示差走査蛍光法によるCD40タンパク質-ウンベリフェロン相互作用の検出

要約

このプロトコールは、化合物とタンパク質分子との間の結合を検出するための独自の方法を説明しており、タンパク質サンプルの損失を最小限に抑え、高いデータ精度という利点を提供します。

要約

異なる分子間の相互作用の調査は、疾患の病因を理解し、創薬標的をスクリーニングする上で重要な側面です。チベットの薬 Vicatia thibeticaの有効成分であるUmbelliferoneは、未知のメカニズムで免疫調節効果を示します。CD40タンパク質は、免疫応答の重要な標的です。そこで、本研究では、示差走査蛍光技術の原理を用いて、蛍光酵素マーカーを用いてCD40タンパク質とウンベリフェロンとの相互作用を解析します。まず、タンパク質蛍光オレンジ色素の安定性を実験的に検証し、1:500の最適希釈比を決定しました。その結果、CD40タンパク質の温度融解(Tm)値は、濃度の増加に伴って減少する傾向があることが観察されました。興味深いことに、CD40タンパク質とウンベリフェロンとの間の相互作用は、CD40タンパク質の熱安定性を高めることがわかりました。この研究は、蛍光マイクロプレートと蛍光色素を使用して低分子化合物とタンパク質の結合電位を検出する最初の試みです。この技術は、高い感度と精度を特徴とし、タンパク質の安定性、タンパク質構造、およびタンパク質-リガンド相互作用の分野における進歩が期待されているため、さらなる研究と探索が容易になります。

概要

Vicatia thibetica H. Boissieuは、臍帯科の植物で、チベット医学で一般的に使用されており、5つの基本成分(Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute、 Asparagus cochinchinensis (Lour.)Merr、 Vicatia thibetica H. Boissieu、 Oxybaphus himalaicus Edgew.、および Gymnadenia conopsea (L.)R. Br。¹.雲南省北西部、四川省西部、チベットなど、主に中国南西部に分布し、その乾燥根はアンジェリカ¹の地元の代替品として機能します。香りで知られる根はシチューの調味料としてよく利用され、チベットのセロリと呼ばれる葉はおいしい料理に貢献しています。したがって、 Vicatia thibetica は、ユニークな薬用植物としてだけでなく、チベットの食料源としても重要性を持っています。

国内外の研究によると、Vicatia thibeticaは血液を補充し、気(力またはエネルギー)を活性化する特性を持ち、月経の調節に有益です。動悸や血液欠乏による月経困難症の不規則な....

プロトコル

化合物溶液、タンパク質溶液、および色素をPBS溶液に導入しました。その後、デジタル加熱振とうドライバスを用いて試料を段階的に加熱し、複合体系内の蛍光強度の変化を測定することでタンパク質の熱安定性を評価しました。詳細な手順を以下に概説し、 図 1 にプロトコルの概要を示します。

1. 溶液の調製

1. 616.75 μL の DMSO 溶液に 0.1 mg のウンベリフェロンを添加して、1 mM のウンベリフェロン溶液を調製します( 材料の表を参照)。
2. 0.1 mg の CD40 を 500 μL の ddH₂O 溶液に加えて、200 μg/mL の CD40 タンパク質溶液を調製します( 「材料の表」を参照)。
3. 500x Orange色素1 μLを9 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、500x Orange色素溶液を調製します( 材料の表を参照)。
   注:上記の操作を氷上で行い、ピペットの最小範囲が0.1μLであるため、最初にオレンジタンパク質色素を10倍に希釈して、その後の使用を容易にします。

2.染料性能試験

ディスカッション

DSFは、熱シフトアッセイまたは熱蛍光アッセイとも呼ばれ、プログラムされたゆっくりとした温度上昇中に試験サンプルまたは色素の蛍光シグナルの変化を監視することにより、サンプル中のタンパク質の熱変性プロセスを検出するために使用される技術です。Pantoliano¹⁴によって最初に確立されたDSFは、ハイスループットな方法として機能します。主な手順は、コンピュー?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854