Nachweis der CD40-Protein-Umbelliferon-Wechselwirkung mittels dynamischer Differenzialfluoreszenz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zum Nachweis der Bindung zwischen Verbindungen und Proteinmolekülen, die die Vorteile eines minimalen Proteinprobenverlusts und einer hohen Datengenauigkeit bietet.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Molekülen ist ein entscheidender Aspekt für das Verständnis der Krankheitspathogenese und das Screening auf Wirkstoffziele. Umbelliferon, ein Wirkstoff der tibetischen Medizin Vicatia thibetica, zeigt eine immunmodulatorische Wirkung mit einem unbekannten Mechanismus. Das CD40-Protein ist ein wichtiges Ziel bei der Immunantwort. Daher wird in dieser Studie das Prinzip der dynamischen Differenzialfluoreszenztechnologie verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen dem CD40-Protein und Umbelliferon unter Verwendung von fluoreszierenden Enzymmarkern zu analysieren. Zunächst wurde die Stabilität des Proteins fluoreszierender orangefarbener Farbstoff experimentell verifiziert und das optimale Verdünnungsverhältnis von 1:500 bestimmt. In der Folge wurde beobachtet, dass der Temperaturschmelzwert (Tm) des CD40-Proteins mit zunehmender Konzentration tendenziell abnahm. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung zwischen CD40-Protein und Umbelliferon die thermische Stabilität des CD40-Proteins verbessert. Diese Studie stellt den ersten Versuch dar, das Bindungspotenzial von niedermolekularen Verbindungen und Proteinen mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikrotiterplatten und Fluoreszenzfarbstoffen nachzuweisen. Die Technik zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität und Genauigkeit aus und verspricht Fortschritte in den Bereichen Proteinstabilität, Proteinstruktur und Protein-Liganden-Wechselwirkungen, wodurch weitere Forschungen und Explorationen erleichtert werden.

Einleitung

Vicatia thibetica H. Boissieu, eine Pflanze aus der Familie der Doldenblütler, wird häufig in der tibetischen Medizin verwendet und stellt einen der wesentlichen Bestandteile der fünf Grundbestandteile dar (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., und Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Hauptsächlich im Südwesten Chinas, wie im Nordwesten von Yunnan, im Westen von Sichuan, in Tibet und anderen Gebieten verbreitet, dient seine getrocknete Wurzel als lokaler Ersatz für Angelica¹. Die Wurzel, die für ihren Duft bekannt ist, wird oft als Eintopfgewürz verwendet, und die Blätter, die als tibetischer Sellerie bezeichnet werden, tragen zu köstlichen Gerichten bei. So hat Vicatia thibetica nicht nur als einzigartige Heilpflanze, sondern auch als Nahrungsquelle in Tibet eine Bedeutung.

Sowohl nationale als auch internationale Forschungen zeigen, dass Vicatia thibetica blutauffüllende und qi (Kraft oder Energie)-belebende Eigenschaften besitzt, die für die Regulierung der Menstruation von Vorteil sind. Es wird eingesetzt, um Symptome von unregelmäßiger menstrueller Dysmenorrhoe zu behandeln, die durch Herzklopfen und Blutmangel verursacht werden, und zeigt pharmakologische Wirkungen wie die antioxidative Regulierung der Immunität des Körpers². Der Alkoholextrakt von Vicatia thibetica hat die Fähigkeit gezeigt, die Körpermasse und den Organindex bei immungeschwächten Mäusen, die durch Cyclophosphamid induziert wurden, wiederherzustellen. Darüber hinaus erhöht es die Aktivität der Superoxiddismutase im Serum und reduziert den Gehalt an Malondialdehyd, was auf eine Verbesserung der antioxidativen Kapazität und eine ausgleichende Wirkung auf die Lipidperoxidation hindeutet ^2,3. Gleichzeitig erhöht es die Anzahl der Blutzellen und des Hämoglobins, was nicht nur objektiv die blutbildende Funktion des Körpers widerspiegelt, sondern auch eine entscheidende Rolle für das Immunsystem spielt ^2,3.

Doldenblütleron, das sich durch nadelförmige Kristalle und einen bitteren Geschmack auszeichnet, besitzt ein geringes Molekulargewicht, ist flüchtig und kann mit Wasserdampf destilliert werden. Es sublimiert leicht, hat eine geringe Löslichkeit in Wasser und eine hohe Löslichkeit in organischem Material. Als einer der Hauptbestandteile von Vicatia thibetica zeigt Umbelliferon immunmodulatorische Wirkungen auf die zelluläre Immunität, die humorale Immunität und die unspezifische Immunität in Hydrocortison-induzierten Immunsuppressions-Mausmodellen ^4,5.

