Nachweis der CD40-Protein-Umbelliferon-Wechselwirkung mittels dynamischer Differenzialfluoreszenz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zum Nachweis der Bindung zwischen Verbindungen und Proteinmolekülen, die die Vorteile eines minimalen Proteinprobenverlusts und einer hohen Datengenauigkeit bietet.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Molekülen ist ein entscheidender Aspekt für das Verständnis der Krankheitspathogenese und das Screening auf Wirkstoffziele. Umbelliferon, ein Wirkstoff der tibetischen Medizin Vicatia thibetica, zeigt eine immunmodulatorische Wirkung mit einem unbekannten Mechanismus. Das CD40-Protein ist ein wichtiges Ziel bei der Immunantwort. Daher wird in dieser Studie das Prinzip der dynamischen Differenzialfluoreszenztechnologie verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen dem CD40-Protein und Umbelliferon unter Verwendung von fluoreszierenden Enzymmarkern zu analysieren. Zunächst wurde die Stabilität des Proteins fluoreszierender orangefarbener Farbstoff experimentell verifiziert und das optimale Verdünnungsverhältnis von 1:500 bestimmt. In der Folge wurde beobachtet, dass der Temperaturschmelzwert (Tm) des CD40-Proteins mit zunehmender Konzentration tendenziell abnahm. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung zwischen CD40-Protein und Umbelliferon die thermische Stabilität des CD40-Proteins verbessert. Diese Studie stellt den ersten Versuch dar, das Bindungspotenzial von niedermolekularen Verbindungen und Proteinen mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikrotiterplatten und Fluoreszenzfarbstoffen nachzuweisen. Die Technik zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität und Genauigkeit aus und verspricht Fortschritte in den Bereichen Proteinstabilität, Proteinstruktur und Protein-Liganden-Wechselwirkungen, wodurch weitere Forschungen und Explorationen erleichtert werden.

Einleitung

Vicatia thibetica H. Boissieu, eine Pflanze aus der Familie der Doldenblütler, wird häufig in der tibetischen Medizin verwendet und stellt einen der wesentlichen Bestandteile der fünf Grundbestandteile dar (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., und Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Hauptsächlich im Südwesten Chinas, wie im Nordwesten von Yunnan, im Westen von Sichuan, in Tibet und anderen Gebieten verbreitet, dient seine getrocknete Wurzel als lokaler Ersatz für Angelica^....

Protokoll

Die Verbindungslösung, die Proteinlösung und der Farbstoff wurden in eine PBS-Lösung eingeführt. Anschließend wurden die Proben mit einem digitalen Heiz-Schüttel-Trockenbad allmählich erhitzt, und die thermische Stabilität der Proteine wurde durch Messung der Änderung der Fluoreszenzintensität innerhalb des komplexen Systems bewertet. Die detaillierten Schritte sind im Folgenden beschrieben, und Abbildung 1 veranschaulicht einen Überblick über das Protokoll.

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie eine 1 mM Umbelliferon-Lösung vor, indem Sie 0,1 mg Umbelliferon zu 616,75 μl DMSO-Lösun....

Diskussion

DSF, auch bekannt als thermischer Shift-Assay oder thermischer Fluoreszenz-Assay, ist eine Technik, die eingesetzt wird, um den Prozess der thermischen Denaturierung von Proteinen in Proben nachzuweisen, indem Änderungen des Fluoreszenzsignals der Testprobe oder des Farbstoffs während eines langsamen, programmierten Temperaturanstiegs überwacht werden. Ursprünglich von Pantoliano¹⁴ etabliert, dient DSF als Hochdurchsatzmethode. Das Hauptverfahren besteht darin, die Temperatur auf einer compute.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854