A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.
חקירת אינטראקציות בין מולקולות שונות היא היבט מכריע בהבנת פתוגנזה של מחלות וסינון מטרות תרופות. Umbelliferone, מרכיב פעיל ברפואה הטיבטית Vicatia thibetica, מציג אפקט אימונומודולטורי עם מנגנון לא ידוע. חלבון CD40 הוא מטרה מרכזית בתגובה החיסונית. לכן, מחקר זה משתמש בעיקרון של סריקה דיפרנציאלית טכנולוגיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את האינטראקציות בין חלבון CD40 לבין umbelliferone באמצעות סמנים אנזימים פלואורסצנטיים. בתחילה, יציבות הצבע הכתום הפלואורסצנטי של החלבון אומתה בניסוי, ונקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500. לאחר מכן, נצפתה כי ערך המסת הטמפרטורה (Tm) של חלבון CD40 נטה לרדת עם עלייה בריכוז. באופן מעניין, האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone נמצאה כמשפרת את היציבות התרמית של חלבון CD40. מחקר זה מייצג את הניסיון הראשון לזהות את פוטנציאל הקישור של תרכובות מולקולות קטנות וחלבונים באמצעות מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות וצבעים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאופיינת ברגישות ודיוק גבוהים, ומבטיחה התקדמות בתחומי יציבות החלבון, מבנה החלבונים ואינטראקציות חלבון-ליגנד, ובכך מאפשרת מחקר וחקירה נוספים.
Vicatia thibetica H. Boissieu, צמח ממשפחת האומבליפיים, נפוץ ברפואה הטיבטית ומייצג את אחד המרכיבים החיוניים של חמשת המרכיבים הבסיסיים (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., ו - Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. מופץ בעיקר בדרום מערב סין, כגון צפון מערב יונאן, מערב סצ'ואן, טיבט ואזורים נוספים, השורש המיובש שלו משמש תחליף מקומי לאנג'ליקה1. השורש, הידוע בניחוחו, משמש לעתים קרובות כתיבול תבשיל, והעלים, המכונים סלרי טיבטי, תורמים למאכלים טעימים. לפיכך, Vicatia thibetica<....
תמיסת התרכובת, תמיסת החלבונים והצבע הוכנסו לתמיסת PBS. לאחר מכן, הדגימות עברו חימום הדרגתי באמצעות חימום דיגיטלי המנער אמבטיה יבשה, והיציבות התרמית של החלבונים הוערכה על ידי מדידת השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות במערכת המורכבת. השלבים המפורטים מתוארים להלן, ואיור 1 ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול.
1. הכנת פתרון
הצבע הכתום הפגין באופן עקבי עירור פלואורסצנטי יציב ב- Ex = 470 ננומטר ו- Em = 570 ננומטר, הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות גבוהות. נקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500 (איור 2A,B). זיהוי ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית היה מאתגר כאשר ריכוז חלבון CD40 היה מתחת ל-15 מק"ג/מ"ל (איור 3A,.......
DSF, הידועה גם בשם בדיקת שינוי תרמי או בדיקת פלואורסצנטיות תרמית, היא טכניקה המשמשת לזיהוי תהליך של דנטורציה תרמית של חלבונים בדגימות על ידי ניטור שינויים באות הפלואורסצנטי של דגימת הבדיקה או הצבע במהלך עליית טמפרטורה איטית ומתוכנתת. DSF, שהוקמה לראשונה על ידי פנטוליאנו14, משמשת .......
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מביעים את הערכתנו הכנה לתמיכה הכספית שהתקבלה מפרויקט בניית הקונוטציה של תוכנית החומש ה -14 של האוניברסיטה לרפואה טיבטית (2022ZYYGH12), הנושאים הפתוחים 2022 של מעבדת המפתח של הרפואה הטיבטית וחינוך בסיסי של משרד החינוך באוניברסיטה לרפואה טיבטית (ZYYJC-22-04), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר Xinglin Scholar של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (XKTD2022013).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
CD40 protein | MedChemExpress | HY-P75408 | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
FlexStation 3 multifunctional microplate reader | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | FlexStation 3 | |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
SoftMax Pro 7.1 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | SoftMax Pro 7.1 | |
SSYPRO orange dye | Sigma | S5942 | |
Umbelliferone | Shanghai Yuanye Biotechnology Co. | B21854 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved