manual de fluorescencia a diferentes temperaturas, y no se puede lograr la recolección automática y continua de fluorescencia del sistema. Por lo tanto, este estudio utilizó la técnica DSF para explorar la interacción entre la proteína CD40 y la umbeliferona, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares de la medicina tibetana.

Protocolo

La solución compuesta, la solución proteica y el colorante se introdujeron en una solución de PBS. Posteriormente, las muestras se sometieron a un calentamiento gradual utilizando un baño seco de agitación de calentamiento digital, y se evaluó la estabilidad térmica de las proteínas midiendo el cambio en la intensidad de la fluorescencia dentro del complejo sistema. Los pasos detallados se describen a continuación, y la Figura 1 ilustra una descripción general del protocolo.

1. Preparación de la solución

1. Prepare una solución de umbeliferona de 1 mM añadiendo 0,1 mg de umbeliferona a 616,75 μL de solución de DMSO (ver Tabla de Materiales).
2. Prepare una solución de proteína CD40 de 200 μg/mL añadiendo 0,1 mg de CD40 a 500 μL de solución ddH₂O (ver Tabla de Materiales).
3. Prepare una solución de colorante naranja 500x agregando 1 μL de colorante naranja 5000x a 9 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Realice las operaciones anteriores con hielo, y dado que la pipeta tiene un rango mínimo de 0,1 μL, diluya inicialmente el colorante proteico de naranja en un factor de 10 para facilitar su uso posterior.

2. Pruebas de rendimiento del tinte

1. Agregue el tinte naranja 500x a una solución de PBS y dilúyalo para obtener proporciones de tinte: PBS de 1:500, 1:1000, 1:2000 y 1:4000.
   NOTA: Asegúrese de que la concentración final de DMSO no exceda el 2% (v/v).
2. Encienda el lector de microplacas fluorescentes y precaliéntelo durante 10 min.
3. Abra el ordenador y el software de adquisición de datos en secuencia (consulte la Tabla de materiales).
4. Haga clic en Instrumento, elija el modelo de microplaca de fluorescencia correspondiente y seleccione OK en el software de adquisición de datos.
   NOTA: Espere a que la microplaca de fluorescencia termine de precalentarse y muestre la temperatura en el panel antes de abrir el software de adquisición de datos para garantizar una conexión exitosa entre el instrumento y el software.
5. Haga clic en Configuración de adquisición y seleccione Fluorescencia en el software de adquisición de datos.
6. Edite el programa en la interfaz Longitudes de onda : Lm1 = 470 nm, 570 nm y, a continuación, seleccione Aceptar.
   NOTA: El tinte naranja se puede excitar con luz ultravioleta a 300 nm o luz visible a 470 nm, y la emisión se puede medir a 570 nm.
7. Agregue diferentes concentraciones de colorante naranja (1:500, 1:1000, 1:2000 y 1:4000) y PBS a placas de 96 pocillos a 100 μL/pocillo.
   NOTA: Disuelva la solución en DMSO antes de agregarla al PBS, y vértice a 2000 x g completamente durante el proceso de preparación para asegurar la disolución completa debido a la tendencia del tinte a precipitar.
8. Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa de detección del instrumento, haga clic en el botón Leer en el software de adquisición de datos y mida la fluorescencia de cada concentración de colorante 13 veces a temperatura ambiente, con un intervalo de 2 minutos cada vez.
9. Haga clic en el botón Exportar después de cada determinación, seleccione Exportar a XML XLS TXT, elija Todas las placas, luego seleccione Placa en formato de salida y, finalmente, haga clic en Aceptar para guardar los datos en una carpeta en formato "XLS" para un análisis más detallado.
   NOTA: Estos pasos ayudan a determinar el impacto de la medición continua en la autofluorescencia del tinte naranja a temperatura ambiente e identificar la concentración óptima de tinción.
10. Encienda el baño seco de agitación de calefacción digital, ajuste la temperatura de calentamiento a 35 °C y el tiempo de calentamiento a 2 min.
11. Prepare la proporción óptima de dilución del colorante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y colóquelo en el baño seco de agitación de calentamiento digital durante 2 minutos.
12. Añada la solución de PBS y la solución de tinción, calentada a 35 °C, a la placa de 96 pocillos a un volumen de 100 μL por pocillo.
13. Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa de detección del instrumento y haga clic en el botón Leer en el software de adquisición de datos.
14. Ajuste la temperatura de calentamiento a 40 °C y el tiempo de calentamiento a 2 min.
15. Pipetee la solución de colorante en la placa de 96 pocillos nuevamente en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y caliéntelo en el instrumento durante 2 minutos.
16. Repita las operaciones de los pasos 2.12-2.15 y 2.9 para probar la absorbancia de la solución de colorante a 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C y 95 °C, respectivamente.
    NOTA: Estos pasos ayudan a determinar la estabilidad de la autofluorescencia del tinte naranja bajo calentamiento continuo en un gradiente de 35 °C a 95 °C. Es crucial trabajar con rapidez para evitar caídas rápidas de temperatura o agregar el líquido incorrecto, lo que podría conducir a errores experimentales.

3. Detección de la temperatura de fusión (Tm) de la proteína

1. Combine la proteína CD40 y el colorante de naranja con la solución de PBS para lograr concentraciones finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL y 1:500, respectivamente.
2. Repita las operaciones descritas en los pasos 2.2-2.6 y 2.10-2.16 para evaluar la absorbancia de la solución de proteína CD40 a temperaturas de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C y 95 °C, respectivamente.
3. Repita el paso 2.9 para guardar y analizar los datos, y posteriormente calcular el valor de Tm utilizando un software de análisis de datos (ver Tabla de Materiales).
4. Agregue proteína CD40, umbeliferona y colorante naranja a la solución de PBS para obtener concentraciones finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM y 1:500, respectivamente.
   NOTA: El vórtice vigoroso durante la preparación de la solución es esencial para asegurar una distribución uniforme del colorante, la proteína CD40 y la umbeliferona en PBS.
5. Repita las operaciones de los pasos 3.2-3.3 para medir la absorbancia de la solución de complejos CD40-umbeliferona a temperaturas de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C y 95 °C, respectivamente.
   NOTA: Estos pasos se llevaron a cabo para determinar los valores de Tm de la proteína CD40 y los complejos CD40-umbeliferona, con el objetivo de identificar la concentración óptima de unión de la proteína CD40 a la umbeliferona.

Resultados

El colorante naranja exhibió consistentemente una excitación de fluorescencia estable a E_x = 470 nm y E_m = 570 nm, tanto a temperatura ambiente como a temperaturas elevadas. Se determinó una relación de dilución óptima de 1:500 (Figura 2A,B). La detección del valor de Tm resultó difícil cuando la concentración de la proteína CD40 estaba por debajo de 15 μg/mL (Figura 3A,B). Sin embargo, a una concentración de 15 μ...

Discusión

El DSF, también conocido como ensayo de desplazamiento térmico o ensayo de fluorescencia térmica, es una técnica empleada para detectar el proceso de desnaturalización térmica de las proteínas en las muestras mediante el seguimiento de los cambios en la señal de fluorescencia de la muestra de prueba o del colorante durante un aumento de temperatura lento y programado. Establecido inicialmente por Pantoliano¹⁴, DSF sirve como un método de alto rendimiento. El procedimiento principal consis...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854