A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

Abstract

חקירת אינטראקציות בין מולקולות שונות היא היבט מכריע בהבנת פתוגנזה של מחלות וסינון מטרות תרופות. Umbelliferone, מרכיב פעיל ברפואה הטיבטית Vicatia thibetica, מציג אפקט אימונומודולטורי עם מנגנון לא ידוע. חלבון CD40 הוא מטרה מרכזית בתגובה החיסונית. לכן, מחקר זה משתמש בעיקרון של סריקה דיפרנציאלית טכנולוגיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את האינטראקציות בין חלבון CD40 לבין umbelliferone באמצעות סמנים אנזימים פלואורסצנטיים. בתחילה, יציבות הצבע הכתום הפלואורסצנטי של החלבון אומתה בניסוי, ונקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500. לאחר מכן, נצפתה כי ערך המסת הטמפרטורה (Tm) של חלבון CD40 נטה לרדת עם עלייה בריכוז. באופן מעניין, האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone נמצאה כמשפרת את היציבות התרמית של חלבון CD40. מחקר זה מייצג את הניסיון הראשון לזהות את פוטנציאל הקישור של תרכובות מולקולות קטנות וחלבונים באמצעות מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות וצבעים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאופיינת ברגישות ודיוק גבוהים, ומבטיחה התקדמות בתחומי יציבות החלבון, מבנה החלבונים ואינטראקציות חלבון-ליגנד, ובכך מאפשרת מחקר וחקירה נוספים.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, צמח ממשפחת האומבליפיים, נפוץ ברפואה הטיבטית ומייצג את אחד המרכיבים החיוניים של חמשת המרכיבים הבסיסיים (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., ו - Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. מופץ בעיקר בדרום מערב סין, כגון צפון מערב יונאן, מערב סצ'ואן, טיבט ואזורים נוספים, השורש המיובש שלו משמש תחליף מקומי לאנג'ליקה1. השורש, הידוע בניחוחו, משמש לעתים קרובות כתיבול תבשיל, והעלים, המכונים סלרי טיבטי, תורמים למאכלים טעימים. לפיכך, Vicatia thibetica<....

Protocol

תמיסת התרכובת, תמיסת החלבונים והצבע הוכנסו לתמיסת PBS. לאחר מכן, הדגימות עברו חימום הדרגתי באמצעות חימום דיגיטלי המנער אמבטיה יבשה, והיציבות התרמית של החלבונים הוערכה על ידי מדידת השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות במערכת המורכבת. השלבים המפורטים מתוארים להלן, ואיור 1 ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. הכנת פתרון

  1. הכינו תמיסת אומבליפרון בנפח 1 מ"מ על ידי הוספת 0.1 מ"ג אומבליפרון ל-616.75 מיקרוליטר תמיסת DMSO (ראו טבלת חומרים).
  2. הכינו תמיסת חלבון CD40 של 200 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 0.1 מ"ג CD40 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת ddH2O (ראו טבלת חומרים

תוצאות

הצבע הכתום הפגין באופן עקבי עירור פלואורסצנטי יציב ב- Ex = 470 ננומטר ו- Em = 570 ננומטר, הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות גבוהות. נקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500 (איור 2A,B). זיהוי ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית היה מאתגר כאשר ריכוז חלבון CD40 היה מתחת ל-15 מק"ג/מ"ל (איור 3A,.......

Discussion

DSF, הידועה גם בשם בדיקת שינוי תרמי או בדיקת פלואורסצנטיות תרמית, היא טכניקה המשמשת לזיהוי תהליך של דנטורציה תרמית של חלבונים בדגימות על ידי ניטור שינויים באות הפלואורסצנטי של דגימת הבדיקה או הצבע במהלך עליית טמפרטורה איטית ומתוכנתת. DSF, שהוקמה לראשונה על ידי פנטוליאנו14, משמשת .......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מביעים את הערכתנו הכנה לתמיכה הכספית שהתקבלה מפרויקט בניית הקונוטציה של תוכנית החומש ה -14 של האוניברסיטה לרפואה טיבטית (2022ZYYGH12), הנושאים הפתוחים 2022 של מעבדת המפתח של הרפואה הטיבטית וחינוך בסיסי של משרד החינוך באוניברסיטה לרפואה טיבטית (ZYYJC-22-04), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר Xinglin Scholar של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (XKTD2022013).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CD40 proteinMedChemExpressHY-P75408
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate readerShanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTDFlexStation 3
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)Gibco8120485
SoftMax Pro 7.1Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTDSoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dyeSigmaS5942
UmbelliferoneShanghai Yuanye Biotechnology Co.B21854

References

  1. Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).
  2. Li, L., et al. Effects ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CD40Umbelliferone

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved