Détection de l’interaction protéine-ombellifère CD40 par fluorescence différentielle

Résumé

Ce protocole décrit une méthode unique de détection de la liaison entre les composés et les molécules de protéines, offrant les avantages d’une perte minimale d’échantillons de protéines et d’une grande précision des données.

Résumé

L’étude des interactions entre différentes molécules est un aspect crucial de la compréhension de la pathogenèse des maladies et du dépistage de cibles médicamenteuses. L’ombelliférone, un ingrédient actif de la médecine tibétaine Vicatia thibetica, présente un effet immunomodulateur avec un mécanisme inconnu. La protéine CD40 est une cible clé de la réponse immunitaire. Par conséquent, cette étude utilise le principe de la technologie de fluorescence à balayage différentiel pour analyser les interactions entre la protéine CD40 et l’ombelliférone à l’aide de marqueurs enzymatiques fluorescents. Initialement, la stabilité de la protéine orange fluorescent a été vérifiée expérimentalement et le rapport de dilution optimal de 1:500 a été déterminé. Par la suite, il a été observé que la valeur de fusion à la température (Tm) de la protéine CD40 avait tendance à diminuer avec une augmentation de la concentration. Il est intéressant de noter que l’interaction entre la protéine CD40 et l’ombelliférone améliore la stabilité thermique de la protéine CD40. Cette étude représente la première tentative de détection du potentiel de liaison de composés et de protéines à petites molécules à l’aide de microplaques de fluorescence et de colorants fluorescents. La technique se caractérise par une sensibilité et une précision élevées, ce qui promet des avancées dans les domaines de la stabilité des protéines, de la structure des protéines et des interactions protéine-ligand, facilitant ainsi la poursuite de la recherche et de l’exploration.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, plante de la famille des ombellifères, est couramment utilisée en médecine tibétaine et représente l’un des composants essentiels des cinq ingrédients de base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., et Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Principalement distribuée dans le sud-ouest de la Chine, comme le nord-ouest du Yunnan, l’ouest du Sichuan, le Tibet et d’autres régions, sa racine séchée sert de substitut local à l’angélique¹. La racine, connue pour son parfum, est souvent utilisée comme assaisonnement pour ragoût, et les feuilles, appelées céleri tibétain, contribuent à des plats délicieux. Ainsi, Vicatia thibetica a une importance non seulement en tant que plante médicinale unique, mais aussi en tant que source de nourriture au Tibet.

Des recherches nationales et internationales indiquent que Vicatia thibetica possède des propriétés de reconstitution du sang et de revigoration du qi (puissance ou énergie), bénéfiques pour réguler les menstruations. Il est utilisé pour traiter les symptômes de la dysménorrhée menstruelle irrégulière causée par des palpitations et une carence sanguine, présentant des effets pharmacologiques tels que la régulation antioxydante de l’immunité corporelle². L’extrait alcoolique de Vicatia thibetica a démontré sa capacité à restaurer la masse corporelle et l’indice d’organe chez des souris immunodéprimées induites par le cyclophosphamide. De plus, il augmente l’activité de la superoxyde dismutase dans le sérum et réduit la teneur en malondialdéhyde, suggérant une amélioration de la capacité antioxydante et un effet équilibrant sur la peroxydation lipidique ^2,3. Simultanément, il augmente le nombre de cellules sanguines et l’hémoglobine, ce qui reflète non seulement objectivement la fonction hématopoïétique de l’organisme, mais joue également un rôle crucial dans le système immunitaire ^2,3.

L’ombellifère, caractérisée par des cristaux aciculaires et un goût amer, possède un faible poids moléculaire, est volatile et peut être distillée à la vapeur. Il se sublime facilement, a une faible solubilité dans l’eau et une solubilité élevée dans la matière organique. En tant que l’un des principaux composants chimiques de Vicatia thibetica, l’ombelliférone présente des effets immunomodulateurs sur l’immunité cellulaire, l’immunité humorale et l’immunité non spécifique dans les modèles murins d’immunosuppression induite par l’hydrocortisone ^4,5.

La molécule de surface cellulaire CD40, membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale, est largement exprimée dans les cellules immunitaires⁶. Son ligand homologue, CD154, également connu sous le nom de CD40L, est une protéine transmembranaire de type II exprimée par les lymphocytes T activés. L’activation de CD40 a la capacité de réguler à la hausse l’expression des molécules co-stimulatrices à la surface des cellules dendritiques (DC) et des monocytes. Ce processus favorise la fonction de présentation de l’antigène des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et active davantage les lymphocytes T CD8+⁷.

