זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

Abstract

חקירת אינטראקציות בין מולקולות שונות היא היבט מכריע בהבנת פתוגנזה של מחלות וסינון מטרות תרופות. Umbelliferone, מרכיב פעיל ברפואה הטיבטית Vicatia thibetica, מציג אפקט אימונומודולטורי עם מנגנון לא ידוע. חלבון CD40 הוא מטרה מרכזית בתגובה החיסונית. לכן, מחקר זה משתמש בעיקרון של סריקה דיפרנציאלית טכנולוגיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את האינטראקציות בין חלבון CD40 לבין umbelliferone באמצעות סמנים אנזימים פלואורסצנטיים. בתחילה, יציבות הצבע הכתום הפלואורסצנטי של החלבון אומתה בניסוי, ונקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500. לאחר מכן, נצפתה כי ערך המסת הטמפרטורה (Tm) של חלבון CD40 נטה לרדת עם עלייה בריכוז. באופן מעניין, האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone נמצאה כמשפרת את היציבות התרמית של חלבון CD40. מחקר זה מייצג את הניסיון הראשון לזהות את פוטנציאל הקישור של תרכובות מולקולות קטנות וחלבונים באמצעות מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות וצבעים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאופיינת ברגישות ודיוק גבוהים, ומבטיחה התקדמות בתחומי יציבות החלבון, מבנה החלבונים ואינטראקציות חלבון-ליגנד, ובכך מאפשרת מחקר וחקירה נוספים.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, צמח ממשפחת האומבליפיים, נפוץ ברפואה הטיבטית ומייצג את אחד המרכיבים החיוניים של חמשת המרכיבים הבסיסיים (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., ו - Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. מופץ בעיקר בדרום מערב סין, כגון צפון מערב יונאן, מערב סצ'ואן, טיבט ואזורים נוספים, השורש המיובש שלו משמש תחליף מקומי לאנג'ליקה¹. השורש, הידוע בניחוחו, משמש לעתים קרובות כתיבול תבשיל, והעלים, המכונים סלרי טיבטי, תורמים למאכלים טעימים. לפיכך, Vicatia thibetica הוא בעל משמעות לא רק כצמח מרפא ייחודי אלא גם כמקור מזון בטיבט.

מחקרים מקומיים ובינלאומיים מצביעים על כך ש- Vicatia thibetica היא בעלת תכונות ממריצות דם וצ'י (כוח או אנרגיה), המועילות להסדרת הווסת. הוא משמש לטיפול בסימפטומים של דיסמנוריאה וסתית לא סדירה הנגרמת על ידי דפיקות לב ומחסור בדם, ומציג השפעות פרמקולוגיות כגון ויסות נוגד חמצון של חסינות הגוף². תמצית האלכוהול של Vicatia thibetica הדגימה את היכולת לשחזר את מסת הגוף ואת אינדקס האיברים בעכברים מדוכאי חיסון המושרים על ידי cyclophosphamide. בנוסף, הוא מגביר את הפעילות של סופראוקסיד דיסמוטאז בסרום ומפחית את התוכן של malondialdehyde, מה שמרמז על שיפור ביכולת נוגדת חמצון והשפעה מאזנת על חמצון שומנים ^2,3. במקביל, הוא משפר את מספר תאי הדם וההמוגלובין, אשר לא רק משקף באופן אובייקטיבי את התפקוד ההמטופויטי של הגוף, אלא גם ממלא תפקיד מכריע במערכת החיסון ^2,3.

Umbelliferone, המאופיין גבישים acicular טעם מר, בעל משקל מולקולרי קטן, הוא נדיף, והוא יכול להיות מזוקק עם אדים. הוא עובר סובלימציה בקלות, בעל מסיסות נמוכה במים ומסיסות גבוהה בחומר אורגני. כאחד המרכיבים הכימיים העיקריים של Vicatia thibetica, umbelliferone מציג השפעות אימונומודולטוריות על חסינות תאית, חסינות הומורלית וחסינות לא ספציפית במודלים של עכברי דיכוי חיסוני^המושרה על ידי הידרוקורטיזון ^4,5.