Das Zelloberflächenmolekül CD40, ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie, wird in Immunzellen weit verbreitet^{exprimiert 6}. Sein homologer Ligand CD154, auch bekannt als CD40L, ist ein Typ-II-Transmembranprotein, das von aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird. Die CD40-Aktivierung hat die Fähigkeit, die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche von dendritischen Zellen (DC) und Monozyten hochzuregulieren. Dieser Prozess fördert die Antigenpräsentationsfunktion von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und aktiviert CD8+ T-Zellen weiter⁷.

Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung und Regulation der Tumormikroumgebung, und die CD40-Aktivierung kann den Umbau der Tumormikroumgebung durch Makrophagen fördern⁸. Die Aktivierung des CD40-Signals beeinflusst maßgeblich die Proliferation und Aktivierung von B-Zellen. B-Zellen können, wenn sie durch CD40 aktiviert werden, als wirksame Antigen-präsentierende Zellen fungieren. Sie präsentieren Antigene, erzeugen die Aktivität von Effektor-T-Zellen und tragen dadurch zur Anti-Tumor-Wirkung bei⁹. Darüber hinaus kann die CD40-Aktivierung in Tumorzellen die Apoptose induzieren und das Tumorwachstum hemmen¹⁰. CD40 transduziert in erster Linie Signale, indem es die Aktivität von Nicht-Rezeptor-Tyrosinproteinkinasen kontrolliert, darunter Lyn, Fyn, Syk und andere. Darüber hinaus hat es die Fähigkeit, die Proteine Bcl-xL, Cdk4 und Cdk6 zu stimulieren, Rel/NF-kB-Transkriptionsfaktoren zu aktivieren und CG-2 und PI3K¹⁰ zu phosphorylieren.

Die Methode der dynamischen Differenzialfluoreszenz (DSF) wird häufig eingesetzt, um den Einfluss verschiedener Umgebungsbedingungen, wie z. B. Pufferzusammensetzung, Temperatur und niedermolekulare Liganden, auf die thermische Stabilität von Proteinstrukturen zu bewerten. Der häufig verwendete Farbstoff für DSF ist ein orangefarbener, umweltsensibler, hydrophober Farbstoff. Unter normalen Bedingungen ist die Proteinstruktur gefaltet und verbirgt ihr hydrophobes Segment im Inneren. Mit steigender Temperatur wird der hydrophobe Bereich des Proteins stärker exponiert, was zu einem allmählichen Abbau der natürlichen Proteinstruktur führt. Der Farbstoff bindet selektiv an diesen exponierten Proteinteil und verstärkt dessen Fluoreszenz. Tm-Werte werden dann berechnet, indem Änderungen in der Fluoreszenzsignaldetektion¹¹ überwacht werden. Bis zu einem gewissen Grad können Schwankungen der Tm-Werte Verschiebungen in der Proteinstabilität aufgrund von Mutationen, Änderungen der Puffer oder der Ligandenbindung messen. Darüber hinaus kann es auf strukturelle Veränderungen während des Proteinfaltungsprozesses hinweisen¹². Dieser Ansatz bietet präzise Daten, einen breiten Temperaturbereich, eine hohe Sensitivität und minimalen Proteinverlust¹³.

In dieser Studie wurde die Fluoreszenzbestimmung mit einem fluoreszierenden Mikroplatten-Reader anstelle eines Fluoreszenz-PCR-Geräts (Quantitative Polymerase-Kettenreaktion) durchgeführt. Diese Modifikation ermöglicht den DSF-Nachweis in Laboren, in denen kein fluoreszierendes quantitatives PCR-Instrument vorhanden ist, wodurch die Methode weniger komplex wird und die erforderlichen Schritte für die Einrichtung des Instruments reduziert werden, wodurch der experimentelle Prozess vereinfacht wird. Dieser Ansatz hat jedoch gewisse Nachteile. Während die Komplexität reduziert wird, wird das Verfahren umständlicher. Eine manuelle Fluoreszenzdetektion bei unterschiedlichen Temperaturen ist erforderlich, und eine automatische und kontinuierliche Erfassung der Fluoreszenz aus dem System kann nicht erreicht werden. Daher wurde in dieser Studie die DSF-Technik verwendet, um die Interaktion zwischen CD40-Protein und Umbelliferon zu untersuchen und neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der tibetischen Medizin zu liefern.

Protokoll

Die Verbindungslösung, die Proteinlösung und der Farbstoff wurden in eine PBS-Lösung eingeführt. Anschließend wurden die Proben mit einem digitalen Heiz-Schüttel-Trockenbad allmählich erhitzt, und die thermische Stabilität der Proteine wurde durch Messung der Änderung der Fluoreszenzintensität innerhalb des komplexen Systems bewertet. Die detaillierten Schritte sind im Folgenden beschrieben, und Abbildung 1 veranschaulicht einen Überblick über das Protokoll.

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie eine 1 mM Umbelliferon-Lösung vor, indem Sie 0,1 mg Umbelliferon zu 616,75 μl DMSO-Lösung hinzufügen (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie eine CD40-Proteinlösung mit 200 μg/ml vor, indem Sie 0,1 mg CD40 bis 500 μl ddH₂O-Lösung hinzufügen (siehe Materialtabelle).
3. Bereiten Sie eine 500x orangefarbene Farbstofflösung vor, indem Sie 1 μl 5000x orangefarbenen Farbstoff zu 9 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Führen Sie die oben genannten Vorgänge auf Eis durch, und da die Pipette einen Mindestbereich von 0,1 μl hat, verdünnen Sie den orangefarbenen Proteinfarbstoff zunächst um den Faktor 10, um die spätere Verwendung zu erleichtern.

2. Prüfung der Farbstoffleistung

1. Geben Sie den 500x orangefarbenen Farbstoff in eine PBS-Lösung und verdünnen Sie ihn, um ein PBS-Verhältnis von 1:500, 1:1000, 1:2000 und 1:4000 zu erhalten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von DMSO 2 % (v/v) nicht überschreitet.
2. Schalten Sie den fluoreszierenden Mikroplatten-Reader ein und heizen Sie ihn 10 Minuten lang vor.
3. Öffnen Sie den Computer und die Datenerfassungssoftware nacheinander (siehe Materialtabelle).
4. Klicken Sie auf Instrument, wählen Sie das entsprechende Fluoreszenz-Mikroplattenmodell aus und wählen Sie OK in der Datenerfassungssoftware.
   HINWEIS: Warten Sie, bis die Fluoreszenz-Mikroplatte das Vorheizen abgeschlossen hat und die Temperatur auf dem Bedienfeld angezeigt wird, bevor Sie die Datenerfassungssoftware öffnen, um eine erfolgreiche Verbindung zwischen dem Gerät und der Software sicherzustellen.
5. Klicken Sie auf Erfassungseinstellungen und wählen Sie Fluoreszenz in der Datenerfassungssoftware.
6. Bearbeiten Sie das Programm in der Wellenlängen-Benutzeroberfläche: Lm1 = 470 nm, 570 nm, und wählen Sie dann OK aus.
   HINWEIS: Der orangefarbene Farbstoff kann mit UV-Licht bei 300 nm oder sichtbarem Licht bei 470 nm angeregt werden, und die Emission kann bei 570 nm gemessen werden.
7. Geben Sie verschiedene Konzentrationen von orangefarbenem Farbstoff (1:500, 1:1000, 1:2000 und 1:4000) und PBS auf 96-Well-Platten mit 100 μl/Well.
   HINWEIS: Lösen Sie die Lösung in DMSO auf, bevor Sie sie zu PBS hinzufügen, und wirbeln Sie sie während des Vorbereitungsprozesses gründlich bei 2000 x g ein, um eine vollständige Auflösung aufgrund der Ausfällungsneigung des Farbstoffs zu gewährleisten.
8. Setzen Sie die 96-Well-Platte in die Detektionsstufe des Geräts ein, klicken Sie in der Datenerfassungssoftware auf die Schaltfläche Lesen und messen Sie die Fluoreszenz jeder Farbstoffkonzentration 13 Mal bei Raumtemperatur mit einem Intervall von jeweils 2 Minuten.
9. Klicken Sie nach jeder Bestimmung auf die Schaltfläche Exportieren , wählen Sie Export to XML XLS TXT, wählen Sie All Plates, wählen Sie dann Plate in Output Format und klicken Sie schließlich auf OK , um die Daten in einem Ordner im "XLS"-Format für die weitere Analyse zu speichern.
   HINWEIS: Diese Schritte helfen dabei, den Einfluss einer kontinuierlichen Messung auf die Autofluoreszenz des orangefarbenen Farbstoffs bei Raumtemperatur zu bestimmen und die optimale Färbekonzentration zu ermitteln.
10. Schalten Sie das digitale Heiz-Schüttel-Trockenbad ein, stellen Sie die Heiztemperatur auf 35 °C und die Heizzeit auf 2 Minuten ein.
11. Bereiten Sie das optimale Verdünnungsverhältnis des Farbstoffs in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor und legen Sie es für 2 Minuten in das digitale Heiz- und Schüttelbad.
12. Geben Sie die PBS-Lösung und die auf 35 °C erhitzte Färbelösung mit einem Volumen von 100 μl pro Vertiefung in die 96-Well-Platte.
13. Setzen Sie die 96-Well-Platte in die Detektionsstufe des Geräts ein und klicken Sie in der Datenerfassungssoftware auf die Schaltfläche Lesen .
14. Stellen Sie die Heiztemperatur auf 40 °C und die Aufheizzeit auf 2 min ein.
15. Pipettieren Sie die Farbstofflösung in der 96-Well-Platte zurück in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und erhitzen Sie sie 2 Minuten lang im Gerät.
16. Wiederholen Sie die Schritte 2.12-2.15 und Schritt 2.9, um die Absorption der Farbstofflösung bei 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C bzw. 95 °C zu testen.
    HINWEIS: Mit diesen Schritten kann die Stabilität der Autofluoreszenz des orangefarbenen Farbstoffs bei kontinuierlicher Erhitzung in einem Gradienten von 35 °C bis 95 °C bestimmt werden. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um schnelle Temperaturabfälle oder die Zugabe der falschen Flüssigkeit zu vermeiden, die zu experimentellen Fehlern führen könnten.

