Détection de l’interaction protéine-ombellifère CD40 par fluorescence différentielle

Résumé

Ce protocole décrit une méthode unique de détection de la liaison entre les composés et les molécules de protéines, offrant les avantages d’une perte minimale d’échantillons de protéines et d’une grande précision des données.

Résumé

L’étude des interactions entre différentes molécules est un aspect crucial de la compréhension de la pathogenèse des maladies et du dépistage de cibles médicamenteuses. L’ombelliférone, un ingrédient actif de la médecine tibétaine Vicatia thibetica, présente un effet immunomodulateur avec un mécanisme inconnu. La protéine CD40 est une cible clé de la réponse immunitaire. Par conséquent, cette étude utilise le principe de la technologie de fluorescence à balayage différentiel pour analyser les interactions entre la protéine CD40 et l’ombelliférone à l’aide de marqueurs enzymatiques fluorescents. Initialement, la stabilité de la protéine orange fluorescent a été vérifiée expérimentalement et le rapport de dilution optimal de 1:500 a été déterminé. Par la suite, il a été observé que la valeur de fusion à la température (Tm) de la protéine CD40 avait tendance à diminuer avec une augmentation de la concentration. Il est intéressant de noter que l’interaction entre la protéine CD40 et l’ombelliférone améliore la stabilité thermique de la protéine CD40. Cette étude représente la première tentative de détection du potentiel de liaison de composés et de protéines à petites molécules à l’aide de microplaques de fluorescence et de colorants fluorescents. La technique se caractérise par une sensibilité et une précision élevées, ce qui promet des avancées dans les domaines de la stabilité des protéines, de la structure des protéines et des interactions protéine-ligand, facilitant ainsi la poursuite de la recherche et de l’exploration.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, plante de la famille des ombellifères, est couramment utilisée en médecine tibétaine et représente l’un des composants essentiels des cinq ingrédients de base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., et Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Principalement distribuée dans le sud-ouest de la Chine, comme le nord-ouest du Yunnan, l’ouest du Sichuan, le Tibet et d’autres régions, sa racine séchée sert de substitut local à l’angélique¹. La racin....

Protocole

La solution composée, la solution protéique et le colorant ont été introduits dans une solution PBS. Par la suite, les échantillons ont subi un chauffage progressif à l’aide d’un bain sec numérique secouant un chauffage, et la stabilité thermique des protéines a été évaluée en mesurant la variation de l’intensité de la fluorescence au sein du système complexe. Les étapes détaillées sont décrites ci-dessous, et la figure 1 illustre une vue d’ensemble du protocole.

1. Préparation de la solution

1. Préparez une solution d’ombellifère de 1 mM en ajoutant 0,1 mg d’ombelliférone à 616,75 μL de....

Discussion

Le DSF, également connu sous le nom de test de décalage thermique ou test de fluorescence thermique, est une technique utilisée pour détecter le processus de dénaturation thermique des protéines dans les échantillons en surveillant les changements dans le signal de fluorescence de l’échantillon ou du colorant lors d’une augmentation lente et programmée de la température. Initialement établie par Pantoliano¹⁴, la DSF est une méthode à haut débit. La procédure principale consiste .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854