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Detecção da interação proteína-umbeliferona CD40 por fluorescência de varredura diferencial
Neste Artigo
Resumo
Este protocolo descreve um método exclusivo para detectar a ligação entre compostos e moléculas de proteína, oferecendo as vantagens de perda mínima de amostra de proteína e alta precisão de dados.
Resumo
A investigação das interações entre diferentes moléculas é um aspecto crucial para a compreensão da patogênese da doença e a triagem de alvos de drogas. A umbeliferona, um ingrediente ativo da medicina tibetana Vicatia thibetica, exibe um efeito imunomodulador com um mecanismo desconhecido. A proteína CD40 é um alvo chave na resposta imune. Portanto, este estudo emprega o princípio da tecnologia de fluorescência de varredura diferencial para analisar as interações entre a proteína CD40 e a umbeliferona usando marcadores enzimáticos fluorescentes. Inicialmente, a estabilidade do corante laranja fluorescente proteico foi verificada experimentalmente e a razão de diluição ótima de 1:500 foi determinada. Posteriormente, observou-se que o valor de fusão da temperatura (Tm) da proteína CD40 tendeu a diminuir com o aumento da concentração. Curiosamente, descobriu-se que a interação entre a proteína CD40 e a umbeliferona aumenta a estabilidade térmica da proteína CD40. Este estudo representa a primeira tentativa de detectar o potencial de ligação de compostos e proteínas de moléculas pequenas usando microplacas de fluorescência e corantes fluorescentes. A técnica é caracterizada por alta sensibilidade e precisão, prometendo avanços nos campos de estabilidade de proteínas, estrutura de proteínas e interações proteína-ligante, facilitando assim pesquisas e explorações futuras.
Introdução
Vicatia thibetica H. Boissieu, uma planta da família das umbelíferas, é comumente usada na medicina tibetana e representa um dos componentes essenciais dos cinco ingredientes básicos (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Distribuído principalmente no sudoeste da China, como noroeste de Yunnan, oeste de Sichuan, Tibete e outras áreas, sua raiz seca serve como um substituto local para Angelica1. A raiz, conhecida por sua fragrância....
Protocolo
A solução composta, a solução proteica e o corante foram introduzidos em uma solução de PBS. Posteriormente, as amostras foram submetidas a aquecimento gradual usando um banho seco de aquecimento digital, e a estabilidade térmica das proteínas foi avaliada medindo a mudança na intensidade de fluorescência dentro do sistema complexo. As etapas detalhadas são descritas abaixo e a Figura 1 ilustra uma visão geral do protocolo.
1. Preparação da solução
- Prepare uma solução de umbeliferona 1 mM adicionando 0,1 mg de umbeliferona a 616,75 μL de solução de DMSO (ver Tabela de Materiai....
Resultados Representativos
O corante laranja exibiu consistentemente excitação de fluorescência estável em Ex = 470 nm e Em = 570 nm, tanto à temperatura ambiente quanto a temperaturas elevadas. Determinou-se uma razão de diluição ótima de 1:500 (Figura 2A,B). A detecção do valor de Tm mostrou-se desafiadora quando a concentração da proteína CD40 estava abaixo de 15 μg/mL (Figura 3A,B). No entanto, na concentração de 15 μg/mL, foi detec.......
Discussão
DSF, também conhecido como ensaio de deslocamento térmico ou ensaio de fluorescência térmica, é uma técnica empregada para detectar o processo de desnaturação térmica de proteínas em amostras, monitorando mudanças no sinal de fluorescência da amostra de teste ou corante durante um aumento lento e programado de temperatura. Inicialmente estabelecido por Pantoliano14, o DSF serve como um método de alto rendimento. O procedimento principal envolve elevar a temperatura em uma placa aqueci.......
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Expressamos nosso sincero agradecimento pelo apoio financeiro recebido do Projeto de Construção de Conotação do 14º Plano Quinquenal da Universidade de Medicina Tibetana (2022ZYYGH12), as Disciplinas Abertas de 2022 do Laboratório Chave de Medicina Tibetana e Educação Básica do Ministério da Educação da Universidade de Medicina Tibetana (ZYYJC-22-04), o Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012), e o Projeto de Promoção de Pesquisa Acadêmica Xinglin da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (XKTD2022013).
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD40 protein | MedChemExpress | HY-P75408 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| FlexStation 3 multifunctional microplate reader | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | FlexStation 3 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
| SoftMax Pro 7.1 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | SoftMax Pro 7.1 | |
| SSYPRO orange dye | Sigma | S5942 | |
| Umbelliferone | Shanghai Yuanye Biotechnology Co. | B21854 |
Referências
- Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).
- Li, L., et al. Effects ....
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