Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

Abstract

Lo studio delle interazioni tra diverse molecole è un aspetto cruciale per comprendere la patogenesi della malattia e lo screening dei bersagli farmacologici. L'umbelliferone, un ingrediente attivo della medicina tibetana Vicatia thibetica, mostra un effetto immunomodulatore con un meccanismo sconosciuto. La proteina CD40 è un bersaglio chiave nella risposta immunitaria. Pertanto, questo studio utilizza il principio della tecnologia di fluorescenza a scansione differenziale per analizzare le interazioni tra la proteina CD40 e l'umbelliferone utilizzando marcatori enzimatici fluorescenti. Inizialmente, la stabilità del colorante fluorescente arancione proteico è stata verificata sperimentalmente ed è stato determinato il rapporto di diluizione ottimale di 1:500. Successivamente, è stato osservato che il valore di fusione della temperatura (Tm) della proteina CD40 tendeva a diminuire con l'aumentare della concentrazione. È interessante notare che l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone migliora la stabilità termica della proteina CD40. Questo studio rappresenta il primo tentativo di rilevare il potenziale di legame di composti e proteine di piccole molecole utilizzando micropiastre a fluorescenza e coloranti fluorescenti. La tecnica è caratterizzata da un'elevata sensibilità e accuratezza, promettenti progressi nei campi della stabilità delle proteine, della struttura delle proteine e delle interazioni proteina-ligando, facilitando così ulteriori ricerche ed esplorazioni.

Introduzione

La Vicatia thibetica H. Boissieu, pianta della famiglia delle ombrellifere, è comunemente usata nella medicina tibetana e rappresenta uno dei componenti essenziali dei cinque ingredienti di base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Distribuita principalmente nel sud-ovest della Cina, come lo Yunnan nord-occidentale, il Sichuan occidentale, il Tibet e altre aree, la sua radice essiccata funge da sostituto locale dell'Angelica¹. La radice, nota per la sua fragranza, è spesso utilizzata come condimento per lo stufato e le foglie, denominate sedano tibetano, contribuiscono a piatti deliziosi. Pertanto, la Vicatia thibetica ha un significato non solo come pianta medicinale unica, ma anche come fonte di cibo in Tibet.

Sia la ricerca nazionale che quella internazionale indicano che la Vicatia thibetica possiede proprietà ricostituenti del sangue e tonificanti del qi (potere o energia), benefiche per regolare le mestruazioni. Viene impiegato per affrontare i sintomi della dismenorrea mestruale irregolare causata da palpitazioni e carenza di sangue, esibendo effetti farmacologici come la regolazione antiossidante dell'immunità corporea². L'estratto alcolico di Vicatia thibetica ha dimostrato la capacità di ripristinare la massa corporea e l'indice degli organi nei topi immunocompromessi indotta dalla ciclofosfamide. Inoltre, aumenta l'attività della superossido dismutasi nel siero e riduce il contenuto di malondialdeide, suggerendo un miglioramento della capacità antiossidante e un effetto equilibrante sulla perossidazione lipidica ^2,3. Allo stesso tempo, aumenta il numero di cellule del sangue e l'emoglobina, che non solo riflette oggettivamente la funzione ematopoietica del corpo, ma svolge anche un ruolo cruciale nel sistema immunitario ^2,3.

L'ombrellifero, caratterizzato da cristalli aciculari e sapore amaro, possiede un piccolo peso molecolare, è volatile e può essere distillato con vapore. Sublima facilmente, ha una bassa solubilità in acqua e un'elevata solubilità in materia organica. Essendo uno dei principali componenti chimici di Vicatia thibetica, umbelliferone mostra effetti immunomodulatori sull'immunità cellulare, sull'immunità umorale e sull'immunità non specifica in modelli murini di immunosoppressione indotta da idrocortisone ^4,5.

La molecola di superficie cellulare CD40, un membro della superfamiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale, è ampiamente espressa nelle cellule immunitarie⁶. Il suo ligando omologo, CD154, noto anche come CD40L, è una proteina transmembrana di tipo II espressa dai linfociti T attivati. L'attivazione del CD40 ha la capacità di sovraregolare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulla superficie delle cellule dendritiche (DC) e dei monociti. Questo processo promuove la funzione di presentazione dell'antigene delle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e attiva ulteriormente le cellule T CD8+⁷.

I macrofagi svolgono un ruolo cruciale nella formazione e nella regolazione del microambiente tumorale e l'attivazione di CD40 può migliorare il rimodellamento del microambiente tumorale da parte dei macrofagi⁸. L'attivazione del segnale CD40 influenza in modo significativo la proliferazione e l'attivazione delle cellule B. Le cellule B, quando attivate dal CD40, possono funzionare come efficaci cellule presentanti l'antigene. Presentano antigeni, generano attività delle cellule T effettrici e quindi contribuiscono agli effetti antitumorali⁹. Inoltre, l'attivazione del CD40 nelle cellule tumorali può indurre l'apoptosi e inibire la crescita tumorale¹⁰. Il CD40 trasduce principalmente i segnali controllando l'attività delle protein chinasi tirosina non recettoriali, tra cui Lyn, Fyn, Syk e altre. Inoltre, ha la capacità di stimolare le proteine Bcl-xL, Cdk4 e Cdk6, attivare i fattori di trascrizione Rel/NF-kB e fosforilare CG-2 e PI3K¹⁰.

