Детектирование взаимодействия белка CD40 с умбеллифероном с помощью дифференциальной сканирующей флуоресценции

Резюме

Этот протокол описывает уникальный метод обнаружения связи между соединениями и молекулами белка, обеспечивающий преимущества минимальной потери образца белка и высокой точности данных.

Аннотация

Исследование взаимодействий между различными молекулами является важнейшим аспектом понимания патогенеза заболевания и скрининга мишеней для лекарств. Умбеллиферон, активный ингредиент тибетской медицины Vicatia thibetica, проявляет иммуномодулирующее действие с неизвестным механизмом. Белок CD40 является ключевой мишенью в иммунном ответе. Таким образом, в данном исследовании используется принцип технологии дифференциальной сканирующей флуоресценции для анализа взаимодействий между белком CD40 и умбеллифероном с использованием флуоресцентных ферментных маркеров. Первоначально экспериментально была проверена стабильность белка флуоресцентного оранжевого красителя, и определен оптимальный коэффициент разбавления 1:500. Впоследствии было замечено, что значение температуры плавления (Tm) белка CD40 имеет тенденцию к снижению с увеличением концентрации. Интересно, что взаимодействие между белком CD40 и умбеллифероном повышает термическую стабильность белка CD40. Это исследование представляет собой первую попытку обнаружить связывающий потенциал низкомолекулярных соединений и белков с помощью флуоресцентных микропланшетов и флуоресцентных красителей. Метод характеризуется высокой чувствительностью и точностью, обещая достижения в области стабильности белка, структуры белка и белок-лигандных взаимодействий, что облегчает дальнейшие исследования и разведку.

Введение

Vicatia thibetica H. Boissieu, растение из семейства зонтичных, широко используется в тибетской медицине и представляет собой один из основных компонентов пяти основных ингредиентов (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., и Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. В основном распространен на юго-западе Китая, таких как северо-запад Юньнани, западная Сычуань, Тибет и другие районы, его высушенный корень служит местным заменителем дягиля¹. Корень, известный своим ароматом, часто используется в качестве приправы к тушеному мясу, а листья, называемые тибетским сельдереем, способствуют приготовлению восхитительных блюд. Таким образом, Vicatia thibetica имеет значение не только как уникальное лекарственное растение, но и как источник пищи в Тибете.

Как отечественные, так и международные исследования показывают, что Vicatia thibetica обладает восстанавливающими кровь и тонизирующими свойствами ци (силы или энергии), полезными для регулирования менструации. Он используется для устранения симптомов нерегулярной менструальной дисменореи, вызванной сердцебиением и дефицитом крови, проявляя фармакологические эффекты, такие как антиоксидантная регуляция иммунитета организма². Спиртовой экстракт Vicatia thibetica продемонстрировал способность восстанавливать массу тела и индекс органов у мышей с ослабленным иммунитетом, индуцированный циклофосфамидом. Кроме того, он повышает активность супероксиддисмутазы в сыворотке крови и снижает содержание малонового диальдегида, что свидетельствует об улучшении антиоксидантной способности и балансирующем эффекте на перекисное окисление липидов ^2,3. Одновременно он увеличивает количество клеток крови и гемоглобина, что не только объективно отражает кроветворную функцию организма, но и играет важнейшую роль в иммунной системе ^2,3.

Умбеллиферон, характеризующийся игольчатыми кристаллами и горьковатым вкусом, обладает небольшой молекулярной массой, летуч и может перегоняться паром. Он легко сублимируется, имеет низкую растворимость в воде и высокую растворимость в органических веществах. Являясь одним из основных химических компонентов Vicatia thibetica, умбеллиферон проявляет иммуномодулирующее действие на клеточный иммунитет, гуморальный иммунитет и неспецифический иммунитет^{в моделях} иммуносупрессии с гидрокортизоном ^4,5.

Молекула клеточной поверхности CD40, член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, широко экспрессируется в иммунных клетках⁶. Его гомологичный лиганд, CD154, также известный как CD40L, представляет собой трансмембранный белок II типа, экспрессируемый активированными Т-лимфоцитами. Активация CD40 обладает способностью повышать экспрессию костимулирующих молекул на поверхности дендритных клеток (ДК) и моноцитов. Этот процесс способствует презентации антигена молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) и дополнительно активирует CD8+ Т-клетки⁷.

Макрофаги играют решающую роль в формировании и регуляции опухолевого микроокружения, а активация CD40 может усиливать ремоделирование опухолевого микроокружения макрофагами8. Активация сигнала CD40 существенно влияет на пролиферацию и активацию В-клеток. В-клетки при активации CD40 могут функционировать как эффективные антигенпрезентирующие клетки. Они представляют антигены, генерируют активность эффекторных Т-клеток и тем самым способствуют противоопухолевым эффектам⁹. Кроме того, активация CD40 в опухолевых клетках может индуцировать апоптоз и ингибировать рост опухоли¹⁰. CD40 в первую очередь преобразует сигналы, контролируя активность нерецепторных тирозинкиназ, включая Lyn, Fyn, Syk и другие. Кроме того, он обладает способностью стимулировать белки Bcl-xL, Cdk4 и Cdk6, активировать факторы транскрипции Rel/NF-kB и фосфорилировать CG-2 и PI3K¹⁰.

Метод дифференциальной сканирующей флуоресценции (DSF) широко используется для оценки влияния различных условий окружающей среды, таких как состав буфера, температура и низкомолекулярные лиганды, на термическую стабильность белковых структур. Обычно используемый краситель для DSF представляет собой оранжевый, экологически чувствительный, гидрофобный краситель. В нормальных условиях структура белка сворачивается, скрывая его гидрофобный сегмент внутри. По мере повышения температуры гидрофобная область белка становится более открытой, что приводит к постепенному разрушению естественной структуры белка. Краситель избирательно связывается с этой открытой частью белка, усиливая его флуоресценцию. Затем значения Tm рассчитываются путем мониторинга изменений в детектировании флуоресцентного сигнала¹¹. В определенной степени изменения значений Tm могут измерять сдвиги в стабильности белка из-за мутаций, изменений в буферах или связывания лигандов. Кроме того, это может указывать на структурные изменения в процессе сворачивания белка¹². Такой подход обеспечивает точные данные, широкий температурный диапазон, высокую чувствительность и минимальные потери пробы белка¹³.

В данном исследовании определение флуоресценции проводилось с использованием флуоресцентного микропланшетного ридера вместо флуоресцентного аппарата количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эта модификация позволяет обнаруживать DSF в лабораториях, где отсутствует флуоресцентный инструмент для количественной ПЦР, что делает метод менее сложным и сокращает количество этапов, необходимых для настройки прибора, тем самым упрощая экспериментальный процесс. Однако у такого подхода есть определенные недостатки. По мере того как сложность снижается, процедура становится более громоздкой. Необходимо ручное обнаружение флуоресценции при различных температурах, а автоматический и непрерывный сбор флуоресценции из системы не может быть достигнут. Таким образом, в этом исследовании использовался метод DSF для изучения взаимодействия между белком CD40 и умбеллифероном, что позволило получить новое представление о молекулярных механизмах тибетской медицины.

протокол

Раствор соединения, раствор белка и краситель вводили в раствор PBS. Впоследствии образцы подвергали постепенному нагреву с помощью цифровой нагревательной сухой ванны, а термическую стабильность белков оценивали путем измерения изменения интенсивности флуоресценции в сложной системе. Подробные шаги описаны ниже, а на рисунке 1 показан обзор протокола.

1. Приготовление раствора

1. Приготовьте 1 мМ раствор умбеллиферона, добавив 0,1 мг умбеллиферона к 616,75 мкл раствора ДМСО (см. Таблицу материалов).
2. Приготовьте раствор белка CD40 в концентрации 200 мкг/мл, добавив 0,1 мг CD40 в 500 мкл раствора ddH₂O (см. Таблицу материалов).
3. Приготовьте 500-кратный раствор оранжевого красителя, добавив 1 мкл 5000-кратного оранжевого красителя к 9 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте вышеуказанные операции на льду, а поскольку пипетка имеет минимальный диапазон 0,1 мкл, первоначально разбавьте оранжевый белок-краситель в 10 раз, чтобы облегчить последующее использование.