Les macrophages jouent un rôle crucial dans la formation et la régulation du microenvironnement tumoral, et l’activation de CD40 peut améliorer le remodelage du microenvironnement tumoral par les macrophages⁸. L’activation du signal CD40 influence significativement la prolifération et l’activation des lymphocytes B. Les lymphocytes B, lorsqu’ils sont activés par CD40, peuvent fonctionner comme des cellules présentatrices d’antigènes efficaces. Ils présentent des antigènes, génèrent une activité des lymphocytes T effecteurs et contribuent ainsi aux effets antitumoraux⁹. De plus, l’activation de CD40 dans les cellules tumorales peut induire l’apoptose et inhiber la croissance tumorale¹⁰. CD40 transduit principalement les signaux en contrôlant l’activité des protéines kinases tyrosine non réceptrices, notamment Lyn, Fyn, Syk et autres. De plus, il a la capacité de stimuler les protéines Bcl-xL, Cdk4 et Cdk6, d’activer les facteurs de transcription Rel/NF-kB et de phosphoryler CG-2 et PI3K¹⁰.

La méthode de fluorescence différentielle à balayage (DSF) est largement utilisée pour évaluer l’impact de diverses conditions environnementales, telles que la composition du tampon, la température et les ligands de petites molécules, sur la stabilité thermique des structures protéiques. Le colorant couramment utilisé pour le DSF est un colorant hydrophobe orange, sensible à l’environnement. Dans des conditions normales, la structure de la protéine est repliée, dissimulant son segment hydrophobe à l’intérieur. À mesure que la température augmente, la région hydrophobe de la protéine devient plus exposée, ce qui entraîne une dégradation progressive de la structure naturelle de la protéine. Le colorant se lie sélectivement à cette partie protéique exposée, amplifiant ainsi sa fluorescence. Les valeurs Tm sont ensuite calculées en surveillant les modifications de la détection du signal de fluorescence¹¹. Dans une certaine mesure, les variations des valeurs Tm peuvent évaluer les changements dans la stabilité des protéines dus à des mutations, des changements dans les tampons ou la liaison aux ligands. De plus, il peut indiquer des altérations structurelles au cours du processus de repliement des protéines¹². Cette approche offre des données précises, une large plage de températures, une sensibilité élevée et une perte minimale d’échantillons de protéines¹³.

Dans cette étude, la détermination de la fluorescence a été effectuée à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescentes au lieu d’un appareil d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en fluorescence. Cette modification permet la détection de la DSF dans les laboratoires dépourvus d’un instrument de PCR quantitative fluorescente, ce qui rend la méthode moins complexe et réduit les étapes nécessaires à la configuration de l’instrument, simplifiant ainsi le processus expérimental. Cependant, cette approche présente certains inconvénients. Au fur et à mesure que la complexité est réduite, la procédure devient plus lourde. La détection manuelle de la fluorescence à différentes températures est nécessaire, et la collecte automatique et continue de la fluorescence du système ne peut pas être réalisée. Ainsi, cette étude a utilisé la technique DSF pour explorer l’interaction entre la protéine CD40 et l’ombellifère, fournissant ainsi de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires de la médecine tibétaine.

Protocole

La solution composée, la solution protéique et le colorant ont été introduits dans une solution PBS. Par la suite, les échantillons ont subi un chauffage progressif à l’aide d’un bain sec numérique secouant un chauffage, et la stabilité thermique des protéines a été évaluée en mesurant la variation de l’intensité de la fluorescence au sein du système complexe. Les étapes détaillées sont décrites ci-dessous, et la figure 1 illustre une vue d’ensemble du protocole.

1. Préparation de la solution

1. Préparez une solution d’ombellifère de 1 mM en ajoutant 0,1 mg d’ombelliférone à 616,75 μL de solution de DMSO (voir le tableau des matières).
2. Préparez une solution de protéine CD40 de 200 μg/mL en ajoutant 0,1 mg de CD40 à 500 μL de solution de ddH₂O (voir le tableau des matières).
3. Préparez une solution de colorant orange 500x en ajoutant 1 μL de colorant orange 5000x à 9 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Effectuez les opérations ci-dessus sur de la glace et, comme la pipette a une plage minimale de 0,1 μL, diluez d’abord le colorant protéique orange d’un facteur 10 pour faciliter l’utilisation ultérieure.