מולקולת פני התא CD40, חברה במשפחת קולטני גורם נמק הגידול, מתבטאת באופן נרחב בתאי מערכת החיסון⁶. הליגנד ההומולוגי שלו, CD154, הידוע גם בשם CD40L, הוא חלבון טרנסממברנה מסוג II המתבטא על ידי לימפוציטים פעילים מסוג T. להפעלת CD40 יש את היכולת לווסת את הביטוי של מולקולות קו-סטימולטוריות על פני השטח של תאים דנדריטיים (DC) ומונוציטים. תהליך זה מקדם את פונקציית הצגת האנטיגן של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות (MHC) ומפעיל עוד יותר תאי CD8+ T⁷.

מקרופאגים ממלאים תפקיד מכריע בהיווצרות ובוויסות של מיקרו-סביבת הגידול, והפעלת CD40 יכולה לשפר את העיצוב מחדש של מיקרו-סביבת הגידול על ידי מקרופאגים⁸. הפעלת אות CD40 משפיעה באופן משמעותי על התרבות והפעלה של תאי B. תאי B, כאשר מופעלים על ידי CD40, יכולים לתפקד כתאים מציגי אנטיגן יעילים. הם מציגים אנטיגנים, מייצרים פעילות תאי T משפיעים, ובכך תורמים להשפעות אנטי-סרטניות⁹. יתר על כן, הפעלת CD40 בתאי הגידול יכולה לגרום לאפופטוזיס ולעכב את צמיחת הגידול¹⁰. CD40 בעיקר מתמיר אותות על ידי שליטה בפעילות של קינאזות חלבון טירוזין שאינן קולטנות, כולל לין, פין, סייק ואחרים. בנוסף, יש לו את היכולת לעורר חלבונים Bcl-xL, Cdk4 ו- Cdk6, להפעיל גורמי שעתוק Rel/NF-kB, ופוספורילט CG-2 ו- PI3K¹⁰.

שיטת פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית (DSF) נמצאת בשימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעה של תנאים סביבתיים שונים, כגון הרכב חיץ, טמפרטורה וליגנדות של מולקולות קטנות, על היציבות התרמית של מבני חלבונים. הצבע הנפוץ עבור DSF הוא צבע כתום, רגיש לסביבה, הידרופובי. בתנאים רגילים, מבנה החלבון מקופל, ומסתיר את המקטע ההידרופובי שלו מבפנים. ככל שהטמפרטורה עולה, האזור ההידרופובי של החלבון נחשף יותר, וכתוצאה מכך מתפרק בהדרגה מבנה החלבון הטבעי. הצבע נקשר באופן סלקטיבי לחלק חלבוני חשוף זה, ומגביר את הפלואורסצנטיות שלו. ערכי Tm מחושבים לאחר מכן על ידי ניטור שינויים בזיהוי אות פלואורסצנטי¹¹. במידה מסוימת, שינויים בערכי המדיטציה הטרנסנדנטלית יכולים לאמוד שינויים ביציבות החלבונים עקב מוטציות, שינויים במאגרים או קשירת ליגנדים. יתר על כן, הוא יכול להצביע על שינויים מבניים בתהליך קיפול החלבונים¹². גישה זו מציעה נתונים מדויקים, טווח טמפרטורות רחב, רגישות גבוהה ואובדן דגימת חלבון מינימלי¹³.

במחקר זה, קביעת פלואורסצנטיות בוצעה באמצעות קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי במקום מנגנון תגובת שרשרת פולימראז כמותי פלואורסצנטי (PCR). שינוי זה מאפשר זיהוי DSF במעבדות ללא מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי, מה שהופך את השיטה לפחות מורכבת ומפחית את השלבים הנדרשים להתקנת המכשיר, ובכך מפשט את תהליך הניסוי. עם זאת, ישנם חסרונות מסוימים לגישה זו. בעוד המורכבות מצטמצמת, ההליך הופך מסורבל יותר. יש צורך בזיהוי פלואורסצנטי ידני בטמפרטורות שונות, ולא ניתן להשיג איסוף אוטומטי ורציף של פלואורסצנטיות מהמערכת. לפיכך, מחקר זה השתמש בטכניקת DSF כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone, ומספק תובנות חדשות על המנגנונים המולקולריים של הרפואה הטיבטית.

