Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Özet

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Özet

Farklı moleküller arasındaki etkileşimlerin araştırılması, hastalık patogenezini anlamanın ve ilaç hedeflerinin taranmasının çok önemli bir yönüdür. Tibet tıbbı Vicatia thibetica'da aktif bir bileşen olan umbelliferon, bilinmeyen bir mekanizma ile immünomodülatör bir etki sergiler. CD40 proteini, bağışıklık tepkisinde önemli bir hedeftir. Bu nedenle, bu çalışma, floresan enzim belirteçleri kullanarak CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimleri analiz etmek için diferansiyel taramalı floresan teknolojisi ilkesini kullanmaktadır. Başlangıçta, protein floresan turuncu boyanın stabilitesi deneysel olarak doğrulandı ve 1:500'lük optimal seyreltme oranı belirlendi. Daha sonra, CD40 proteininin sıcaklıkta erime (Tm) değerinin, konsantrasyondaki bir artışla azalma eğiliminde olduğu gözlendi. İlginç bir şekilde, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimin, CD40 proteininin termal stabilitesini arttırdığı bulundu. Bu çalışma, floresan mikroplakalar ve floresan boyalar kullanarak küçük moleküllü bileşiklerin ve proteinlerin bağlanma potansiyelini tespit etmeye yönelik ilk girişimi temsil etmektedir. Teknik, yüksek hassasiyet ve doğruluk, protein stabilitesi, protein yapısı ve protein-ligand etkileşimleri alanlarında umut verici ilerlemeler ile karakterize edilir, böylece daha fazla araştırma ve araştırmayı kolaylaştırır.

Giriş

Umbelliferous familyasından bir bitki olan Vicatia thibetica H. Boissieu, Tibet tıbbında yaygın olarak kullanılır ve beş temel bileşenin (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. ve Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Esas olarak kuzeybatı Yunnan, batı Sichuan, Tibet ve diğer bölgeler gibi güneybatı Çin'de dağıtılan kurutulmuş kökü, Angelica^1'in yerel bir ikamesi olarak hizmet eder. Kokusuyla bilinen kök, genellikle güveç baharatı olarak kullanılır ve Tibet kerevizi olarak adlandırılan yapraklar nefis yemeklere katkıda bulunur. Bu nedenle, Vicatia thibetica sadece eşsiz bir şifalı bitki olarak değil, aynı zamanda Tibet'te bir besin kaynağı olarak da önem taşımaktadır.

Hem yerel hem de uluslararası araştırmalar, Vicatia thibetica'nın adet kanamasını düzenlemek için faydalı olan kan yenileyici ve qi (güç veya enerji) canlandırıcı özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. Çarpıntı ve kan eksikliğinden kaynaklanan düzensiz adet dismenoresi semptomlarını ele almak için kullanılır ve vücut bağışıklığının antioksidan düzenlenmesi gibi farmakolojik etkiler gösterir². Vicatia thibetica'nın alkol özütü, siklofosfamid tarafından indüklenen bağışıklığı baskılanmış farelerde vücut kütlesini ve organ indeksini geri kazanma yeteneğini göstermiştir. Ek olarak, serumdaki süperoksit dismutaz aktivitesini arttırır ve malondialdehit içeriğini azaltır, bu da antioksidan kapasitede bir iyileşme ve lipid peroksidasyonu üzerinde dengeleyici bir etki olduğunu düşündürür ^2,3. Aynı zamanda, sadece vücudun hematopoietik işlevini objektif olarak yansıtmakla kalmayıp aynı zamanda bağışıklık sisteminde çok önemli bir rol oynayan kan hücrelerinin ve hemoglobinin sayısını artırır ^2,3.

Asiküler kristaller ve acı bir tat ile karakterize edilen umbelliferon, küçük bir moleküler ağırlığa sahiptir, uçucudur ve buharla damıtılabilir. Kolayca süblimleşir, suda düşük çözünürlüğe ve organik maddede yüksek çözünürlüğe sahiptir. Vicatia thibetica'nın ana kimyasal bileşenlerinden biri olan umbelliferon, hidrokortizonun neden olduğu immünosupresyon fare modellerinde hücresel bağışıklık, humoral bağışıklık ve spesifik olmayan bağışıklık üzerinde immünomodülatör etkiler sergiler ^4,5.

Tümör nekroz faktörü reseptör süper ailesinin bir üyesi olan hücre yüzey molekülü CD40, bağışıklık hücrelerinde yaygın olarak eksprese edilir⁶. CD40L olarak da bilinen homolog ligandı CD154, aktive edilmiş T lenfositleri tarafından eksprese edilen bir tip II transmembran proteinidir. CD40 aktivasyonu, dendritik hücrelerin (DC) ve monositlerin yüzeyindeki ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonunu yukarı regüle etme kapasitesine sahiptir. Bu işlem, majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin antijen sunum fonksiyonunu teşvik eder ve ayrıca CD8 + T hücrelerini^{aktive eder 7}.

Makrofajlar, tümör mikroçevresinin oluşumunda ve düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar ve CD40 aktivasyonu, tümör mikroçevresinin makrofajlar tarafından yeniden şekillenmesini artırabilir⁸. CD40 sinyal aktivasyonu, B hücrelerinin proliferasyonunu ve aktivasyonunu önemli ölçüde etkiler. B hücreleri, CD40 tarafından aktive edildiğinde, etkili antijen sunan hücreler olarak işlev görebilir. Antijenleri sunarlar, efektör T hücresi aktivitesi oluştururlar ve böylece anti-tümör etkilerine katkıda bulunurlar⁹. Ayrıca, tümör hücrelerinde CD40 aktivasyonu apoptozu indükleyebilir ve tümör büyümesini inhibe edebilir¹⁰. CD40 esas olarak Lyn, Fyn, Syk ve diğerleri dahil olmak üzere reseptör olmayan tirozin protein kinazların aktivitesini kontrol ederek sinyalleri iletir. Ek olarak, Bcl-xL, Cdk4 ve Cdk6 proteinlerini uyarma, Rel/NF-kB transkripsiyon faktörlerini aktive etme ve CG-2 ve PI3K^10'u fosforile etme yeteneğine sahiptir.

Diferansiyel Taramalı Floresan (DSF) yöntemi, tampon bileşimi, sıcaklık ve küçük moleküllü ligandlar gibi çeşitli çevresel koşulların protein yapılarının termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. DSF için yaygın olarak kullanılan boya, turuncu, çevreye duyarlı, hidrofobik bir boyadır. Normal koşullar altında, protein yapısı katlanır ve hidrofobik segmentini dahili olarak gizler. Sıcaklık arttıkça, proteinin hidrofobik bölgesi daha fazla açığa çıkar ve bu da doğal protein yapısının kademeli olarak parçalanmasına neden olur. Boya, açıkta kalan bu protein kısmına seçici olarak bağlanır ve floresansını arttırır. Tm değerleri daha sonra floresan sinyali algılamadaki¹¹ değişikliklerin izlenmesiyle hesaplanır. Bir dereceye kadar, Tm değerlerindeki değişiklikler, mutasyonlar, tamponlardaki değişiklikler veya ligand bağlanması nedeniyle protein stabilitesindeki değişimleri ölçebilir. Ayrıca, protein katlama işlemi¹² sırasında yapısal değişiklikleri gösterebilir. Bu yaklaşım, kesin veriler, geniş bir sıcaklık aralığı, yüksek hassasiyet ve minimum protein numune kaybı^{sunar 13}.

Bu çalışmada, floresan tayini, floresan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aparatı yerine floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu modifikasyon, floresan kantitatif PCR cihazı olmayan laboratuvarlarda DSF tespitini mümkün kılar, bu da yöntemi daha az karmaşık hale getirir ve cihaz kurulumu için gereken adımları azaltır, böylece deneysel süreci basitleştirir. Ancak, bu yaklaşımın bazı dezavantajları vardır. Karmaşıklık azalırken, prosedür daha hantal hale gelir. Farklı sıcaklıklarda manuel floresan algılaması gereklidir ve sistemden otomatik ve sürekli floresan toplanması sağlanamaz. Bu nedenle, bu çalışma, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimi araştırmak için DSF tekniğini kullandı ve Tibet tıbbının moleküler mekanizmalarına yeni bakış açıları sağladı.

Protokol

Bileşik çözelti, protein çözeltisi ve boya, bir PBS çözeltisine dahil edildi. Daha sonra, numuneler, dijital ısıtma çalkalama kuru banyosu kullanılarak kademeli olarak ısıtıldı ve proteinlerin termal stabilitesi, karmaşık sistem içindeki floresan yoğunluğundaki değişimin ölçülmesiyle değerlendirildi. Ayrıntılı adımlar aşağıda özetlenmiştir ve Şekil 1'de protokole genel bir bakış gösterilmektedir.

1. Çözelti hazırlama

1. 616.75 μL DMSO çözeltisine 0.1 mg umbelliferon ekleyerek 1 mM'lik bir umbelliferon çözeltisi hazırlayın (bkz.
2. 500 μL ddH 2O çözeltisine 0.1 mg CD40 ekleyerek 200 μg / mL_CD40protein çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. 9 μL fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) 1 μL 5000x turuncu boya ekleyerek 500x turuncu boya çözeltisi hazırlayın (bkz.
   NOT: Yukarıdaki işlemleri buz üzerinde gerçekleştirin ve pipet minimum 0,1 μL aralığına sahip olduğundan, sonraki kullanımı kolaylaştırmak için başlangıçta turuncu protein boyasını 10 kat seyreltin.

2. Boya performans testi

1. 500x turuncu boyayı bir PBS çözeltisine ekleyin ve boya elde etmek için seyreltin: 1:500, 1:1000, 1:2000 ve 1:4000 PBS oranları.
   NOT: DMSO'nun nihai konsantrasyonunun %2'yi (h/v) aşmadığından emin olun.
2. Floresan mikroplaka okuyucuyu açın ve 10 dakika önceden ısıtın.
3. Bilgisayarı ve veri toplama yazılımını sırayla açın (bkz. Malzeme Tablosu).
4. Cihaz'a tıklayın, ilgili floresan mikroplaka modelini seçin ve veri toplama yazılımında Tamam'ı seçin.
   NOT: Cihaz ile yazılım arasında başarılı bir bağlantı sağlamak için veri toplama yazılımını açmadan önce floresan mikroplakanın ön ısıtmayı bitirmesini ve paneldeki sıcaklığı görüntülemesini bekleyin.
5. Edinme Ayarları'na tıklayın ve veri toplama yazılımında Floresans'ı seçin.
6. Programı Dalga Boyları arayüzünde düzenleyin: Lm1 = 470 nm, 570 nm ve ardından Tamam'ı seçin.
   NOT: Turuncu boya, 300 nm'de UV ışığı veya 470 nm'de görünür ışıkla uyarılabilir ve emisyon 570 nm'de ölçülebilir.
7. 100 μL / oyukta 96 oyuklu plakalara farklı konsantrasyonlarda turuncu boya (1:500, 1:1000, 1:2000 ve 1:4000) ve PBS ekleyin.
   NOT: Çözeltiyi PBS'ye eklemeden önce DMSO'da çözün ve boyanın çökelme eğilimi nedeniyle tam çözünmeyi sağlamak için hazırlama işlemi sırasında 2000 x g'da iyice girdaplayın.
8. 96 oyuklu plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin, veri toplama yazılımındaki Oku düğmesine tıklayın ve her boya konsantrasyonunun floresansını her seferinde 2 dakika aralıklarla oda sıcaklığında 13 kez ölçün.
9. Her belirlemeden sonra Dışa Aktar düğmesine tıklayın, XML XLS TXT'ye Aktar'ı seçin, Tüm Plakalar'ı seçin, ardından Çıktı Biçiminde Plaka'yı seçin ve son olarak daha fazla analiz için verileri "XLS" formatında bir klasöre kaydetmek için Tamam'a tıklayın.
   NOT: Bu adımlar, sürekli ölçümün oda sıcaklığında turuncu boyanın otofloresansı üzerindeki etkisini belirlemeye ve optimum boyama konsantrasyonunu belirlemeye yardımcı olur.
10. Dijital ısıtmalı çalkalama kuru banyosunu açın, ısıtma sıcaklığını 35 °C'ye ve ısıtma süresini 2 dakikaya ayarlayın.
11. Boyanın optimum seyreltme oranını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın ve 2 dakika boyunca dijital ısıtma çalkalama kuru banyosuna yerleştirin.
12. PBS çözeltisini ve 35 ° C'de ısıtılan boyama çözeltisini, oyuk başına 100 μL'lik bir hacimde 96 oyuklu plakaya ekleyin.
13. 96 oyuklu plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin ve veri toplama yazılımındaki Oku düğmesine tıklayın.
14. Isıtma sıcaklığını 40 °C'ye ve ısıtma süresini 2 dakikaya ayarlayın.
15. 96 oyuklu plakadaki boya solüsyonunu 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne geri pipetleyin ve cihazda 2 dakika ısıtın.
16. Boya çözeltisinin absorbansını sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C'de test etmek için adım 2.12-2.15 ve adım 2.9'daki işlemleri tekrarlayın.
    NOT: Bu adımlar, 35 °C ila 95 °C arasında bir gradyanda sürekli ısıtma altında turuncu boyanın otofloresan stabilitesinin belirlenmesine yardımcı olur. Hızlı sıcaklık düşüşlerinden veya deneysel hatalara yol açabilecek yanlış sıvının eklenmesinden kaçınmak için hızlı çalışmak çok önemlidir.