Il metodo della fluorescenza a scansione differenziale (DSF) è ampiamente impiegato per valutare l'impatto di varie condizioni ambientali, come la composizione del tampone, la temperatura e i ligandi di piccole molecole, sulla stabilità termica delle strutture proteiche. Il colorante comunemente usato per il DSF è un colorante arancione, sensibile all'ambiente e idrofobo. In condizioni normali, la struttura proteica è ripiegata, nascondendo internamente il suo segmento idrofobico. All'aumentare della temperatura, la regione idrofobica della proteina diventa più esposta, provocando una graduale rottura della struttura proteica naturale. Il colorante si lega selettivamente a questa porzione proteica esposta, amplificandone la fluorescenza. I valori di Tm vengono quindi calcolati monitorando le variazioni nel rilevamento del segnale di fluorescenza¹¹. In una certa misura, le variazioni dei valori di Tm possono misurare i cambiamenti nella stabilità delle proteine dovuti a mutazioni, cambiamenti nei tamponi o legame con i ligandi. Inoltre, può indicare alterazioni strutturali durante il processo di ripiegamento delle proteine¹². Questo approccio offre dati precisi, un ampio intervallo di temperatura, un'elevata sensibilità e una perdita minima di campioni proteici¹³.

In questo studio, la determinazione della fluorescenza è stata condotta utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenti invece di un apparecchio di reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR) a fluorescenza. Questa modifica consente la rilevazione del DSF nei laboratori privi di uno strumento di PCR quantitativa fluorescente, rendendo il metodo meno complesso e riducendo i passaggi necessari per la configurazione dello strumento, semplificando così il processo sperimentale. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi in questo approccio. Mentre la complessità è ridotta, la procedura diventa più macchinosa. È necessario il rilevamento manuale della fluorescenza a diverse temperature e non è possibile ottenere una raccolta automatica e continua della fluorescenza dal sistema. Pertanto, questo studio ha utilizzato la tecnica DSF per esplorare l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone, fornendo nuove intuizioni sui meccanismi molecolari della medicina tibetana.

Protocollo

La soluzione composta, la soluzione proteica e il colorante sono stati introdotti in una soluzione PBS. Successivamente, i campioni sono stati sottoposti a riscaldamento graduale utilizzando un bagno secco di riscaldamento digitale e la stabilità termica delle proteine è stata valutata misurando la variazione dell'intensità della fluorescenza all'interno del sistema complesso. I passaggi dettagliati sono descritti di seguito e la Figura 1 illustra una panoramica del protocollo.

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare una soluzione di umbelliferone da 1 mM aggiungendo 0,1 mg di umbelliferone a 616,75 μL di soluzione di DMSO (vedere la Tabella dei materiali).
2. Preparare una soluzione proteica CD40 da 200 μg/mL aggiungendo 0,1 mg di CD40 a 500 μL di soluzione di ddH₂O (vedere la Tabella dei materiali).
3. Preparare una soluzione di colorante arancione 500x aggiungendo 1 μl di colorante arancione 5000x a 9 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Eseguire le operazioni di cui sopra sul ghiaccio e, poiché la pipetta ha un intervallo minimo di 0,1 μl, diluire inizialmente il colorante proteico arancione di un fattore 10 per facilitare l'uso successivo.

