Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Özet

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Özet

Farklı moleküller arasındaki etkileşimlerin araştırılması, hastalık patogenezini anlamanın ve ilaç hedeflerinin taranmasının çok önemli bir yönüdür. Tibet tıbbı Vicatia thibetica'da aktif bir bileşen olan umbelliferon, bilinmeyen bir mekanizma ile immünomodülatör bir etki sergiler. CD40 proteini, bağışıklık tepkisinde önemli bir hedeftir. Bu nedenle, bu çalışma, floresan enzim belirteçleri kullanarak CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimleri analiz etmek için diferansiyel taramalı floresan teknolojisi ilkesini kullanmaktadır. Başlangıçta, protein floresan turuncu boyanın stabilitesi deneysel olarak doğrulandı ve 1:500'lük optimal seyreltme oranı belirlendi. Daha sonra, CD40 proteininin sıcaklıkta erime (Tm) değerinin, konsantrasyondaki bir artışla azalma eğiliminde olduğu gözlendi. İlginç bir şekilde, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimin, CD40 proteininin termal stabilitesini arttırdığı bulundu. Bu çalışma, floresan mikroplakalar ve floresan boyalar kullanarak küçük moleküllü bileşiklerin ve proteinlerin bağlanma potansiyelini tespit etmeye yönelik ilk girişimi temsil etmektedir. Teknik, yüksek hassasiyet ve doğruluk, protein stabilitesi, protein yapısı ve protein-ligand etkileşimleri alanlarında umut verici ilerlemeler ile karakterize edilir, böylece daha fazla araştırma ve araştırmayı kolaylaştırır.

Giriş

Umbelliferous familyasından bir bitki olan Vicatia thibetica H. Boissieu, Tibet tıbbında yaygın olarak kullanılır ve beş temel bileşenin (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. ve Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Esas olarak kuzeybatı Yunnan, batı Sichuan, Tibet ve diğer bölgeler gibi güneybatı Çin'de dağıtılan kurutulmuş kökü, Angelica^1'in yerel bir ikamesi olarak hizmet eder. Kokusuyla bilinen kök, genellikle güveç baharatı olarak kullanılır ve Tibet kerevizi olar....

Protokol

Bileşik çözelti, protein çözeltisi ve boya, bir PBS çözeltisine dahil edildi. Daha sonra, numuneler, dijital ısıtma çalkalama kuru banyosu kullanılarak kademeli olarak ısıtıldı ve proteinlerin termal stabilitesi, karmaşık sistem içindeki floresan yoğunluğundaki değişimin ölçülmesiyle değerlendirildi. Ayrıntılı adımlar aşağıda özetlenmiştir ve Şekil 1'de protokole genel bir bakış gösterilmektedir.

1. Çözelti hazırlama

1. 616.75 μL DMSO çözeltisine 0.1 mg umbelliferon ekleyerek 1 mM'lik bir umbelliferon çözeltisi hazırlayın (bkz.
2. 500 μL ddH 2O çözeltisine 0.1 mg ....

Tartışmalar

Termal kayma tahlili veya termal floresan tahlili olarak da bilinen DSF, yavaş, programlanmış bir sıcaklık artışı sırasında test numunesinin veya boyanın floresan sinyalindeki değişiklikleri izleyerek numunelerdeki proteinlerin termal denatürasyon sürecini tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. Başlangıçta Pantoliano¹⁴ tarafından kurulan DSF, yüksek verimli bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Ana prosedür, bilgisayar kontrollü ısıtılmış bir plaka üzerindeki s?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854