זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

Abstract

חקירת אינטראקציות בין מולקולות שונות היא היבט מכריע בהבנת פתוגנזה של מחלות וסינון מטרות תרופות. Umbelliferone, מרכיב פעיל ברפואה הטיבטית Vicatia thibetica, מציג אפקט אימונומודולטורי עם מנגנון לא ידוע. חלבון CD40 הוא מטרה מרכזית בתגובה החיסונית. לכן, מחקר זה משתמש בעיקרון של סריקה דיפרנציאלית טכנולוגיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את האינטראקציות בין חלבון CD40 לבין umbelliferone באמצעות סמנים אנזימים פלואורסצנטיים. בתחילה, יציבות הצבע הכתום הפלואורסצנטי של החלבון אומתה בניסוי, ונקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500. לאחר מכן, נצפתה כי ערך המסת הטמפרטורה (Tm) של חלבון CD40 נטה לרדת עם עלייה בריכוז. באופן מעניין, האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone נמצאה כמשפרת את היציבות התרמית של חלבון CD40. מחקר זה מייצג את הניסיון הראשון לזהות את פוטנציאל הקישור של תרכובות מולקולות קטנות וחלבונים באמצעות מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות וצבעים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאופיינת ברגישות ודיוק גבוהים, ומבטיחה התקדמות בתחומי יציבות החלבון, מבנה החלבונים ואינטראקציות חלבון-ליגנד, ובכך מאפשרת מחקר וחקירה נוספים.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, צמח ממשפחת האומבליפיים, נפוץ ברפואה הטיבטית ומייצג את אחד המרכיבים החיוניים של חמשת המרכיבים הבסיסיים (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., ו - Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. מופץ בעיקר בדרום מערב סין, כגון צפון מערב יונאן, מערב סצ'ואן, טיבט ואזורים נוספים, השורש המיובש שלו משמש תחליף מקומי לאנג'ליקה¹. השורש, הידוע בניחוחו, משמש לעתים קרובות כתיבול תבשיל, והעלים, המכונים סלרי טיבטי, תורמים למאכלים טעימים. לפיכך, Vicatia thibetica<....

Protocol

תמיסת התרכובת, תמיסת החלבונים והצבע הוכנסו לתמיסת PBS. לאחר מכן, הדגימות עברו חימום הדרגתי באמצעות חימום דיגיטלי המנער אמבטיה יבשה, והיציבות התרמית של החלבונים הוערכה על ידי מדידת השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות במערכת המורכבת. השלבים המפורטים מתוארים להלן, ואיור 1 ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. הכנת פתרון

1. הכינו תמיסת אומבליפרון בנפח 1 מ"מ על ידי הוספת 0.1 מ"ג אומבליפרון ל-616.75 מיקרוליטר תמיסת DMSO (ראו טבלת חומרים).
2. הכינו תמיסת חלבון CD40 של 200 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 0.1 מ"ג CD40 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת ddH₂O (ראו טבלת חומרים

תוצאות

הצבע הכתום הפגין באופן עקבי עירור פלואורסצנטי יציב ב- E_x = 470 ננומטר ו- E_m = 570 ננומטר, הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות גבוהות. נקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500 (איור 2A,B). זיהוי ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית היה מאתגר כאשר ריכוז חלבון CD40 היה מתחת ל-15 מק"ג/מ"ל (איור 3A,.......

Discussion

DSF, הידועה גם בשם בדיקת שינוי תרמי או בדיקת פלואורסצנטיות תרמית, היא טכניקה המשמשת לזיהוי תהליך של דנטורציה תרמית של חלבונים בדגימות על ידי ניטור שינויים באות הפלואורסצנטי של דגימת הבדיקה או הצבע במהלך עליית טמפרטורה איטית ומתוכנתת. DSF, שהוקמה לראשונה על ידי פנטוליאנו¹⁴, משמשת .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854