2. Test delle prestazioni del colorante

1. Aggiungere il colorante arancione 500x a una soluzione PBS e diluirlo per ottenere il colorante: rapporti PBS di 1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000.
   NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO non superi il 2% (v/v).
2. Accendere il lettore di micropiastre fluorescenti e preriscaldarlo per 10 minuti.
3. Aprire il computer e il software di acquisizione dati in sequenza (vedi Tabella dei materiali).
4. Fare clic su Strumento, scegliere il modello di micropiastra a fluorescenza corrispondente e selezionare OK nel software di acquisizione dati.
   NOTA: Attendere che la micropiastra a fluorescenza finisca di preriscaldarsi e visualizzare la temperatura sul pannello prima di aprire il software di acquisizione dati per garantire una corretta connessione tra lo strumento e il software.
5. Fare clic su Impostazioni di acquisizione e selezionare Fluorescenza nel software di acquisizione dati.
6. Modificare il programma nell'interfaccia Lunghezze d'onda: Lm1 = 470 nm, 570 nm, quindi selezionare OK.
   NOTA: Il colorante arancione può essere eccitato con luce UV a 300 nm o luce visibile a 470 nm e l'emissione può essere misurata a 570 nm.
7. Aggiungere diverse concentrazioni di colorante arancione (1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000) e PBS a piastre a 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto.
   NOTA: Sciogliere la soluzione in DMSO prima di aggiungerla al PBS e agitarla a 2000 x g accuratamente durante il processo di preparazione per garantire la completa dissoluzione a causa della tendenza del colorante a precipitare.
8. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella fase di rilevamento dello strumento, fare clic sul pulsante Leggi nel software di acquisizione dati e misurare la fluorescenza di ciascuna concentrazione di colorante 13 volte a temperatura ambiente, con un intervallo di 2 minuti ogni volta.
9. Fare clic sul pulsante Esporta dopo ogni determinazione, selezionare Esporta in XML XLS TXT, scegliere Tutte le lastre, quindi selezionare Piastra in formato di output e infine fare clic su OK per salvare i dati in una cartella in formato "XLS" per ulteriori analisi.
   NOTA: Questi passaggi aiutano a determinare l'impatto della misurazione continua sull'autofluorescenza del colorante arancione a temperatura ambiente e a identificare la concentrazione di colorazione ottimale.
10. Accendere il bagno a secco con agitazione digitale, impostare la temperatura di riscaldamento a 35 °C e il tempo di riscaldamento a 2 min.
11. Preparare il rapporto di diluizione ottimale del colorante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e immergerlo nel bagno secco di agitazione riscaldante digitale per 2 minuti.
12. Aggiungere la soluzione di PBS e la soluzione colorante, riscaldata a 35 °C, alla piastra a 96 pozzetti a un volume di 100 μl per pozzetto.
13. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella fase di rilevamento dello strumento e fare clic sul pulsante Leggi nel software di acquisizione dati.
14. Impostare la temperatura di riscaldamento a 40 °C e il tempo di riscaldamento a 2 min.
15. Pipettare nuovamente la soluzione colorante nella piastra a 96 pozzetti nella provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e riscaldarla nello strumento per 2 minuti.
16. Ripetere le operazioni dei passaggi 2.12-2.15 e 2.9 per testare l'assorbanza della soluzione colorante rispettivamente a 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C.
    NOTA: Questi passaggi aiutano a determinare la stabilità dell'autofluorescenza del colorante arancione in riscaldamento continuo in un gradiente da 35 °C a 95 °C. È fondamentale lavorare rapidamente per evitare rapidi cali di temperatura o l'aggiunta di un liquido sbagliato, che potrebbe portare a errori sperimentali.

3. Rilevamento della temperatura di fusione (Tm) della proteina

1. Combinare la proteina CD40 e il colorante arancione con la soluzione PBS per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL e 1:500.
2. Ripetere le operazioni descritte nei passaggi 2.2-2.6 e 2.10-2.16 per valutare l'assorbanza della soluzione proteica CD40 a temperature rispettivamente di 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C.
3. Ripetere il passaggio 2.9 per salvare e analizzare i dati e successivamente calcolare il valore Tm utilizzando il software di analisi dei dati (vedere la tabella dei materiali).
4. Aggiungere la proteina CD40, l'umbelliferone e il colorante arancione alla soluzione PBS per ottenere concentrazioni finali di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM e 1:500, rispettivamente.
   NOTA: Un vortice vigoroso durante la preparazione della soluzione è essenziale per garantire una distribuzione uniforme del colorante, della proteina CD40 e dell'umbelliferone nel PBS.
5. Ripetere le operazioni dei passaggi 3.2-3.3 per misurare l'assorbanza della soluzione dei complessi CD40-umbelliferone a temperature di 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C, rispettivamente.
   NOTA: Questi passaggi sono stati condotti per determinare i valori di Tm della proteina CD40 e dei complessi CD40-umbelliferone, con l'obiettivo di identificare la concentrazione ottimale di legame della proteina CD40 con umbelliferone.

Risultati

Il colorante arancione ha costantemente mostrato un'eccitazione stabile della fluorescenza a E_x = 470 nm e E_m = 570 nm, sia a temperatura ambiente che a temperature elevate. È stato determinato un rapporto di diluizione ottimale di 1:500 (Figura 2A, B). Il rilevamento del valore di Tm si è rivelato difficile quando la concentrazione della proteina CD40 era inferiore a 15 μg/mL (Figura 3A, B). Tuttavia, a una concentrazione d...

Discussione

Il DSF, noto anche come saggio di spostamento termico o saggio di fluorescenza termica, è una tecnica impiegata per rilevare il processo di denaturazione termica delle proteine nei campioni monitorando le variazioni del segnale di fluorescenza del campione di prova o del colorante durante un lento aumento programmato della temperatura. Inizialmente istituito da Pantoliano¹⁴, il DSF funge da metodo ad alto rendimento. La procedura principale prevede l'aumento della temperatura su una piastra risca...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854