3. Proteinin erime sıcaklığının (Tm) tespiti

1. Sırasıyla 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL ve 1:500 nihai konsantrasyonlar elde etmek için CD40 proteini ve turuncu boyayı PBS çözeltisi ile birleştirin.
2. CD40 protein çözeltisinin sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C sıcaklıklarda absorbansını değerlendirmek için adım 2.2-2.6 ve adım 2.10-2.16'da belirtilen işlemleri tekrarlayın.
3. Verileri kaydetmek ve analiz etmek için adım 2.9'u tekrarlayın ve ardından veri analiz yazılımı kullanarak Tm değerini hesaplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
4. Sırasıyla 5 μg / mL, 10 μg / mL, 15 μg / mL, 20 μg / mL, 10 μM ve 1:500 nihai konsantrasyonlar elde etmek için PBS çözeltisine CD40 proteini, umbelliferon ve portakal boyası ekleyin.
   NOT: PBS'de boya, CD40 proteini ve umbelliferonun eşit dağılımını sağlamak için çözelti hazırlama sırasında kuvvetli girdaplama gereklidir.
5. Sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C sıcaklıklarda CD40-umbelliferone kompleksleri çözeltisinin absorpsiyonunu ölçmek için adım 3.2-3.3'teki işlemleri tekrarlayın.
   NOT: Bu adımlar, umbelliferona optimal CD40 protein bağlanma konsantrasyonunu belirlemeyi amaçlayan CD40 proteini ve CD40-umbelliferone komplekslerinin Tm değerlerini belirlemek için gerçekleştirilmiştir.

Sonuçlar

Turuncu boya, hem oda sıcaklığında hem de yüksek sıcaklıklarda E_x = 470 nm ve E_m = 570 nm'de sürekli olarak kararlı floresan uyarımı sergiledi. 1:500'lük bir optimal seyreltme oranı belirlenmiştir (Şekil 2A,B). CD40 proteininin konsantrasyonu 15 μg/mL'nin altında olduğunda Tm değerinin saptanması zor olmuştur (Şekil 3A,B). Bununla birlikte, 15 μg/mL'lik bir konsantrasyonda, CD40 protein konsantrasyonundak...

Tartışmalar

Termal kayma tahlili veya termal floresan tahlili olarak da bilinen DSF, yavaş, programlanmış bir sıcaklık artışı sırasında test numunesinin veya boyanın floresan sinyalindeki değişiklikleri izleyerek numunelerdeki proteinlerin termal denatürasyon sürecini tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. Başlangıçta Pantoliano¹⁴ tarafından kurulan DSF, yüksek verimli bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Ana prosedür, bilgisayar kontrollü ısıtılmış bir plaka üzerindeki s?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854