2. Tests de performance des colorants

1. Ajoutez le colorant orange 500x à une solution PBS et diluez-le pour obtenir des rapports colorant : PBS de 1:500, 1:1000, 1:2000 et 1:4000.
   REMARQUE : S’assurer que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 2 % (v/v).
2. Allumez le lecteur de microplaques fluorescent et préchauffez-le pendant 10 min.
3. Ouvrez l’ordinateur et le logiciel d’acquisition de données dans l’ordre (voir Tableau des matériaux).
4. Cliquez sur Instrument, choisissez le modèle de microplaque de fluorescence correspondant et sélectionnez OK dans le logiciel d’acquisition de données.
   REMARQUE : Attendez que la microplaque de fluorescence ait fini de préchauffer et d’afficher la température sur le panneau avant d’ouvrir le logiciel d’acquisition de données pour assurer une connexion réussie entre l’instrument et le logiciel.
5. Cliquez sur Paramètres d’acquisition et sélectionnez Fluorescence dans le logiciel d’acquisition de données.
6. Modifiez le programme dans l’interface Longueurs d’onde : Lm1 = 470 nm, 570 nm, puis sélectionnez OK.
   REMARQUE : Le colorant orange peut être excité avec de la lumière UV à 300 nm ou de la lumière visible à 470 nm, et l’émission peut être mesurée à 570 nm.
7. Ajouter différentes concentrations de colorant orange (1:500, 1:1000, 1:2000 et 1:4000) et de PBS à des plaques de 96 puits à 100 μL/puits.
   REMARQUE : Dissoudre la solution dans du DMSO avant de l’ajouter au PBS, et tourbillonnez-la à 2000 x g pendant le processus de préparation pour assurer une dissolution complète en raison de la tendance du colorant à précipiter.
8. Placez la plaque à 96 puits dans la platine de détection de l’instrument, cliquez sur le bouton Lire dans le logiciel d’acquisition de données et mesurez la fluorescence de chaque concentration de colorant 13 fois à température ambiante, avec un intervalle de 2 minutes à chaque fois.
9. Cliquez sur le bouton Exporter après chaque détermination, sélectionnez Exporter au format XML XLS TXT, choisissez Toutes les plaques, puis sélectionnez Plaque au format de sortie, et enfin cliquez sur OK pour enregistrer les données dans un dossier au format « XLS » pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : Ces étapes permettent de déterminer l’impact de la mesure continue sur l’autofluorescence du colorant orange à température ambiante et d’identifier la concentration optimale de coloration.
10. Allumez le chauffage numérique en secouant le bain sec, réglez la température de chauffage sur 35 °C et le temps de chauffage sur 2 min.
11. Préparez le taux de dilution optimal du colorant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et placez-le dans le bain sec de chauffage numérique en secouant pendant 2 min.
12. Ajouter la solution de PBS et la solution de coloration, chauffées à 35 °C, dans la plaque de 96 puits à un volume de 100 μL par puits.
13. Placez la plaque à 96 puits dans la platine de détection de l’instrument et cliquez sur le bouton Lire dans le logiciel d’acquisition de données.
14. Réglez la température de chauffage sur 40 °C et le temps de chauffage sur 2 min.
15. Pipeter la solution de colorant dans la plaque à 96 puits dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL et la chauffer dans l’instrument pendant 2 min.
16. Répéter les opérations des étapes 2.12 à 2.15 et de l’étape 2.9 pour tester l’absorbance de la solution de colorant à 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C et 95 °C, respectivement.
    REMARQUE : Ces étapes permettent de déterminer la stabilité de l’autofluorescence du colorant orange sous chauffage continu dans un gradient de 35 °C à 95 °C. Il est crucial de travailler rapidement pour éviter les chutes de température rapides ou l’ajout d’un mauvais liquide, ce qui pourrait entraîner des erreurs expérimentales.

3. Détection de la température de fusion (Tm) de la protéine

1. Combiner la protéine CD40 et le colorant orange avec une solution de PBS pour obtenir des concentrations finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL et 1:500, respectivement.
2. Répéter les opérations décrites aux étapes 2.2 à 2.6 et aux étapes 2.10 à 2.16 pour évaluer l’absorbance de la solution de protéine CD40 à des températures de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C et 95 °C, respectivement.
3. Réitérez l’étape 2.9 pour enregistrer et analyser les données, puis calculer la valeur Tm à l’aide d’un logiciel d’analyse de données (voir Tableau des matériaux).
4. Ajouter la protéine CD40, l’ombelliférone et le colorant orange à la solution de PBS pour obtenir des concentrations finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM et 1:500, respectivement.
   REMARQUE : Un vortex vigoureux pendant la préparation de la solution est essentiel pour assurer une distribution uniforme du colorant, de la protéine CD40 et de l’ombellifère dans le PBS.
5. Répéter les opérations des étapes 3.2 et 3.3 pour mesurer l’absorbance de la solution de complexes CD40-ombelliférones à des températures de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C et 95 °C, respectivement.
   REMARQUE : Ces étapes ont été menées pour déterminer les valeurs Tm de la protéine CD40 et des complexes CD40-ombelliférone, dans le but d’identifier la concentration optimale de liaison de la protéine CD40 à l’ombellifère.

Résultats

Le colorant orange a toujours montré une excitation de fluorescence stable à E_x = 470 nm et E_m = 570 nm, à la fois à température ambiante et à des températures élevées. Un taux de dilution optimal de 1:500 a été déterminé (figures 2A, B). La détection de la valeur Tm s’est avérée difficile lorsque la concentration de protéine CD40 était inférieure à 15 μg/mL (figures 3A,B). Cependant, à une concentration...

Discussion

Le DSF, également connu sous le nom de test de décalage thermique ou test de fluorescence thermique, est une technique utilisée pour détecter le processus de dénaturation thermique des protéines dans les échantillons en surveillant les changements dans le signal de fluorescence de l’échantillon ou du colorant lors d’une augmentation lente et programmée de la température. Initialement établie par Pantoliano¹⁴, la DSF est une méthode à haut débit. La procédure principale consiste ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854