Protocol

תמיסת התרכובת, תמיסת החלבונים והצבע הוכנסו לתמיסת PBS. לאחר מכן, הדגימות עברו חימום הדרגתי באמצעות חימום דיגיטלי המנער אמבטיה יבשה, והיציבות התרמית של החלבונים הוערכה על ידי מדידת השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות במערכת המורכבת. השלבים המפורטים מתוארים להלן, ואיור 1 ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. הכנת פתרון

1. הכינו תמיסת אומבליפרון בנפח 1 מ"מ על ידי הוספת 0.1 מ"ג אומבליפרון ל-616.75 מיקרוליטר תמיסת DMSO (ראו טבלת חומרים).
2. הכינו תמיסת חלבון CD40 של 200 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 0.1 מ"ג CD40 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת ddH₂O (ראו טבלת חומרים).
3. הכינו תמיסת צבע כתום 500x על ידי הוספת 1 μL של צבע כתום 5000x ל-9 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראה טבלת חומרים).
   הערה: בצע את הפעולות לעיל על קרח, ומכיוון פיפטה יש טווח מינימלי של 0.1 μL, בתחילה לדלל את צבע חלבון כתום על ידי גורם של 10 כדי להקל על השימוש הבא.

2. בדיקת ביצועי צבע

1. הוסף את הצבע הכתום 500x לתמיסת PBS ודלל אותו לקבלת צבע: יחסי PBS של 1:500, 1:1000, 1:2000 ו- 1:4000.
   הערה: ודא שהריכוז הסופי של DMSO אינו עולה על 2% (v/v).
2. הפעילו את קורא המיקרו-צלחות הפלואורסצנטיות וחממו אותו מראש למשך 10 דקות.
3. פתח את המחשב ואת תוכנת איסוף הנתונים ברצף (ראה טבלת חומרים).
4. לחץ על מכשיר, בחר את דגם המיקרו-צלחת הפלואורסצנטי המתאים ובחר אישור בתוכנת רכישת הנתונים.
   הערה: המתן עד שהמיקרו-פלטה הפלואורסצנטית תסיים את החימום המוקדם ותציג את הטמפרטורה בלוח לפני פתיחת תוכנת איסוף הנתונים כדי להבטיח חיבור מוצלח בין המכשיר לתוכנה.
5. לחץ על הגדרות רכישה ובחר Fluorescence בתוכנת רכישת הנתונים.
6. ערוך את התוכנית בממשק אורכי גל : Lm1 = 470 ננומטר, 570 ננומטר ולאחר מכן בחר אישור.
   הערה: הצבע הכתום יכול להיות מעורר עם אור UV ב 300 ננומטר או אור נראה ב 470 ננומטר, ואת הפליטה ניתן למדוד ב 570 ננומטר.
7. הוסף ריכוזים שונים של צבע כתום (1:500, 1:1000, 1:2000 ו-1:4000) ו-PBS לצלחות 96 בארות ב-100 מיקרוליטר/באר.
   הערה: יש להמיס את התמיסה ב-DMSO לפני הוספתה ל-PBS, ולערבל אותה ב-2000 x גרם ביסודיות במהלך תהליך ההכנה כדי להבטיח המסה מלאה בשל נטיית הצבע לזרז.
8. הכניסו את צלחת 96 הקידוחים לשלב הזיהוי של המכשיר, לחצו על כפתור הקריאה בתוכנת איסוף הנתונים, ומדדו את הפלואורסצנטיות של ריכוז הצבע 13 פעמים בטמפרטורת החדר, עם מרווח של 2 דקות בכל פעם.
9. לחץ על יצוא כפתור לאחר כל קביעה, בחר ייצוא ל- XML XLS TXT, בחר כל הצלחות, ולאחר מכן בחר צלחת בפורמט פלט, ולבסוף לחץ על אישור כדי לשמור את הנתונים בתיקיה בפורמט "XLS" לניתוח נוסף.
   הערה: שלבים אלה מסייעים לקבוע את ההשפעה של מדידה רציפה על הפלואורסצנטיות העצמית של הצבע הכתום בטמפרטורת החדר ולזהות את ריכוז הצביעה האופטימלי.
10. הפעל את האמבטיה היבשה המטלטלת את החימום הדיגיטלי, הגדר את טמפרטורת החימום ל -35 מעלות צלזיוס ואת זמן החימום ל -2 דקות.
11. הכינו את יחס הדילול האופטימלי של הצבע בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל והניחו אותו באמבט החימום הדיגיטלי המנער היבש למשך 2 דקות.
12. הוסף את תמיסת PBS ואת תמיסת הצביעה, מחוממת ב 35 ° C, לצלחת 96 באר בנפח של 100 μL לכל באר.
13. הכניסו את לוחית 96 הקידוחים לשלב הזיהוי של המכשיר, ולחצו על כפתור הקריאה בתוכנת איסוף הנתונים.
14. כוונו את טמפרטורת החימום ל-40°C ואת זמן החימום ל-2 דקות.
15. פיפטה את תמיסת הצבע בצלחת 96 באר בחזרה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ומחממים אותו במכשיר במשך 2 דקות.
16. חזור על הפעולות של שלבים 2.12-2.15 ושלב 2.9 כדי לבדוק את ספיגת תמיסת הצבע ב- 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 85°C, 90°C ו- 95°C, בהתאמה.
    הערה: שלבים אלה מסייעים לקבוע את יציבות האוטופלואורסצנטיות של הצבע הכתום תחת חימום מתמשך בשיפוע מ- 35 °C עד 95 °C. חיוני לעבוד במהירות כדי למנוע ירידות טמפרטורה מהירות או הוספת נוזל לא נכון, מה שעלול להוביל לטעויות ניסיוניות.