2. Тестирование производительности красителя

1. Добавьте 500-кратный оранжевый краситель в раствор PBS и разбавьте его до получения красителя: соотношения PBS 1:500, 1:1000, 1:2000 и 1:4000.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что конечная концентрация ДМСО не превышает 2% (v/v).
2. Включите люминесцентный считыватель микропланшетов и разогрейте его в течение 10 минут.
3. Откройте компьютер и программное обеспечение для сбора данных в последовательном порядке (см. Таблицу материалов).
4. Нажмите « Прибор», выберите соответствующую модель флуоресцентного микропланшета и нажмите «ОК» в программном обеспечении для сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока флуоресцентный микропланшет завершит предварительный нагрев и отобразит температуру на панели, прежде чем открывать программное обеспечение для сбора данных, чтобы обеспечить успешное соединение между прибором и программным обеспечением.
5. Нажмите « Настройки сбора » и выберите «Флуоресценция» в программном обеспечении для сбора данных.
6. Отредактируйте программу в интерфейсе Длины волн: Lm1 = 470 нм, 570 нм, а затем нажмите OK.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевый краситель может возбуждаться ультрафиолетовым светом на длине волны 300 нм или видимым светом на длине волны 470 нм, а излучение может быть измерено на длине волны 570 нм.
7. Добавьте различные концентрации оранжевого красителя (1:500, 1:1000, 1:2000 и 1:4000) и PBS в 96-луночные планшеты со скоростью 100 μл/лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растворите раствор в ДМСО перед добавлением его в PBS и тщательно окуните его в вихревую концентрацию при 2000 x g в процессе приготовления, чтобы обеспечить полное растворение из-за склонности красителя к выпадению в осадок.
8. Поместите 96-луночный планшет в каскад обнаружения прибора, нажмите кнопку « Прочесть » в программном обеспечении для сбора данных и измерьте флуоресценцию каждой концентрации красителя 13 раз при комнатной температуре с интервалом в 2 минуты каждый раз.
9. Нажимайте кнопку «Экспорт » после каждого определения, выберите «Экспорт в XML XLS TXT», выберите «Все пластины», затем выберите «Пластина в выходном формате» и, наконец, нажмите « ОК», чтобы сохранить данные в папке в формате «XLS» для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги помогают определить влияние непрерывного измерения на автофлуоресценцию оранжевого красителя при комнатной температуре и определить оптимальную концентрацию окрашивания.
10. Включите цифровой нагрев встряхивающей сухой бани, установите температуру нагрева 35 °C, а время нагрева 2 минуты.
11. Приготовьте оптимальное соотношение разбавления красителя в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл и поместите ее в сухую ванну с цифровым нагревом на 2 минуты.
12. Добавьте раствор PBS и раствор окрашивания, нагретый до 35 °C, в планшет на 96 лунок в объеме 100 μл на лунку.
13. Поместите 96-луночный планшет в ступень обнаружения прибора и нажмите кнопку « Чтение » в программном обеспечении для сбора данных.
14. Установите температуру нагрева на 40 °C и время нагрева на 2 минуты.
15. Направьте раствор красителя из 96-луночного планшета обратно в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и нагрейте его в приборе в течение 2 минут.
16. Повторите операции шагов 2.12-2.15 и шага 2.9, чтобы проверить абсорбцию раствора красителя при 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C и 95 °C соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги помогают определить стабильность автофлуоресценции оранжевого красителя при непрерывном нагревании при градиенте от 35 °C до 95 °C. Очень важно работать быстро, чтобы избежать резких перепадов температуры или добавления неправильной жидкости, которые могут привести к ошибкам эксперимента.

3. Определение температуры плавления (Tm) белка

1. Смешайте белок CD40 и оранжевый краситель с раствором PBS для достижения конечных концентраций 5 г/мл, 10 г/мл, 15 г/мл, 20 г/мл и 1:500 соответственно.
2. Повторите операции, описанные в шагах 2.2-2.6 и шагах 2.10-2.16, чтобы оценить абсорбцию раствора белка CD40 при температурах 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C и 95 °C соответственно.
3. Повторите шаг 2.9 для сохранения и анализа данных, а затем рассчитали значение Tm с помощью программного обеспечения для анализа данных (см. Таблицу материалов).
4. Добавьте белок CD40, умбеллиферон и оранжевый краситель в раствор PBS для получения конечных концентраций 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкМ и 1:500 соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Энергичное вихревое воздействие во время приготовления раствора необходимо для обеспечения равномерного распределения красителя, белка CD40 и зонмелиферона в PBS.
5. Повторите операции шагов 3.2-3.3 для измерения абсорбционной способности раствора комплексов CD40-umbelliferone при температурах 35 °С, 40 °С, 45 °С, 50 °С, 55 °С, 60 °С, 65 °С, 70 °С, 75 °С, 80 °С, 95 °С и 95 °С соответственно.
   Примечание: Эти этапы были проведены для определения значений Tm белка CD40 и комплексов CD40-умбеллиферона с целью определения оптимальной концентрации связывания белка CD40 с умбеллифероном.

Результаты

Оранжевый краситель стабильно проявлял стабильное возбуждение флуоресценции при E_x = 470 нм и E_m = 570 нм, как при комнатной, так и при повышенных температурах. Был определен оптимальный коэффициент разрежения 1:500 (рис. 2А, В). Определение значения Tm оказалось сложной ?...

Обсуждение

DSF, также известный как анализ теплового сдвига или термический флуоресцентный анализ, представляет собой метод, используемый для обнаружения процесса термической денатурации белков в образцах путем мониторинга изменений сигнала флуоресценции испытуемого образца или красителя во в?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854