3. Nachweis der Temperatur des Schmelzens (Tm) des Proteins

1. Kombinieren Sie CD40-Protein und Orangenfarbstoff mit PBS-Lösung, um Endkonzentrationen von 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml bzw. 1:500 zu erreichen.
2. Wiederholen Sie die in den Schritten 2.2 bis 2.6 und 2.10 bis 2.16 beschriebenen Vorgänge, um die Absorption der CD40-Proteinlösung bei Temperaturen von 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C bzw. 95 °C zu beurteilen.
3. Wiederholen Sie Schritt 2.9, um die Daten zu speichern und zu analysieren, und berechnen Sie anschließend den Tm-Wert mit einer Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle).
4. Fügen Sie der PBS-Lösung CD40-Protein, Umbelliferon und Orangenfarbstoff hinzu, um Endkonzentrationen von 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μM bzw. 1:500 zu erhalten.
   HINWEIS: Kräftiges Vortexen während der Lösungsvorbereitung ist unerlässlich, um eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffs, des CD40-Proteins und des Umbelliferons in PBS zu gewährleisten.
5. Wiederholen Sie die Vorgänge der Schritte 3.2 bis 3.3, um die Absorption der CD40-Umbelliferon-Komplexlösung bei Temperaturen von 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C bzw. 95 °C zu messen.
   HINWEIS: Diese Schritte wurden durchgeführt, um die Tm-Werte von CD40-Protein- und CD40-Umbelliferon-Komplexen zu bestimmen, mit dem Ziel, die optimale CD40-Proteinbindungskonzentration an Umbelliferon zu ermitteln.

Ergebnisse

Der orangefarbene Farbstoff zeigte sowohl bei Raumtemperatur als auch bei erhöhten Temperaturen eine stabile Fluoreszenzanregung bei E_x = 470 nm und E_m = 570 nm. Es wurde ein optimales Verdünnungsverhältnis von 1:500 ermittelt (Abbildung 2A,B). Die Detektion des Tm-Wertes erwies sich als schwierig, wenn die Konzentration des CD40-Proteins unter 15 μg/ml lag (Abbildung 3A,B). Bei einer Konzentration von 15 μg/ml war jedoch ...

Diskussion

DSF, auch bekannt als thermischer Shift-Assay oder thermischer Fluoreszenz-Assay, ist eine Technik, die eingesetzt wird, um den Prozess der thermischen Denaturierung von Proteinen in Proben nachzuweisen, indem Änderungen des Fluoreszenzsignals der Testprobe oder des Farbstoffs während eines langsamen, programmierten Temperaturanstiegs überwacht werden. Ursprünglich von Pantoliano¹⁴ etabliert, dient DSF als Hochdurchsatzmethode. Das Hauptverfahren besteht darin, die Temperatur auf einer compute...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854