3. זיהוי המסת הטמפרטורה (Tm) של החלבון

1. שלב חלבון CD40 וצבע כתום עם תמיסת PBS כדי להשיג ריכוזים סופיים של 5 מיקרוגרם / מ"ל, 10 מיקרוגרם / מ"ל, 15 מיקרוגרם / מ"ל, 20 מיקרוגרם / מ"ל ו 1:500, בהתאמה.
2. חזור על הפעולות המתוארות בשלבים 2.2-2.6 ושלבים 2.10-2.16 כדי להעריך את ספיגת תמיסת החלבון CD40 בטמפרטורות של 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ו- 95 °C, בהתאמה.
3. חזור על שלב 2.9 כדי לשמור ולנתח את הנתונים, ולאחר מכן חשב את ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית באמצעות תוכנה לניתוח נתונים (ראה טבלת חומרים).
4. הוסף חלבון CD40, אומבליפרון וצבע כתום לתמיסת PBS כדי לקבל ריכוזים סופיים של 5 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 15 מק"ג/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל, 10 מיקרומטר ו-1:500, בהתאמה.
   הערה: מערבולות נמרצות במהלך הכנת התמיסה חיוניות כדי להבטיח פיזור אחיד של הצבע, חלבון CD40 ואומבליפרון ב- PBS.
5. חזור על הפעולות של שלבים 3.2-3.3 כדי למדוד את הספיגה של תמיסת מתחמי CD40-umbelliferone בטמפרטורות של 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ו- 95 °C, בהתאמה.
   הערה: צעדים אלה נערכו כדי לקבוע את ערכי המדיטציה הטרנסנדנטלית של קומפלקסים של חלבון CD40 ו-CD40-umbelliferone, במטרה לזהות את ריכוז הקישור האופטימלי של חלבון CD40 לאומבליפרון.

תוצאות

הצבע הכתום הפגין באופן עקבי עירור פלואורסצנטי יציב ב- E_x = 470 ננומטר ו- E_m = 570 ננומטר, הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות גבוהות. נקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500 (איור 2A,B). זיהוי ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית היה מאתגר כאשר ריכוז חלבון CD40 היה מתחת ל-15 מק"ג/מ"ל (איור 3A,...

Discussion

DSF, הידועה גם בשם בדיקת שינוי תרמי או בדיקת פלואורסצנטיות תרמית, היא טכניקה המשמשת לזיהוי תהליך של דנטורציה תרמית של חלבונים בדגימות על ידי ניטור שינויים באות הפלואורסצנטי של דגימת הבדיקה או הצבע במהלך עליית טמפרטורה איטית ומתוכנתת. DSF, שהוקמה לראשונה על ידי פנטוליאנו¹⁴, משמשת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854